專利名稱：通過紅細(xì)胞生成素(epo)天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制對epo相關(guān)疾病的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的實(shí)施方案包括調(diào)節(jié)EPO及相關(guān)分子的表達(dá)和/或功能的寡核苷酸。背景DNA-RNA和RNA-RNA雜交對包括DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯在內(nèi)的核酸功能的許多方面是重要的。雜交對檢測特定核酸或者改變其表達(dá)的各種技術(shù)也是重要的。反義核苷酸例如通過與靶RNA雜交而破壞基因表達(dá)，從而干擾RNA剪接、轉(zhuǎn)錄、翻譯和復(fù)制。反義DNA具有的額外特征是DNA-RNA雜合體作為核糖核酸酶H消化(大多數(shù)細(xì)胞類型中存在的活性) 的底物。反義分子可被遞送到細(xì)胞中，如寡脫氧核苷酸(ODN)的情況，或者它們可作為RNA 分子從內(nèi)源基因表達(dá)。FDA最近批準(zhǔn)了反義藥物VITRAVENE (用于治療巨細(xì)胞病毒視網(wǎng)膜炎)，反映出反義物具有治療效用。激素紅細(xì)胞生成素(EPO)介導(dǎo)的增強(qiáng)的紅細(xì)胞產(chǎn)生是人對低氧的公知適應(yīng)性應(yīng)答(Burm等(1996)Physiological Rev. 76，839-845)。通常由成人腎臟和胎兒肝臟產(chǎn)生的 EPO刺激骨髓中表達(dá)紅細(xì)胞前體的EPO受體(EpoR)的發(fā)育。EPO是由腎的腎間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的糖蛋白(46kDa)激素，其調(diào)節(jié)骨髓中紅細(xì)胞的產(chǎn)生。這些細(xì)胞對低動(dòng)脈氧濃度敏感，在氧少(低氧)時(shí)將釋放紅細(xì)胞生成素。紅細(xì)胞生成素刺激骨髓產(chǎn)生更多紅細(xì)胞，從而提高血液的載氧能力。EPO通過結(jié)合骨髓中紅細(xì)胞前體表面上的EpoR而發(fā)揮其作用。但是，已在除腎間質(zhì)細(xì)胞外的來自其他正常組織的細(xì)胞(包括腸細(xì)胞、滋養(yǎng)層和神經(jīng)元細(xì)胞)上觀察到EPO表達(dá)。血流中EPO的測量可表明骨髓障礙或腎疾病。紅細(xì)胞生成素的正常水平是 0-19mU/ml (毫單位/毫升)。水平升高可見于真性紅細(xì)胞增多癥，這是以脾腫大和骨髓產(chǎn)生紅細(xì)胞增多為特征的病癥。低于正常值見于引起貧血的慢性腎衰竭。慢性腎衰竭在某種程度上導(dǎo)致貧血，因?yàn)橹饾u缺乏用于維持紅細(xì)胞生成的足夠EPO產(chǎn)生。低氧是實(shí)體瘤的主要特征，實(shí)體瘤占全部人類癌癥的大約90%。實(shí)體瘤中低氧的適應(yīng)性應(yīng)答與侵占性增強(qiáng)、腫瘤細(xì)胞死亡減少和腫瘤對放射療法和化學(xué)療法的反應(yīng)降低有關(guān)。已在不同的造血和非造血惡性腫瘤中觀察到EPO表達(dá)，且已表明其介導(dǎo)表達(dá)EpoR的紅細(xì)胞白血病細(xì)胞的自主生長。許多常見人類癌癥過表達(dá)低氧誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子HIF-1，其調(diào)節(jié)EPO以及增強(qiáng)癌細(xì)胞低氧存活所需的若干基因的表達(dá)，這些基因包括編碼糖酵解酶、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和血管內(nèi)皮生長因子的基因(Semenza(1999)Ann. Rev. Cell. Dev. Biol. 15,551-578)。腫瘤低氧被認(rèn)為是腫瘤對化學(xué)療法和放射療法的抗性中的主要因素，但其潛在機(jī)制未知。低氧主要通過激活受低氧誘導(dǎo)因子-1 (HIF-I)調(diào)節(jié)的若干基因的表達(dá)而在細(xì)胞中誘導(dǎo)適應(yīng)性應(yīng)答， HIF-I是由HIF-I α和HIF-I β亞基組成的異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子。概述該概述被提供用于介紹本發(fā)明的概要，以簡要說明本發(fā)明的性質(zhì)和實(shí)質(zhì)。它被提出的條件是，它不用來解釋或限制權(quán)利要求的范圍或含義。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于抑制天然反義轉(zhuǎn)錄物的作用的方法，其通過利用靶向天然反義轉(zhuǎn)錄物的任何區(qū)域的反義寡核苷酸導(dǎo)致上調(diào)相應(yīng)有義基因來進(jìn)行。本文還預(yù)期，天然反義轉(zhuǎn)錄物的抑制可通過被認(rèn)為落入本發(fā)明范圍內(nèi)的siRNA、核酶和小分子來完成。一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中EPO多核苷酸或其它基因產(chǎn)物的功能和/或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5-30個(gè)核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與包含SEQ ID N0:2(圖3)的第1_156個(gè)核苷酸中的5-30個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性，從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中EPO多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向EPO多核苷酸的天然反義序列(例如SEQ ID N0:2所示的核苷酸)及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID NO 3-5(圖4)所示。另一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中EPO多核苷酸的功能和/ 或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5-30個(gè)核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與EPO多核苷酸的反義序列的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中EPO多核苷酸的功能和/或表達(dá)。另一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中EPO多核苷酸的功能和/ 或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與EPO反義多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中EPO多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，組合物包含一種或多種與有義和/或反義EPO多核苷酸結(jié)合的反義寡核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包含一種或多種修飾或取代核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包含一種或多種修飾鍵。在又一個(gè)實(shí)施方案中，修飾核苷酸包括含硫代磷酸酯、甲基膦酸酯的修飾堿基，肽核酸，2’-0_甲基、氟或碳、亞甲基或其它鎖定核酸(LNA)分子。優(yōu)選地，修飾核苷酸是鎖定核酸分子，包括α-L-LNA。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將寡核苷酸皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)或腹腔內(nèi)給予患者。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將寡核苷酸在藥物組合物中給予。治療方案包括將反義化合物給予患者至少一次，但是，該治療可變更為在一段時(shí)間內(nèi)包括多個(gè)劑量。該治療可與一種或多種其它類型的治療聯(lián)合。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，將寡核苷酸包封入脂質(zhì)體中或連到載體分子(例如膽固醇、TAT肽)上。另一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5-30個(gè)核苷酸的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素 (EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。另一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與靶向紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反義寡核苷酸區(qū)域的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，相對對照體內(nèi)或體外提高紅細(xì)胞生成素(EPO)的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種反義寡核苷酸靶向紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反義序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種反義寡核苷酸靶向包含紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的編碼和/或非編碼核酸序列的核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種反義寡核苷酸靶向紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種反義寡核苷酸包含選自以下的一種或多種修飾至少一種修飾糖部分、至少一種修飾核苷間鍵、至少一種修飾核苷酸及其組合。在相關(guān)實(shí)施方案中，一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾糖部分 2' -0-甲氧乙基修飾糖部分、2'-甲氧基修飾糖部分、2' -0-烷基修飾糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾核苷間鍵硫代磷酸酯、2' -0-甲氧乙基(MOE)、2'-氟、烷基膦酸酯(alkylphosphonate)、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯(alkylphosphonothioate)、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、 磷酸三酯、氨基乙酸酯(acetamidate)、羧甲基酯及其組合。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾核苷酸肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、類似物、衍生物及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種寡核苷酸包含至少一種SEQ ID NO :3_5所示的寡核苷酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO) 基因的功能和/或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與長度為5-30個(gè)核苷酸的至少一種短干擾RNA(SiRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種siRNA寡核苷酸對紅細(xì)胞生成素(EPO) 多核苷酸的反義多核苷酸特異，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與紅細(xì)胞生成素(EPO) 多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；和，體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)基因的表達(dá)和/或功能。在實(shí)施方案中，所述寡核苷酸與至少約五個(gè)連續(xù)核酸的序列具有至少80%的序列同一性，所述序列與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子互補(bǔ)。另一個(gè)實(shí)施方案提供體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)基因的表達(dá)和/或功能的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與長度為約5-30個(gè)核苷酸、對編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)分子的多核苷酸有義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中至少一種反義寡核苷酸與至少一種SEQ ID N0:1和 2所示核酸序列具有至少50%的序列同一性；和，體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)基因的表達(dá)和/或功能。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案提供合成修飾寡核苷酸，其包含至少一種修飾，其中至少一種修飾選自至少修飾糖部分、至少一種修飾核苷酸間鍵、至少一種修飾核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸是與紅細(xì)胞生成素(EPO)基因雜交并相比正常對照體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能的反義化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一種修飾包括選自以下的至少一種核苷酸間鍵硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵。在相關(guān)實(shí)施方案中，所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵骨架。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含選自以下的至少一種修飾核苷酸肽核酸、鎖定核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含選自以下的修飾糖部分2' -0-甲氧乙基修飾糖部分、2'-甲氧基修飾糖部分、2' -0-烷基修飾糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸長度為至少約5-30個(gè)核苷酸，并與紅細(xì)胞生成素 (EPO)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述反義化合物與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少20%的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約80%的序列同一性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸雜交并相比正常對照體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能。在相關(guān)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :3_5所示序列之一。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案提供一種組合物，其包含對一種或多種紅細(xì)胞生成素(EPO) 多核苷酸特異的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補(bǔ)序列、等位基因、 同源物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。在相關(guān)實(shí)施方案中，寡核苷酸與SEQ ID NO :3-5所示核苷酸序列中的任一種相比具有至少約40%的序列同一性。在某實(shí)施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :3-5所示核苷酸序列中的任一種。在一個(gè)實(shí)施方案中，SEQ ID NO :3_5所示寡核苷酸包含一種或多種修飾或核苷酸取代。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一種或多種修飾或核苷酸取代選自硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子及其組合。本發(fā)明實(shí)施方案提供預(yù)防或治療與至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸和/或其至少一種編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病或病癥的方法，其包括將治療有效劑量的至少一種反義寡核苷酸給予患者，所述至少一種反義寡核苷酸結(jié)合所述至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反義序列，并調(diào)節(jié)所述至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的表達(dá)；從而預(yù)防或治療與至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸和/或其至少一種編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病或病癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，與至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸相關(guān)的疾病或病癥選自血液異常的疾病、病癥或狀態(tài)，以紅細(xì)胞產(chǎn)生少或缺陷為特征的血液障礙，貧血癥， 鐮狀細(xì)胞貧血，β -地中海貧血，紅細(xì)胞生成異常，妊娠障礙或月經(jīng)紊亂，早期早產(chǎn)兒貧血 (early anemia of prematurity)，腎機(jī)能不全，慢性腎衰竭，高血壓，手術(shù)相關(guān)疾病或病癥， 兒科患者透析疾病或病癥，血細(xì)胞比容水平不足相關(guān)疾病或狀況，AIDS，化學(xué)療法治療相關(guān)障礙，囊性纖維化，癌癥或腫瘤，傳染病，性病，免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病或病癥， 心血管疾病例如中風(fēng)、低血壓、心搏停止，缺血特別是缺血-再灌注損傷，心肌梗死例如急性心肌梗死，慢性心力衰竭，心絞痛，心臟肥大，心肺疾病，心肺分流(heart-lung bypass)， 呼吸道疾病，腎、泌尿/生殖疾病，內(nèi)分泌/新陳代謝異常，胃腸疾病，主要具有神經(jīng)病學(xué)或精神病學(xué)癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNQ或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病，認(rèn)知功能的年齡相關(guān)喪失，大腦性麻痹，神經(jīng)變性疾病，阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，利氏病(Leigh’ s disease)，癡呆， 記憶喪失，肌萎縮性側(cè)索硬化，酒精中毒，心境障礙，焦慮障礙，注意力缺陷障礙，過興奮，孤獨(dú)癥，精神分裂癥，抑郁癥，腦或脊髓創(chuàng)傷或缺血，克-雅病(Creutzfeld-Jakob disease)， 眼病，癲癇障礙(seizure disorder)，多發(fā)性硬化，炎癥，輻射損傷，黃斑變性，糖尿病性神經(jīng)病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，青光眼，視網(wǎng)膜缺血，和視網(wǎng)膜創(chuàng)傷，脊髓損傷，宇宙飛行狀態(tài)，急性失血狀態(tài)，老化和腫瘤疾病狀態(tài)。本發(fā)明實(shí)施方案提供鑒定和選擇用于體內(nèi)給藥的至少一種寡核苷酸的方法，其包括選擇與疾病狀態(tài)相關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包含至少五個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，所述寡核苷酸與選定的靶多核苷酸互補(bǔ)或相對其處于反義方向上；和在嚴(yán)格雜交條件下測量反義寡核苷酸和靶多核苷酸的雜合體的熱解鏈溫度；和基于所得信息選擇用于體內(nèi)給藥的至少一種寡核苷酸。下文說明其它方面。附圖簡述

圖1是實(shí)時(shí)PCR結(jié)果圖，其顯示在利用Lipofectamine 2000引入的硫代磷酸酯寡核苷酸治療H印G2細(xì)胞后相比對照的EPO mRNA倍數(shù)變化。實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對印oas設(shè)計(jì)的兩種siRNA處理的48小時(shí)后顯著提高了 HepG2細(xì)胞中EPO mRNA的水平 (印oas_l，P = 0. 02和印oas_2，P = 0. 04，圖1A)。在相同樣品中，在用針對epoas的siRNA 處理后可能降低了 epoas RNA的水平(圖1B)。標(biāo)記為印oas_l、印oas_2、印oas_3的條塊分別對應(yīng)于用SEQ ID NO :3、4和5處理的樣品。圖 2 顯示 SEQ ID NO 1 人紅細(xì)胞生成素(EPO) mRNA (NCBI 登記號NM_000799. 2) 和SEQ ID NO :1a顯示EPO的基因組序列(外顯子示以大寫字母，內(nèi)含子示以小寫)。圖 3 顯示 SEQ ID NO 2 天然反義序列 EP0_AS(NCBI 登記號AW798641. 1)。圖4顯示反義寡核苷酸SEQ ID NO :3_5?！皉”表示RNA0圖5顯示有義寡核苷酸SEQ ID NO 6-8?！皉”表示RNA。它們是SEQ ID NO 3-5的反向互補(bǔ)序列。圖 6 顯不由 Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay (Hs00171267_ ml)設(shè)計(jì)的自定義測定(Custom assay)的正向引物(SEQ ID NO :9)、反向引物(SEQ ID NO 10)和報(bào)道序歹Ij (SEQ ID NO :11)。詳細(xì)說明下文參照用于說明的實(shí)施例應(yīng)用來說明本發(fā)明的若干方面。應(yīng)當(dāng)理解，闡述的許多細(xì)節(jié)、關(guān)系和方法用于提供對本發(fā)明的全面理解。但是，相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將容易地認(rèn)識到可不利用一個(gè)或多個(gè)細(xì)節(jié)或利用其他方法來實(shí)施本發(fā)明。本發(fā)明不受行為或事件順序的限制，因?yàn)橐恍┬袨榭梢圆煌樞虬l(fā)生和/或與其他行為或事件同時(shí)發(fā)生。此外，并非所有闡述的行為或事件為實(shí)施本發(fā)明的方法所必需。本文公開的所有基因、基因名稱和基因產(chǎn)物意在對應(yīng)于來自本文公開組合物和方法適用的任何物種的同源物。因此，該術(shù)語包括但不限于人和小鼠的基因和基因產(chǎn)物。應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)公開特定物種的基因或基因產(chǎn)物時(shí)，該公開僅意為示例性的，而不應(yīng)被理解為限制，除非其出現(xiàn)的上下文明確指明。因此，例如對于本文公開的基因(在某些實(shí)施方案中涉及哺乳動(dòng)物核酸和氨基酸序列的基因)意在包括來自其它動(dòng)物的同源和/或種間同源基因和基因產(chǎn)物，所述其它動(dòng)物包括但不限于其它哺乳動(dòng)物、魚類、兩棲動(dòng)物類、爬行動(dòng)物類和鳥類。在優(yōu)選實(shí)施方案中，基因或核酸序列來自人。定義本文所用術(shù)語僅用于說明具體實(shí)施方案的目的，而非意在限制本發(fā)明。本文所用單數(shù)形式意在也包括復(fù)數(shù)形式，除非上下文明確地另外指明。此外，關(guān)于術(shù)語“包含”、“含有”、“具有”、“有”、“帶有”或其變體在詳細(xì)的說明書和/或權(quán)利要求中所使用的程度，這些術(shù)語意在以類似于術(shù)語“包括”的方式包括在內(nèi)。術(shù)語“約”或“大約”是指在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員測定的具體數(shù)值的可接受誤差范圍內(nèi)，其部分地取決于如何測量或測定該數(shù)值，即測量系統(tǒng)的限制。例如，按照本領(lǐng)域?qū)嵺`， “約”可指在1以上的標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)?；蛘?，“約”可指給定值的高達(dá)20%的范圍，優(yōu)選高達(dá)10%， 更優(yōu)選高達(dá)5%且還更優(yōu)選高達(dá)1%?；蛘?，具體涉及到生物系統(tǒng)或過程，該術(shù)語可指在數(shù)值的量級內(nèi)，優(yōu)選在5倍以內(nèi)，更優(yōu)選在2倍以內(nèi)。當(dāng)在本申請和權(quán)利要求中描述了具體數(shù)值時(shí)，除非另有說明，應(yīng)認(rèn)為術(shù)語“約”指在該具體數(shù)值的可接受誤差范圍內(nèi)。本文所用術(shù)語“mRNA”指目前已知的靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄物和可闡明的任何其它轉(zhuǎn)錄物?！胺戳x寡核苷酸”或“反義化合物”指與另外的RNA或DNA(靶RNA、DNA)結(jié)合的RNA 或DNA分子。例如，如果它是RNA寡核苷酸，則它通過RNA-RNA相互作用結(jié)合另外的RNA 靶標(biāo)，并改變靶 RNA 的活性(Eguchi 等，(1991) Ann. Rev. Biochem. 60，631-652)。反義寡核苷酸可上調(diào)或下調(diào)特定多核苷酸的表達(dá)和/或功能。該定義意在包括根據(jù)治療、診斷或其它觀點(diǎn)有用的任何外源RNA或DNA分子。這樣的分子例如包括反義RNA或DNA分子、干擾 RNA(RNAi)、微小 RNA、誘殺性 RNA 分子(decoy RNA molecule)、siRNA、酶 RNA、治療性編輯 RNA (therapeutic editing RNA)以及激動(dòng)RNA和拮抗RNA、反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGS)寡核苷酸、可變剪接體(alternate splicer)、引物、探針及其它與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。同樣地，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“寡核苷酸”涉及核糖核酸(RNA)或脫氧核糖核酸(DNA) 或其模擬物的寡聚體或多聚體。術(shù)語“寡核苷酸”還包括天然和/或修飾單體或鍵的線性或環(huán)狀寡聚體，所述天然和/或修飾單體或鍵包括脫氧核糖核苷、核糖核苷、其取代和α -異頭形式、肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、硫代磷酸酯、甲基膦酸酯等。寡核苷酸能夠通過
單體與單體相互作用的常規(guī)方式(例如Watson-Crick型堿基配對、Hodgsteen型或反向 HoSgsteen型堿基配對等)特異結(jié)合靶多核苷酸。寡核苷酸可以是“嵌合的”，即由不同區(qū)(region)組成。在本發(fā)明上下文中，“嵌合”化合物為包含兩個(gè)以上化學(xué)區(qū)(例如DNA區(qū)、RNA區(qū)、PNA區(qū)等)的寡核苷酸。每個(gè)化學(xué)區(qū)由至少一個(gè)單體單元(換言之，在寡核苷酸化合物情況下為核苷酸)組成。這些寡核苷酸一般包括至少一個(gè)區(qū)，其中寡核苷酸被修飾以表現(xiàn)一種或多種所需性質(zhì)。寡核苷酸的所需性質(zhì)包括但不限于，例如提高的核酸酶降解抗性、提高的細(xì)胞吸收和/或提高的靶核酸結(jié)合親和力。因此，寡核苷酸的不同區(qū)可具有不同性質(zhì)。本發(fā)明的嵌合寡核苷酸可形成為兩種以上上述寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸類似物的混合結(jié)構(gòu)。寡核苷酸可由區(qū)組成，區(qū)可以“登記簿(register) ”方式連接(即如同天然DNA中那樣單體連續(xù)連接時(shí))或通過間隔物連接。間隔物是用來在區(qū)之間構(gòu)成共價(jià)“橋”，在優(yōu)選情況下長度不超過約100個(gè)碳原子。間隔物可帶有不同功能，例如具有正電荷或負(fù)電荷、帶有特定的核酸結(jié)合性質(zhì)(嵌入劑、溝結(jié)合劑、毒素、熒光團(tuán)等)、是親脂性的、誘導(dǎo)特定二級結(jié)構(gòu)，例如產(chǎn)生α-螺旋的含丙氨酸的肽。本文所用“ΕΡ0”和“紅細(xì)胞生成素”包括所有家族成員、突變體、等位基因、片段、 種類(species)、編碼和非編碼序列、有義和反義多核苷酸鏈等。如本文所用，詞語紅細(xì)胞生成素、EPO和hEPO (人紅細(xì)胞生成素)在本申請中可互換使用。本文所用術(shù)語“對...特異的寡核苷酸”或“靶向...的寡核苷酸”是指具有下述序列的寡核苷酸該序列(i)能夠與靶基因的一部分形成穩(wěn)定復(fù)合體，或(ii)能夠與靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體。復(fù)合體和雙鏈體的穩(wěn)定性可通過理論計(jì)算和/ 或體外測定來確定。用于測定雜交復(fù)合體和雙鏈體穩(wěn)定性的示例性測定參見下文實(shí)施例。本文所用術(shù)語“靶核酸”包括DNA、轉(zhuǎn)錄自這種DNA的RNA (包括前mRNA和mRNA) 以及來源于這種RNA的cDNA、編碼序列、非編碼序列、有義或反義多核苷酸。寡聚化合物與其靶核酸的特異性雜交干擾該核酸的正常功能。這種由與靶核酸特異性雜交的化合物對靶核酸功能的調(diào)節(jié)通常稱為“反義”。被干擾的DNA功能例如包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。被干擾的RNA 功能包括所有生命機(jī)能，例如RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)、由RNA翻譯蛋白質(zhì)、剪接RNA產(chǎn)生一種或多種mRNA和RNA可能參與或促進(jìn)的催化活性。這種對靶核酸干擾的總體影響是調(diào)節(jié)編碼產(chǎn)物或寡核苷酸的表達(dá)。 RNA干擾“RNAi ”由與它們的“靶”核酸序列具有序列特異同源性的雙鏈 RNA(dsRNA)分子的介導(dǎo)(Caplen，N. J.等 Q001) Proc. Natl. Acad. ki. USA 98: 9742-9747)。在本發(fā)明某些實(shí)施方案中，介體是5_25個(gè)核苷酸的“小干擾”RNA雙鏈體 (siRNA)。siRNA來源于稱為切酶的 RNA酶對 dsRNA 的加工(Bernstein，E.等 U001)Nature409 =363-366)。siRNA雙鏈體產(chǎn)物被募集到稱為RISC(RNA誘導(dǎo)性沉默復(fù)合體)的多蛋白siRNA復(fù)合體中。在不希望受任何具體理論約束的情況下，認(rèn)為RISC被引導(dǎo)至靶核酸 (適宜地為mRNA)，在此處siRNA雙鏈體以序列特異性方式相互作用以介導(dǎo)催化方式的切割(Bernstein, Ε.等(2001)Nature 409 :363-366 ；Boutla, Α.等(2001)Curr. Biol. 11 1776-1780)?？梢罁?jù)本發(fā)明使用的小干擾RNA可依據(jù)本領(lǐng)域公知并為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的步驟合成和使用。用于本發(fā)明方法的小干擾RNA適宜地包含約1-約50個(gè)核苷酸 (nt)。在非限制性實(shí)施方案的實(shí)例中，siRNA可包含約5-約40個(gè)nt、約5-約30個(gè)nt、約 10-約30個(gè)nt、約15-約25個(gè)nt或約20-25個(gè)核苷酸。通過使用自動(dòng)比對核酸序列并指明同一性或同源性區(qū)的計(jì)算機(jī)程序，輔助選擇適當(dāng)?shù)墓押塑账?。這樣的程序用于比較例如通過檢索數(shù)據(jù)庫(例如GenBank)或通過對PCR 產(chǎn)物測序所得核酸序列。比較一系列物種的核酸序列使得能夠選擇在物種間表現(xiàn)適當(dāng)?shù)耐恍猿潭鹊暮怂嵝蛄?。在未測序基因的情況下，進(jìn)行DNA印跡以使得能夠測定靶物種和其他物種間基因的同一性程度。通過在不同嚴(yán)格程度下進(jìn)行DNA印跡，如本領(lǐng)域公知的，可獲得同一性的近似測量。這些步驟使得能夠選擇這樣的寡核苷酸其表現(xiàn)出與對照受試者的靶核酸序列的高度互補(bǔ)性，和與其它物種的對應(yīng)核酸序列的低度互補(bǔ)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，在選擇用于本發(fā)明的適當(dāng)基因區(qū)方面存在相當(dāng)大的自由?！懊?RNA，，是指帶有酶促活性的 RNA 分子(Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035)。酶核酸(核酶)通過首先結(jié)合靶RNA而作用。這種結(jié)合通過酶核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，該靶結(jié)合部分被保持與該分子的酶促部分十分靠近，該酶促部分起切割靶RNA的作用。因此，酶核酸首先識別并接著通過堿基配對結(jié)合靶RNA，一旦結(jié)合到正確位點(diǎn)，則酶促作用以切割靶RNA?！罢T殺性RNA”是指模擬配體的天然結(jié)合結(jié)構(gòu)域的RNA分子。因此，誘殺性RNA與天然結(jié)合靶標(biāo)競爭結(jié)合特定配體。例如，已表明，HIV反式激活應(yīng)答(TAR) RNA過表達(dá)可作為 “誘餌”，并有效結(jié)合HIV tat蛋白，從而防止其結(jié)合HIV RNA中編碼的TAR序列(Sullenger 等(1990)Cell，63，601-608)。這意指特定實(shí)例。本領(lǐng)域人員會認(rèn)識到，這僅是一個(gè)實(shí)例，利用本領(lǐng)域公知的技術(shù)可容易地產(chǎn)生其它實(shí)施方案。本文所用術(shù)語“單體”一般是指通過磷酸二酯鍵或其類似物連接以形成大小從幾個(gè)單體單元(例如約3-4個(gè))到約數(shù)百個(gè)單體單元的寡核苷酸的單體。磷酸二酯鍵類似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、氨基磷酸酯等，如下文更詳細(xì)說明。術(shù)語“核苷酸”包括天然存在核苷酸及非天然存在核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，許多先前被認(rèn)為“非天然存在”的核苷酸后來已在自然界中發(fā)現(xiàn)。因此，“核苷酸”不僅包括已知含有嘌呤和嘧啶雜環(huán)的分子，而且包括其雜環(huán)類似物和互變異構(gòu)體。其它類型核苷酸的說明性實(shí)例為含以下結(jié)構(gòu)的分子腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、 黃嘌呤、二氨基嘌呤、8-氧-N6-甲基腺嘌呤、7-脫氮黃嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N4，N4-亞乙基胞嘧啶、N6，N6-亞乙基-2，6- 二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、5- (C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假異胞嘧啶(pseudoisocytosine)、2_羥基-5-甲基_4_三唑并嘧啶、異胞嘧啶(isocytosine)、異鳥嘌呤(isoguanin)、肌苷以及Benner等，美國專利號5，432，272 中所述的“非天然存在”核苷酸。術(shù)語“核苷酸”意在包括這些實(shí)例及其類似物和互變異構(gòu)體的每一個(gè)和全部。尤其令人感興趣的核苷酸是含有腺嘌呤、鳥嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸，它們被認(rèn)為是與人的治療和診斷應(yīng)用有關(guān)的天然存在核苷酸。核苷酸包含天然2'-脫氧和2'-羥基糖(例如Kornberg和Baker，DNA R印lication，第二版 (Freeman, San Francisco, 1992)所述)以及它們的類似物。核苷酸的“類似物”包括具有修飾堿基部分和/或修飾糖部分的合成核苷酸(參見例如通常以下文獻(xiàn)所述Scheit，Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980 ； Freier 禾口 Altmann, (1997)Nucl. Acid. Res.，25(22)，4429-4443，Toulme, J. J.，(2001) Nature Biotechnology 19 :17-18 ；Manoharan Μ. , (1999)Biochemica et Biophysica Acta 1489 :117-139 ；Freier S.Μ·，(1997)Nucleic Acid Research,25 :4429-4443, UhIman, Ε. , (2000)Drug DiscoveiTfeDevelopmentjSiZOS-ZlSjHerdewin P. , (2000) Antisense&Nucleic Acid Drug Dev.，10 :297-310) ；2' _0、3:C連接的[3. 2. 0] 二環(huán)阿糖核苷(參見例如 N. K Christiensen.等，(1998) J. Am. Chem. Soc.，120 :5458-5463 ；Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem. 7 (7) :641-9 ；Cho EJ 等 U009) Annual Review of Analytical Chemistry，2，MH64)。這樣的類似物包括設(shè)計(jì)成增強(qiáng)結(jié)合性質(zhì)(例如雙鏈體或三鏈體穩(wěn)定性、特異性等)的合成核苷酸。本文所用術(shù)語“雜交”是指寡聚化合物的大致互補(bǔ)鏈的配對。配對機(jī)制之一涉及寡聚化合物鏈的互補(bǔ)核苷或核苷酸堿基(核苷酸)之間的氫鍵作用，例如Watson-Crick、 Hodgsteen或反向Hodgsteen型氫鍵作用。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是互補(bǔ)核苷酸，其通過形成氫鍵成對。雜交可在不同環(huán)境中發(fā)生。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能以產(chǎn)生功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件下(即在體內(nèi)測定或治療性治療情況中的生理?xiàng)l件和體外測定情況中進(jìn)行測定的條件下)該反義化合物非特異性結(jié)合非靶核酸序列時(shí)，反義化合物是“可特異性雜交的”。本文所用短語“嚴(yán)格雜交條件”或“嚴(yán)格條件，，是指在這樣的條件除了最低限度的其它序列外，本發(fā)明化合物在該條件下將與其靶序列雜交。嚴(yán)格條件是序列依賴性的且在不同環(huán)境中不同，在本發(fā)明上下文中，寡聚化合物與靶序列雜交的“嚴(yán)格條件”由寡聚化合物性質(zhì)和組成以及研究它們的測定確定。通常，嚴(yán)格雜交條件包括低濃度(<0. 15M)的含無機(jī)陽離子如Na++或K++的鹽(低離子強(qiáng)度)、高于20°C-25°C且低于寡聚化合物靶序列復(fù)合體Tm的溫度和存在變性劑，例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜或去污劑十二烷基硫酸鈉(SDS)。例如，對于每的甲酰胺，雜交率降低1. 1%。高度嚴(yán)格雜交條件的實(shí)例是0. IX氯化鈉-檸檬酸鈉緩沖液(SSC) /0. 1 % (w/v) SDS中在60°C下維持30分鐘。本文所用“互補(bǔ)的”是指在一條或兩條寡聚鏈上的兩個(gè)核苷酸之間精確配對的能力。例如，如果反義化合物某位置上的核堿基(nucleobase)能夠與靶核酸(所述靶核酸是 DNA、RNA或寡核苷酸分子)某位置上的核堿基發(fā)生氫鍵作用，那么認(rèn)為寡核苷酸和靶核酸之間的氫鍵作用位置是互補(bǔ)位置。當(dāng)每個(gè)分子中足夠數(shù)量的互補(bǔ)位置被可相互發(fā)生氫鍵作用的核苷酸占據(jù)時(shí)，寡聚化合物和其它DNA、RNA或寡核苷酸分子相互互補(bǔ)。因此，“可特異性雜交的”和“互補(bǔ)的”兩個(gè)術(shù)語用來表明在足夠數(shù)量的核苷酸內(nèi)足以使寡聚化合物和靶核酸之間發(fā)生穩(wěn)定的特異性結(jié)合的精確配對程度或互補(bǔ)性。本領(lǐng)域理解，寡聚化合物序列不需要與其可特異性雜交的靶核酸序列100%互補(bǔ)。此外，寡核苷酸可越過一個(gè)或多個(gè)區(qū)段雜交，使得間插或相鄰區(qū)段不參與雜交事件(例如環(huán)狀結(jié)構(gòu)、錯(cuò)配或發(fā)夾結(jié)構(gòu))。本發(fā)明寡聚化合物與它們靶向的靶核酸序列中的靶區(qū)具有至少約70%、或至少約75%、或至少約80%、或至少約85%、或至少約90%、或至少約95%、 或至少約99%的序列互補(bǔ)性。例如，反義化合物中18/20的核苷酸與靶區(qū)互補(bǔ)并因此特異性雜交，則該反義化合物表現(xiàn)90%的互補(bǔ)性。在該實(shí)例中，剩余的非互補(bǔ)核苷酸可成簇或散布在互補(bǔ)核苷酸之間，不必彼此鄰接或與互補(bǔ)核苷酸鄰接。同樣地，長度為18個(gè)核苷酸且具有在兩側(cè)為兩個(gè)與靶核酸具有完全互補(bǔ)性的區(qū)的4(四)個(gè)非互補(bǔ)核苷酸的反義化合物與靶核酸具有77. 8%的總體互補(bǔ)性，并因此落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。反義化合物與靶核酸的區(qū)的互補(bǔ)性百分比可利用本領(lǐng)域已知的BLAST程序(基礎(chǔ)局部比對檢索工具(basic local alignment search tools))和 PowerBLAST 程序按常規(guī)測定(Altschul 等，(1990) J. Mol. Biol.，215，403-410 ；Zhang 和 Madden，(1997) Genome Res.，7，649-656)。同源性、序列同一性或互補(bǔ)性百分比可通過例如Gap程序(Wisconsin Sequence Analysis Package, Unix版本第 8 版，Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis)使用默認(rèn)設(shè)置測定，該程序利用 Smith 和 Waterman 的算法(Adv. App 1. Math.，(1981) 2，482-489)。本文所用術(shù)語“熱解鏈溫度(Tm) ”是指這樣的溫度在規(guī)定的離子強(qiáng)度、PH和核酸濃度下，與靶序列互補(bǔ)的寡核苷酸有50%與靶序列雜交達(dá)到平衡的溫度。一般地，嚴(yán)格條件是指這樣的條件其中鹽濃度在PH 7. 0-8. 3下為至少約0. 01-1. OM Na離子濃度(或其它鹽)，溫度對于短寡核苷酸(例如10-50個(gè)核苷酸)為至少約30°C。嚴(yán)格條件也可以加入去穩(wěn)定劑例如甲酰胺的方式實(shí)現(xiàn)。本文所用“調(diào)節(jié)”是指提高(刺激)或降低(抑制)基因的表達(dá)。術(shù)語“變體”，當(dāng)在多核苷酸序列情況中使用時(shí)，可包括與野生型基因有關(guān)的多核苷酸序列。該定義也可包括例如“等位”變體、“剪接”變體、“物種”變體或“多態(tài)”變體。剪接變體可與參比分子具有顯著同一性，但通常由于mRNA加工過程中外顯子的可變剪接而具有更多或更少量的多核苷酸。相應(yīng)多肽可具有另外的功能域或不存在結(jié)構(gòu)域。物種變體是指物種間相互不同的多核苷酸序列。本發(fā)明特別利用了野生型基因產(chǎn)物的變體。變體可產(chǎn)生自核酸序列中的至少一個(gè)突變，并可導(dǎo)致產(chǎn)生改變的mRNA或其結(jié)構(gòu)或功能可能改變或可能不改變的多肽。任何給定的天然或重組基因可具有0、1或多個(gè)等位形式。產(chǎn)生變體的常見突變一般歸因于核苷酸的天然缺失、插入或取代。這些種類變化的每一種可在給定序列中單獨(dú)發(fā)生或與其它變化聯(lián)合發(fā)生一次或多次。所得多肽通常相互之間具有顯著的氨基酸同一性。多態(tài)變體是給定物種的個(gè)體之間特定基因的多核苷酸序列的變異。多態(tài)變體還可包括“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)或單個(gè)堿基突變，其中多核苷酸序列因一個(gè)堿基而不同。SNP的存在可表明例如某群體對疾病狀態(tài)的傾向，即易感性對耐受性。衍生多核苷酸包括經(jīng)過化學(xué)修飾的核酸，例如將氫置換為烷基、?；虬被Ｑ苌锢缪苌押塑账峥砂ǚ翘烊淮嬖诓糠?，例如改變的糖部分或糖間鍵。這其中的實(shí)例是硫代磷酸酯和本領(lǐng)域已知的其它含硫種類。衍生核酸還可包含標(biāo)簽，包括放射性核苷酸、 酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、顯色劑、底物、輔助因子、抑制劑、磁性顆粒等。“衍生”多肽或肽經(jīng)過修飾，例如通過糖基化、聚乙二醇化、磷酸化、硫酸化、還原/ 烷化、?；?、化學(xué)偶聯(lián)或溫和甲醛處理。衍生物也可被修飾，以含有可直接或間接檢測的標(biāo)簽，包括但不限于放射性同位素、熒光標(biāo)簽和酶標(biāo)簽。本文所用術(shù)語“動(dòng)物”或“患者”意在包括例如人、綿羊、麋鹿、鹿、長耳鹿、貂、哺乳動(dòng)物、猴子、馬、牛、豬、山羊、狗、貓、大鼠、小鼠、鳥類、雞、爬行動(dòng)物、魚類、昆蟲和蜘蛛類。“哺乳動(dòng)物”涵蓋一般處在醫(yī)療護(hù)理下的溫血哺乳動(dòng)物(例如人和馴化動(dòng)物)。實(shí)例包括貓、犬、馬、牛和人，以及僅人?！爸委煛焙w治療哺乳動(dòng)物的疾病狀態(tài)，包括(a)預(yù)防該疾病狀態(tài)在哺乳動(dòng)物中發(fā)生，尤其是在該哺乳動(dòng)物易感染該疾病狀態(tài)但尚未被確診為患有它時(shí)；(b)抑制該疾病狀態(tài)，例如抑制其進(jìn)展；和/或(c)減輕該疾病狀態(tài)，例如引起該疾病狀態(tài)消退直到達(dá)到所需終點(diǎn)。治療還包括改善疾病的癥狀(例如減少疼痛或不適)，其中這種改善可或不可直接影響該疾病(例如病因、傳播、表達(dá)等)。多核苷酸和寡核苷酸組合物和分子靶標(biāo)在一個(gè)實(shí)施方案中，靶標(biāo)包括紅細(xì)胞生成素(EPO)的核酸序列，其包括但不限于與EPO相關(guān)的有義和/或反義非編碼和/或編碼序列。紅細(xì)胞生成素(EPO)是作為激素的造血生長因子家族成員。EPO調(diào)節(jié)紅細(xì)胞產(chǎn)生 (紅細(xì)胞生成)并維持機(jī)體的紅細(xì)胞量至最佳水平。EPO產(chǎn)生受腎動(dòng)脈循環(huán)中氧含量減少刺激，并由對氧敏感的轉(zhuǎn)錄因子的介導(dǎo)。EPO主要由腎管周毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生。分泌的EPO結(jié)合骨髓紅細(xì)胞前體表面上的EPO受體，并引起它們的快速復(fù)制和成熟變?yōu)楣δ苄约t細(xì)胞。該刺激引起紅細(xì)胞數(shù)目的急劇增長和隨之發(fā)生的血細(xì)胞比容(血液中的紅細(xì)胞百分比)增加(D' Andrea 等(1989)Cell 57 :277-285 ；Lodish 等(1995)Cold Spring Harb Symp Quant Biol 60 :93-104)。紅細(xì)胞生成素刺激骨髓產(chǎn)生更多紅細(xì)胞。所導(dǎo)致的紅細(xì)胞增長增加血液的載氧能力。作為紅細(xì)胞產(chǎn)生的主要調(diào)節(jié)物，紅細(xì)胞生成素的主要功能是促進(jìn)紅細(xì)胞發(fā)育；開始血紅蛋白的合成，血紅蛋白是紅細(xì)胞中運(yùn)輸氧的分子。EPO刺激紅細(xì)胞前體細(xì)胞的有絲分裂和分化，從而保證紅細(xì)胞的產(chǎn)生。當(dāng)?shù)脱鯛顟B(tài)占優(yōu)時(shí)，其在腎臟中產(chǎn)生。在紅細(xì)胞前體細(xì)胞的EPO誘導(dǎo)分化期間，誘導(dǎo)球蛋白合成，提高血紅素復(fù)合體的合成和增加鐵蛋白受體的數(shù)目。這使細(xì)胞得以獲得更多離子并合成功能性血紅蛋白。成熟紅細(xì)胞中的血紅蛋白結(jié)合氧。因此，紅細(xì)胞及其中所含血紅蛋白在為機(jī)體供氧方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。已闡述的復(fù)雜過程開始于EPO與紅細(xì)胞前體細(xì)胞的細(xì)胞表面上的適當(dāng)受體的相互作用。當(dāng)機(jī)體處于健康狀態(tài)時(shí)，其中組織從既有數(shù)目的紅細(xì)胞接受足夠的氧合，EPO以極低濃度存在于血漿中。該正常的低濃度足以刺激更替因老化而正常損失的紅細(xì)胞。當(dāng)循環(huán)中血細(xì)胞運(yùn)輸?shù)难鯗p少時(shí)，循環(huán)中的EPO含量在低氧條件下增加。低氧可起因于因出血而大量失血、因過度暴露于輻射而破壞紅細(xì)胞、因高海拔或長時(shí)間昏迷而減少攝氧或各種形式的貧血癥。響應(yīng)正經(jīng)歷低氧壓力的組織，EPO將通過刺激紅細(xì)胞祖細(xì)胞的增殖來增強(qiáng)紅細(xì)胞產(chǎn)生。當(dāng)循環(huán)中紅細(xì)胞數(shù)目大于正常組織需氧量所需時(shí)，循環(huán)中的EPO 減少。因?yàn)镋PO在紅細(xì)胞形成過程中是必需的，所以該激素在診斷和治療以血細(xì)胞產(chǎn)生少或缺陷為特征的血液障礙方面具有潛在有用的應(yīng)用?？衫脧挠梅戳x化合物獲得的干細(xì)胞再生的細(xì)胞/組織治療的紅細(xì)胞生成素介導(dǎo)的示例性疾病和障礙包括，在對響應(yīng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織或器官造成損傷后利用EPO多肽的組織保護(hù)活性以避免損傷或恢復(fù)功能的疾病或狀況。這樣的疾病或狀況的實(shí)例包括但不限于血液異常的疾病狀態(tài)、障礙和狀態(tài)， 以紅細(xì)胞產(chǎn)生少或缺陷為特征的血液障礙，貧血癥，鐮狀細(xì)胞貧血，β -地中海貧血，紅細(xì)胞生成異常，妊娠障礙和月經(jīng)紊亂，早期早產(chǎn)兒貧血，腎機(jī)能不全，慢性腎衰竭，高血壓，手術(shù)相關(guān)疾病或病癥，兒科患者透析疾病或病癥，血細(xì)胞比容水平不足相關(guān)疾病或狀況，AIDS, 化學(xué)療法治療相關(guān)障礙，囊性纖維化，癌癥和腫瘤，傳染病，性病，免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病和障礙，心血管疾病例如中風(fēng)、低血壓、心搏停止，缺血特別是缺血-再灌注損傷， 心肌梗死例如急性心肌梗死，慢性心力衰竭，心絞痛，心臟肥大，心肺疾病，心肺分流，呼吸道疾病，腎、泌尿和生殖疾病，內(nèi)分泌和新陳代謝異常，胃腸疾病，主要具有神經(jīng)病學(xué)或精神病學(xué)癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNQ或周圍神經(jīng)系疾病，認(rèn)知功能的年齡相關(guān)喪失，大腦性麻搏，神經(jīng)變性疾病，阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，利氏病，癡呆，記憶喪失，肌萎縮性側(cè)索硬化，酒精中毒，心境障礙，焦慮障礙，注意力缺陷障礙，過興奮，孤獨(dú)癥，精神分裂癥，抑郁癥， 腦或脊髓創(chuàng)傷或缺血，克-雅病，眼病，癲癇障礙(seizure disorder)，多發(fā)性硬化，炎癥， 輻射損傷，黃斑變性，糖尿病性神經(jīng)病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，青光眼，視網(wǎng)膜缺血，和視網(wǎng)膜創(chuàng)傷，脊髓損傷，宇宙飛行狀態(tài)，急性失血狀態(tài)，老化和多種腫瘤疾病狀態(tài)。在實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和組合物用于調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素的任何功能。用于測定紅細(xì)胞生成素功能的調(diào)節(jié)的測定是本領(lǐng)域已知的，且在文獻(xiàn)中已有記載。例如美國專利號 5，688，679(通過引用結(jié)合到本文中的 “Human erythropoietin gene ；high level expression in stably transfected mammalian cells (入紅細(xì)生) ! !定染哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的高水平表達(dá))”)，其報(bào)道了基于在血漿凝塊中的小鼠骨髓細(xì)胞培養(yǎng)物中紅細(xì)胞集落(來自CFU-E ；紅細(xì)胞集落形成細(xì)胞)的形成進(jìn)行紅細(xì)胞生成素生物活性的體外測定的應(yīng)用(Blood Cells 4 =89-103,1978) 0該測定的靈敏度據(jù)報(bào)道為約5毫單位/ml。 用作測定標(biāo)準(zhǔn)品的紅細(xì)胞生成素是來自貧血綿羊的部分純化血漿制備物。測定來自在無氨甲蝶呤的新鮮培養(yǎng)基中生長24小時(shí)的傳代細(xì)胞系的上清液。用培養(yǎng)基以1 200的比例稀釋上清液，并加入1-10微升量的測定培養(yǎng)物，每毫升測定培養(yǎng)物包含2X105個(gè)骨髓細(xì)胞、 10%牛檸檬酸鹽血漿、20%胎牛血清、牛血清白蛋白和1.6%牛胚胎提取液(Gibco)。在孵育36-48小時(shí)后，將血漿凝塊固定在顯微鏡載玻片上，用聯(lián)苯胺對血紅蛋白染色和對紅細(xì)胞集落計(jì)數(shù)。美國專利號5，688，679還報(bào)道了來自選定細(xì)胞系的上清液在利用多價(jià)抗人紅細(xì)胞生成素兔抗血清(J. Cell. Physiol. 118 =87-96,1984)(通過引用結(jié)合到本文中)通過競爭性放射免疫測定來測定免疫反應(yīng)性紅細(xì)胞生成素的應(yīng)用。紅細(xì)胞生成素還可利用其它免疫學(xué)方法例如蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光法來檢測。同一專利還記載了測定分泌到細(xì)胞上清液中的紅細(xì)胞生成素對其它骨髓祖細(xì)胞的增殖影響?？蓽y定紅細(xì)胞生成素對多種來自小鼠和人骨髓的祖細(xì)胞的影響，這些祖細(xì)胞包括紅細(xì)胞集落形成細(xì)胞(CFU-E)、紅細(xì)胞爆發(fā)集落形成細(xì)胞(BFU-E)、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞前體(CFU-GM)和混合細(xì)胞集落形成細(xì)胞(CFU-Mix) (J. Cell. Physiol. Suppl. 1 =79-85, 1982 J. Cell. Physiol. 118 =87-96,1984)，通過引用結(jié)合到本文中。也已報(bào)道紅細(xì)胞生成素影響紅細(xì)胞譜系細(xì)胞之外的細(xì)胞類型。例如Lifshitz等， 2009, "Non-erythroid activities of erythropoietin :Functional effects on murinedendritic cells (紅細(xì)胞生成素的非紅細(xì)胞活性對小鼠樹突細(xì)胞的功能性影響)，”Mol Immunol. 46 (4) :713-21 (通過引用結(jié)合到本文中)，其報(bào)道了在注射EPO的小鼠和過表達(dá)人 EPO的轉(zhuǎn)基因小鼠中的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示⑶80和⑶86的細(xì)胞表面表達(dá)較高的脾DC群體增加。 Prutchi等，2008,"Erythropoietin effects on dendritic cells :potential mediators in its function as an immunomodulator ？(紅細(xì)胞生成素對樹突細(xì)胞的影響其作為免疫調(diào)節(jié)物功能的潛在介導(dǎo)物？)”Exp Hematol.36(12) :1682-90報(bào)道了當(dāng)體外施用時(shí)，EPO 提高了表達(dá)共刺激分子⑶80和⑶86的外周血DC和單核細(xì)胞衍生DC(MoDC)的百分比。在優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸對EPO (包括但不限于非編碼區(qū))多核苷酸特異。EPO 靶標(biāo)包括EPO變體；EPO突變體，包括SNP ;ΕΡ0的非編碼序列；等位基因、片段等。優(yōu)選地， 寡核苷酸是反義RNA分子。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案，靶核酸分子不只限于EPO多核苷酸，而且延伸至EPO的任何同種型、受體、同源物、非編碼區(qū)等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向EPO靶標(biāo)的天然反義序列(對編碼區(qū)和非編碼區(qū)天然反義)，EPO靶標(biāo)包括但不限于其變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義RNA或DNA分子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括這樣的變體其中在化合物的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上存在不同堿基。例如，如果第一個(gè)核苷酸是腺嘌呤，則可產(chǎn)生在該位置含有胸苷、鳥苷、胞苷或其它天然或非天然核苷酸的變體。這可在反義化合物的任何位置上完成。然后，利用本文所述方法檢驗(yàn)這些化合物，以測定它們抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，反義化合物和靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約 50%-約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約60% -約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約70% -約80%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約80% -約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起活性喪失，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件下反義化合物與非靶核酸序列非特異性結(jié)合時(shí)，反義化合物是可特異性雜交的。這樣的條件包括，即體內(nèi)測定或治療性治療情況的生理?xiàng)l件和體外測定情況中進(jìn)行測定的條件。當(dāng)反義化合物與靶DNA或RNA分子的結(jié)合干擾靶DNA或RNA的正常功能而引起效用喪失，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件下(即在體內(nèi)測定或治療性治療情況的生理?xiàng)l件下和在體外測定情況中進(jìn)行測定的條件下)該反義化合物與非靶序列非特異性結(jié)合時(shí)，則不論該反義化合物是DNA、RNA、嵌合體、取代物等，其是可特異性雜交的。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包括但不限于例如利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列、一個(gè)或多個(gè)SEQ ID NO :2所示序列等的EPO的靶向，調(diào)節(jié)EPO的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比對照上調(diào)表達(dá)或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，相比對照下調(diào)表達(dá)或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :3_5所示核酸序列，其包括例如利用PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸、 較短片段或較長片段、修飾鍵等。修飾鍵或核苷酸間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾磷酸基)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、 烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯(alkanephosphate)、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備和將它們整合入核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸本身亦是已知的，不必在此贅述。本領(lǐng)域技術(shù)人員還為治療用途控制反義的特異性和靈敏度。在動(dòng)物和人的疾病狀態(tài)的治療中已利用反義寡核苷酸作為治療部分。已將反義寡核苷酸安全有效地給予人，多種臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。因此確立的是，寡核苷酸可以是有用的治療藥物，其可被設(shè)計(jì)用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物(尤其人)的治療方案。在本發(fā)明實(shí)施方案中，寡聚反義化合物(尤其寡核苷酸)結(jié)合靶核酸分子并調(diào)節(jié)靶基因編碼分子的表達(dá)和/或功能。被干擾的DNA功能例如包括復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。被干擾的 RNA功能包括所有生命機(jī)能，例如RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到蛋白質(zhì)翻譯位點(diǎn)、由RNA翻譯蛋白質(zhì)、剪接RNA 產(chǎn)生一種或多種mRNA和RNA可能參與或促進(jìn)的催化活性。功能可被上調(diào)或抑制，視所需功能而定。反義化合物包括反義寡聚化合物、反義寡核苷酸、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、 可變剪接體、引物、探針及其它與靶核酸的至少一部分雜交的寡聚化合物。同樣地，這些化合物可以單鏈、雙鏈、部分單鏈或環(huán)狀寡聚化合物的形式引入。在本發(fā)明上下文中，反義化合物靶向特定核酸分子可以是多步驟過程。該過程通常開始于識別待調(diào)節(jié)功能的靶核酸。該靶核酸可以是例如其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或轉(zhuǎn)錄自該基因的mRNA)或來自病原體的核酸分子。在本發(fā)明中，靶核酸編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)。靶向過程通常還包括測定靶核酸中的至少一個(gè)靶區(qū)、區(qū)段或位點(diǎn)，以發(fā)生反義相互作用使所需影響例如調(diào)節(jié)表達(dá)發(fā)生。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“區(qū)”定義為具有至少一種可鑒定結(jié)構(gòu)、功能或特性的靶核酸的一部分。區(qū)段在靶核酸的區(qū)中?！皡^(qū)段”定義為靶核酸的區(qū)的更小部分或次級部分。本發(fā)明所用“位點(diǎn)”定義為靶核酸中的位置。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合紅細(xì)胞生成素(EPO)的天然反義序列，并調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素(EPO) (SEQ ID NO 1)的表達(dá)和/或功能。反義序列的實(shí)例包括SEQ ID NO :2-5。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的一個(gè)或多個(gè)區(qū)段，并調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素(EPO)的表達(dá)和/或功能。區(qū)段包括紅細(xì)胞生成素 (EPO)有義或反義多核苷酸的至少五個(gè)連續(xù)核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸對紅細(xì)胞生成素(EPO)的天然反義序列特異，其中寡核苷酸與紅細(xì)胞生成素(EPO)的天然反義序列的結(jié)合調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素 (EPO)的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸化合物包括SEQ ID NO :3-5所示序列、利用例如PCR、雜交等鑒定和擴(kuò)增的反義序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸、較短片段或較長片段、修飾鍵等。修飾鍵或核苷酸間鍵的實(shí)例包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，核苷酸包括磷衍生物?？蛇B接到本發(fā)明的修飾寡核苷酸中的糖或糖類似物部分的磷衍生物(或修飾磷酸基)可以是單磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯、 烷基磷酸酯、鏈烷磷酸酯(alkanephosphate)、硫代磷酸酯等。上述磷酸酯類似物的制備和將它們整合入核苷酸、修飾核苷酸和寡核苷酸本身亦是已知的，不必在此贅述。如本領(lǐng)域已知的，由于翻譯起始密碼子一般是5' -AUG(在轉(zhuǎn)錄的mRNA分子中； 在對應(yīng)的DNA分子中是5' -ATG)，故翻譯起始密碼子也稱為“AUG密碼子”、“起始密碼子” 或“AUG起始密碼子”。少數(shù)基因具有RNA序列為5' -GUG、5' -UUG或5' -CUG的翻譯起始密碼子；已表明5 ‘ -AUA、5 ‘ -ACG和5 ‘ -CUG在體內(nèi)起作用。因此，術(shù)語“翻譯起始密碼子”和“起始密碼子”可包括多種密碼子序列，但是各種情況下起始氨基酸通常為甲硫氨酸 (在真核生物中)或甲酰甲硫氨酸(在原核生物中)。真核和原核基因可具有兩個(gè)以上的備選起始密碼子，在特定細(xì)胞類型或組織中或在特定系列條件下可優(yōu)先將任一個(gè)用于翻譯起始。在本發(fā)明上下文中，“起始密碼子”和“翻譯起始密碼子”是指體內(nèi)用于啟始轉(zhuǎn)錄自編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)的基因的mRNA翻譯的密碼子，而不考慮這種密碼子的序列。基因的翻譯終止密碼子(或“終止密碼子”)可具有三種序列即5 ‘ -UAA、5 ‘ -UAG和5 ‘ -UGA (對應(yīng)的DNA序列分別是5 ‘ -TAA、5 ‘ -TAG和5 ‘ -TGA)之一。術(shù)語“起始密碼子區(qū)”和“翻譯起始密碼子區(qū)”是指mRNA或基因的一部分，其包含在任何方向(即5'或3')上從翻譯起始密碼子開始的約25-約50個(gè)連續(xù)核苷酸。同樣地，術(shù)語“終止密碼子區(qū)”和“翻譯終止密碼子區(qū)”是指mRNA或基因的一部分，其包含在任何方向(即5'或3')上從翻譯終止密碼子開始的約25-約50個(gè)連續(xù)核苷酸。因此，“起始密碼子區(qū)”(或“翻譯起始密碼子區(qū)”)和“終止密碼子區(qū)”(或翻譯終止密碼子區(qū))均為可用本發(fā)明的反義化合物有效靶向的區(qū)。本領(lǐng)域已知開放閱讀框(ORF)或“編碼區(qū)”是指翻譯起始密碼子和翻譯終止密碼子之間的區(qū)，亦即可有效靶向的區(qū)。在本發(fā)明上下文中，靶區(qū)是包含基因的開放閱讀框 (ORF)的翻譯起始或終止密碼子的基因內(nèi)區(qū)。另一個(gè)靶區(qū)包含5'非翻譯區(qū)(5' UTR)，本領(lǐng)域中已知其是指在5'方向上從翻譯起始密碼子開始的mRNA部分，并因此包含mRNA在5'帽子位點(diǎn)和翻譯起始密碼子之間的核苷酸(或基因上的對應(yīng)核苷酸)。又一個(gè)靶區(qū)包含3'非翻譯區(qū)(3‘ UTR)，本領(lǐng)域中已知其是指在3'方向上從翻譯終止密碼子開始的mRNA部分，并因此包含mRNA在翻譯終止密碼子和3'末端之間的核苷酸(或基因上的對應(yīng)核苷酸)。mRNA的5'帽子位點(diǎn)含有與 mRNA的5'-最末端殘基通過5' -5'三磷酸酯鍵連接的N7-甲基化鳥苷殘基。mRNA的 5'帽區(qū)被認(rèn)為包括5'帽子結(jié)構(gòu)本身以及鄰近帽子位點(diǎn)的前50個(gè)核苷酸。本發(fā)明的另一個(gè)靶區(qū)是5'帽區(qū)。雖然一些真核mRNA轉(zhuǎn)錄物被直接翻譯，但是多數(shù)包含一個(gè)或多個(gè)稱為“內(nèi)含子” 的區(qū)，這些區(qū)在翻譯轉(zhuǎn)錄物之前被從轉(zhuǎn)錄物上切下。剩余(因此被翻譯)的區(qū)被稱為“外顯子”，并被剪接到一起形成連續(xù)的mRNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，在疾病涉及異常剪接或疾病涉及特定剪接產(chǎn)物生產(chǎn)過剩的情況中，靶向剪接位點(diǎn)(即內(nèi)含子-外顯子連接點(diǎn)或外顯子-內(nèi)含子連接點(diǎn))特別有用。因重排或缺失引起的異常融合連接點(diǎn)是靶位點(diǎn)的另一個(gè)實(shí)施方案。通過對不同基因來源的兩個(gè)(以上)mRNA的剪接加工產(chǎn)生的mRNA轉(zhuǎn)錄物稱為“融合轉(zhuǎn)錄物”。利用靶向例如DNA或前mRNA的反義化合物可有效靶向內(nèi)含子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合靶多核苷酸的編碼和/或非編碼區(qū)，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合天然反義多核苷酸，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸結(jié)合有義多核苷酸，并調(diào)節(jié)靶分子的表達(dá)和/或功能。可變RNA轉(zhuǎn)錄物可產(chǎn)生自DNA的相同基因組區(qū)。這些可變轉(zhuǎn)錄物通常稱為“變體”。 更具體而言，“前mRNA變體”是產(chǎn)生自相同基因組DNA的轉(zhuǎn)錄物，與其它產(chǎn)生自相同基因組 DNA的轉(zhuǎn)錄物在它們的起始或終止位置方面不同，并同時(shí)含有內(nèi)含子和外顯子序列。通過在剪接過程中切除一個(gè)或多個(gè)外顯子或內(nèi)含子區(qū)或其部分，前mRNA變體產(chǎn)生更小的“mRNA變體”。因此，mRNA變體是經(jīng)加工的前mRNA變體，每個(gè)獨(dú)特的前mRNA變體由于剪接必定總是產(chǎn)生獨(dú)特的mRNA變體。這些mRNA變體也稱為“可變剪接變體”。如果未發(fā)生前mRNA變體的剪接，那么前mRNA變體與mRNA變體相同。變體可通過利用可變信號起始或終止轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生。前mRNA和mRNA可具有多于一個(gè)起始密碼子或終止密碼子。產(chǎn)生自利用可變起始密碼子的前mRNA或mRNA的變體稱為該前mRNA或mRNA的“可變起始變體”。那些利用可變終止密碼子的轉(zhuǎn)錄物稱為該前mRNA或 mRNA的“可變終止變體”。一種具體類型的可變終止變體是“polyA變體”，其中產(chǎn)生的多個(gè)轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生自轉(zhuǎn)錄機(jī)制對“polyA終止信號”之一的可變選擇，從而產(chǎn)生在獨(dú)特的polyA位點(diǎn)終止的轉(zhuǎn)錄物。在本發(fā)明上下文中，本文所述變體類型也是靶核酸的實(shí)施方案。靶核酸上反義化合物與之雜交的部位定義為活性反義化合物靶向的靶區(qū)的長度至少為5個(gè)核苷酸的部分。雖然本文闡述了某些示例性靶區(qū)段的具體序列，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到， 它們用于闡述和說明本發(fā)明范圍內(nèi)的具體實(shí)施方案。根據(jù)此公開內(nèi)容，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地確定其它靶區(qū)段。長度5-100個(gè)核苷酸、包含選自闡述的優(yōu)選靶區(qū)段中的一段至少五( 個(gè)連續(xù)核苷酸的靶區(qū)段被認(rèn)為也適合靶向。靶區(qū)段可包含含有來自闡述的優(yōu)選靶區(qū)段之一的5'末端的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列(剩余核苷酸為同一 DNA或RNA的一段連續(xù)序列，以緊接靶區(qū)段的5' 末端上游開始，并持續(xù)直到該DNA或RNA含有約5-約100個(gè)核苷酸)。同樣優(yōu)選的靶區(qū)段是含有從闡述的優(yōu)選靶區(qū)段之一的3'末端開始的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的DNA或RNA序列 (剩余核苷酸是同一 DNA或RNA的一段連續(xù)序列，以緊接靶區(qū)段的3'末端下游開始，并持續(xù)直到該DNA或RNA含有約5-約100個(gè)核苷酸)。本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合本文所述靶區(qū)段能夠在不進(jìn)行過度實(shí)驗(yàn)的情況下鑒定其它優(yōu)選靶區(qū)段。只要已鑒定了一個(gè)或多個(gè)靶區(qū)、區(qū)段或位點(diǎn)，就選擇與靶標(biāo)充分互補(bǔ)(即足夠充分并以足夠特異性雜交)的反義化合物，以得到所需效果。在本發(fā)明實(shí)施方案中，寡核苷酸結(jié)合特定靶標(biāo)的反義鏈。寡核苷酸長度為至少5 個(gè)核苷酸，并可被合成使每個(gè)寡核苷酸靶向重疊序列，從而合成的寡核苷酸覆蓋靶多核苷酸的完整長度。靶標(biāo)還包括編碼區(qū)和非編碼區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選通過反義寡核苷酸靶向特定核酸。反義化合物靶向特定核酸是多步驟過程。該過程通常開始于鑒定待調(diào)節(jié)功能的核酸序列。這可以是例如其表達(dá)與特定病癥或疾病狀態(tài)相關(guān)的細(xì)胞基因(或轉(zhuǎn)錄自該基因的mRNA)，或者非編碼多核苷酸， 例如非編碼RNA(ncRNA)。RNA可歸為(1)被翻譯成蛋白質(zhì)的信使RNA (mRNA)和(2)不編碼蛋白的 RNA(ncRNA)。ncRNA包括微小RNA、反義轉(zhuǎn)錄物及其它含有高密度的終止密碼子并缺乏任何大范圍“開放閱讀框”的轉(zhuǎn)錄單位(TU)。許多ncRNA似乎起始于編碼蛋白的基因座的3' 非翻譯區(qū)(3‘ UTR)的起始位點(diǎn)。ncRNA通常很少，且已由FANTOM公司測序的ncRNA中至少一半似乎未被聚腺苷酸化。由于顯而易見的原因，大多數(shù)研究人員已聚焦于被加工并輸出到胞漿中的聚腺苷酸化mRNA。最近表明，非聚腺苷酸化的核RNA組可能非常大，且許多這樣的轉(zhuǎn)錄物產(chǎn)生自所謂的基因區(qū)間(Cheng, J.等(2005) Science 308 (5725)，1149-1154 ； Kapranov, P.等 Q005). Genome Res 15 (7)，987-997)。ncRNA 可調(diào)節(jié)基因表達(dá)的機(jī)制是通過與靶轉(zhuǎn)錄物的堿基配對。通過堿基配對起作用的RNA可被分為(1)順式編碼RNA，其在相同基因位置但在與它們作用的RNA的相對鏈上被編碼，因此顯示與它們靶標(biāo)的完全互補(bǔ)性，和( 反式編碼RNA，其在與它們作用的RNA不同的染色體位置上被編碼，且通常不表現(xiàn)與它們的靶標(biāo)進(jìn)行完全堿基配對的可能性。不希望為理論所約束，通過本文所述反義寡核苷酸對反義多核苷酸的干擾可改變相應(yīng)有義信使RNA的表達(dá)。但是，該調(diào)節(jié)可以是不一致的(discordant)(反義敲減引起信使RNA增加)或一致的(concordant)(反義敲減引起伴隨的信使RNA減少)。在這些情況下，可將反義寡核苷酸靶向反義轉(zhuǎn)錄物的重疊或非重疊部分，以引起其敲減或隔離 (sequestration)。編碼或非編碼反義物可以相同方式靶向，且任一種能夠調(diào)節(jié)相應(yīng)的有義轉(zhuǎn)錄物-以一致或不一致的方式。用以鑒定新的針對靶標(biāo)使用的寡核苷酸的策略可基于通過反義寡核苷酸或任何其它調(diào)節(jié)所需靶標(biāo)的方法對反義RNA轉(zhuǎn)錄物的敲減。策略1 在不一致的調(diào)節(jié)情況中，反義轉(zhuǎn)錄物的敲減提高常規(guī)(有義)基因的表達(dá)。如果后者的基因編碼已知或推定的藥物靶標(biāo)，那么可想象得到，其反義配對物的敲減可模仿受體激動(dòng)劑或酶刺激劑的作用。策略2 在一致調(diào)節(jié)的情況中，可相伴敲減反義和有義轉(zhuǎn)錄物，從而實(shí)現(xiàn)常規(guī)(有義)基因表達(dá)的協(xié)同性減少。例如，如果利用反義寡核苷酸完成敲減，那么可利用該策略應(yīng)用一個(gè)靶向有義轉(zhuǎn)錄物的反義寡核苷酸和另一個(gè)靶向相應(yīng)反義轉(zhuǎn)錄物的反義寡核苷酸，或者應(yīng)用同時(shí)靶向重疊的有義和反義轉(zhuǎn)錄物的單個(gè)有效的對稱反義寡核苷酸。按照本發(fā)明，反義化合物包括反義寡核苷酸、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物(例如siRNA化合物)及其它與靶核酸的至少一部分雜交并調(diào)節(jié)其功能的寡聚化合物。同樣地，它們可以是DNA、RNA、類DNA、類 RNA及其混合物，或者可以是它們中一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、 環(huán)狀或發(fā)夾狀的寡聚化合物，并可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或端部凸起、錯(cuò)配或環(huán)。反義化合物常規(guī)線性制備，但可連接或另外制備成環(huán)狀和/或分支。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈或者具有足夠的自我互補(bǔ)性以允許雜交和形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈。兩條鏈可內(nèi)部連接留下游離的3'或5'末端，或者可連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包含5'或者3'末端的突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸。雙鏈化合物任選地可包括末端的突出端。其它修飾可包括連接至末端之一、選定核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵之一的綴合基?；蛘?，兩條鏈可通過非核酸部分或連接基團(tuán)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時(shí)，dsRNA可呈現(xiàn)自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子的形式，該發(fā)夾型分子自身對折形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的。基因表達(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá)dsRNA發(fā)夾來實(shí)現(xiàn)，但是在某些實(shí)施方案中，基因表達(dá)或功能被上調(diào)。當(dāng)由兩條鏈形成或由呈現(xiàn)自身對折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)性發(fā)夾型分子的形式的單鏈形成時(shí)，兩條鏈(單鏈的雙鏈體形成區(qū))是以Watson-Crick方式進(jìn)行堿基配對的互補(bǔ) RNA 鏈。一旦被引入系統(tǒng)，本發(fā)明化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以影響靶核酸的切割或其它修飾，或通過基于占用的機(jī)制起作用。通常，核酸(包括寡核苷酸)可被描述為“類DNA”(即通常具有一個(gè)或多個(gè)2'-脫氧糖和通常具有T而非U堿基)或“類 RNA”(即通常具有一個(gè)或多個(gè)2'-羥基或2'-修飾糖和通常具有U而非T堿基)。核酸螺旋可采取多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最常見的是A型和B型。據(jù)認(rèn)為，一般而言，具有類似 B型結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“類DNA”，而那些具有類似A型結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“類RNA”。在一些 (嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可同時(shí)包含A型區(qū)和B型區(qū)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所需寡核苷酸或反義化合物包括下述的至少一種反義RNA、反義DNA、嵌合反義寡核苷酸、含修飾鍵的反義寡核苷酸、干擾RNA(RNAi)、短干擾 RNA(siRNA)；微小干擾RNA(miRNA)；小時(shí)序RNA(stRNA)；或者短發(fā)夾RNA(shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa)；小激活RNA(saRNA)或其組合。dsRNA還可激活基因表達(dá)，這是已稱為“小RNA誘導(dǎo)的基因激活”或RNAa的機(jī)制。 靶向基因啟動(dòng)子的dsRNA誘導(dǎo)相關(guān)基因的有效轉(zhuǎn)錄激活。利用稱為“小激活RNA(saRNA)，， 的合成dsRNA在人細(xì)胞中表明RNAa。目前不清楚其它生物體內(nèi)是否保留RNAa。小雙鏈RNA (dsRNA)例如小干擾RNA (siRNA)和微小RNA (miRNA)，已被發(fā)現(xiàn)是稱為 RNA干擾(RNAi)的進(jìn)化保守機(jī)制的觸發(fā)物。RNAi總是通過重建染色質(zhì)導(dǎo)致基因沉默，從而抑制轉(zhuǎn)錄、降解互補(bǔ)mRNA或阻斷蛋白翻譯。但是，在下文實(shí)施例部分詳述的情形中，表明寡核苷酸提高紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸及其編碼產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。dsRNA也可作為小激活RNA(saRNA)。不希望為理論所約束，通過靶向基因啟動(dòng)子的序列，saRNA在稱為 dsRNA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活(RNAa)的表型中誘導(dǎo)靶基因表達(dá)。在另一實(shí)施方案中，本文鑒定的“優(yōu)選靶區(qū)段”可用來篩選另外的調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸表達(dá)的化合物?！罢{(diào)節(jié)劑”是那些降低或提高編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)的核酸分子的表達(dá)的那些化合物，其包含與優(yōu)選靶區(qū)段互補(bǔ)的至少5個(gè)核苷酸的部分。篩選法包括以下步驟將編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)的有義或天然反義多核苷酸的核酸分子的優(yōu)選靶區(qū)段與一種或多種候選調(diào)節(jié)劑接觸，并選擇降低或提高編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸(例如SEQ ID NO :3-5)的核酸分子的表達(dá)的一種或多種候選調(diào)節(jié)劑。一旦表明候選調(diào)節(jié)劑能夠調(diào)節(jié)(例如降低或提高)編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的核酸分子的表達(dá)， 則調(diào)節(jié)劑可用于紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸功能的其它調(diào)查性研究，或依據(jù)本發(fā)明用作研究、診斷或治療的試劑。靶向天然反義序列優(yōu)選調(diào)節(jié)靶基因的功能，靶基因例如EPO基因(例如登記號 NM_000799. 2，圖幻。在優(yōu)選實(shí)施方案中，靶標(biāo)是紅細(xì)胞生成素基因的反義多核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸(例如登記號NM_000799.2， 圖2)的有義和/或天然反義序列，其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子，靶標(biāo)包括反義和/或有義EPO多核苷酸的編碼和非編碼區(qū)。天然反義多核苷酸可按照例如以下文獻(xiàn)所述鑒定W02007/087113和美國專利申請公開號 2009/0258925，它們的名稱均為 “Natural Antisense and Non-coding RNA Transcripts as Drug Targets (作為藥物靶標(biāo)的天然反義和非編碼RNA轉(zhuǎn)錄物)”，通過引用以其整體結(jié)合到本文中。本發(fā)明的優(yōu)選靶區(qū)段還可與本發(fā)明的它們各自互補(bǔ)的反義化合物結(jié)合，以形成穩(wěn)定的雙鏈(雙鏈體)寡核苷酸。本領(lǐng)域中已表明，這樣的雙鏈寡核苷酸部分通過反義機(jī)制調(diào)節(jié)靶標(biāo)表達(dá)和調(diào)節(jié)翻譯及RNA加工。此外，雙鏈部分可經(jīng)過化學(xué)修飾(Fire等，(1998) Nature, 391,806-811 ； Timmons 禾口 Fire， (1998)Nature,395,854 ；Timmons 等，(2001)Gene,263,103-112 ；Tabara 等,(1998) Science, 282, 430-431 ；Montgomery 等,(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95,15502-15507 ；Tuschl 等，(1999)Genes Dev. ,13,3191-3197 ；Elbashir 等，(2001) Nature，411，494-498 ;Elbashir 等，(2001)Genes Dev. 15，188-200)。例如，已表明這樣的雙鏈部分通過雙鏈體的反義鏈與靶標(biāo)的經(jīng)典雜交而抑制靶標(biāo)，從而觸發(fā)靶標(biāo)的酶促降解 (Tijsterman 等，Q002) Science, 295,694-697)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸靶向紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸(例如登錄號NM_000799. 2)、其變體、等位基因、同種型、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案，靶核酸分子不只限于紅細(xì)胞生成素(EPO)，而且延伸至紅細(xì)胞生成素(EPO)分子的任何同種型、受體、同源物等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向EPO多核苷酸的天然反義序列(例如SEQ ID NO :2所示的多核苷酸)及其任何變體、等位基因、同源物、突變體、衍生物、片段和互補(bǔ)序列。反義寡核苷酸的實(shí)例如SEQ ID NO :3-5所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與紅細(xì)胞生成素(EPO)反義物的核酸序列互補(bǔ)或與之結(jié)合，并調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素(EPO)分子的表達(dá)和/或功能，所述核酸序列包括但不限于與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸相關(guān)的非編碼有義和/或反義序列。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸與SEQ ID NO :2所示EPO天然反義核酸序列互補(bǔ)或與之結(jié)合，并調(diào)節(jié)EPO分子的表達(dá)和/或功能。在優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸包含SEQ ID NO :3_5的至少5個(gè)連續(xù)核苷酸的序列， 并調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素(EPO)分子的表達(dá)和/或功能。多核苷酸靶標(biāo)包括ΕΡ0，包括其家族成員、ΕΡ0變體；EPO突變體，包括SNP ；EPO的非編碼序列；EPO的等位基因；物種變體、片段等。優(yōu)選地，寡核苷酸是反義分子。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的寡核苷酸包括 反義 RNA、干擾 RNA (RNAi)、短干擾 RNA (siRNA)；微小干擾 RNA (miRNA)；小時(shí)序 RNA (stRNA)； 短發(fā)夾RNA(shRNA)；小RNA誘導(dǎo)的基因激活(RNAa)；或小激活RNA(saRNA)。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶向紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸(例如SEQ ID NO 2)調(diào)節(jié)這些靶標(biāo)的表達(dá)或功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比對照上調(diào)表達(dá)或功能。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，相比對照下調(diào)表達(dá)或功能。
在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義化合物包含SEQ ID N0:3_5所示序列。這些寡核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)修飾核苷酸、較短片段或較長片段、修飾鍵等。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，SEQ ID NO :3_5包含一個(gè)或多個(gè)LNA核苷酸。對所需靶核酸的調(diào)節(jié)可以本領(lǐng)域已知的各種方法進(jìn)行。例如，反義寡核苷酸、 siRNA等。酶核酸分子(例如核酶)是能夠催化多種反應(yīng)中的一種或多種的核酸分子，包括以核苷酸堿基序列特異性方式重復(fù)切割其它分離的核酸分子的能力。這樣的酶核酸分子可用于例如靶向幾乎任何 RNA 轉(zhuǎn)錄物(Zaug 等，324，Nature 429 1986 ；Cech, 260JAMA 3030， 1988 ；and Jefferies 等，17 Nucleic Acids Research 1371，198 。因?yàn)樗鼈兊男蛄刑禺愋裕词角懈蠲负怂岱肿语@示作為用于人疾病的治療藥物的前景(Usman 和 McSwiggen, (1995) Ann. Rep. Med. Chem. 30，285-294 ；Christoffersen 和 Marr, (1995) J. Med. Chem. 38，2023-2037)。酶核酸分子可被設(shè)計(jì)用以切割細(xì)胞RNA背景中的特定RNA靶標(biāo)。這樣的切割事件使mRNA為非功能性的，并廢除來自該RNA的蛋白質(zhì)表達(dá)。 如此，可選擇性抑制與疾病狀態(tài)有關(guān)的蛋白質(zhì)的合成。通常，具有RNA切割活性的酶核酸通過首先結(jié)合靶RNA而起作用。這種結(jié)合通過酶核酸的靶結(jié)合部分發(fā)生，該靶結(jié)合部分被保持與該分子的酶促部分十分靠近，該酶促部分作用以切割靶RNA。因此，酶核酸首先識別并接著通過互補(bǔ)堿基配對結(jié)合靶RNA，一旦結(jié)合到正確位點(diǎn)，則酶促作用以切割靶RNA。這種靶RNA的策略性切割將破壞其直接合成編碼蛋白的能力。在酶核酸已結(jié)合并切割其RNA靶標(biāo)之后，其從該RNA上釋放，以尋找另一個(gè)靶標(biāo)，并可重復(fù)地結(jié)合并切割新靶標(biāo)。數(shù)種方法例如體外選擇(進(jìn)化)策略(Orgel,(1979) Proc. R. Soc. London, B 205， 435)已被用于發(fā)展能夠催化多種反應(yīng)的新的核酸催化劑，反應(yīng)例如切割和連接磷酸二酯鍵和酰胺鍵(Joyce，(1989)Gene，82，83-87 ;Beaudry 等，(1992)kience 257,635-641 ； Joyce, (1992)Scientific American 267,90-97 ；Breaker 等，(1994)TIBTECH 12,268 ； Bartel 等，(1993)Science 261 :1411-1418 ；Szostak, (1993)TIBS 17,89-93 ；Kumar 等， (1995)FASEB J. ,9,1183 ；Breaker, (1996)Curr. Op. Biotech. , 7,442) 催化活性最佳的核酶的發(fā)展主要?dú)w因于為調(diào)節(jié)基因表達(dá)的目的而使用切割RNA 的核酶的任何策略。例如，錘頭核酶在飽和(IOmM)濃度的Mg2+輔助因子存在下起作用的催化速率(kcat)為約lmin-1。已表明人工“RNA連接酶”核酶催化相應(yīng)的自我修飾反應(yīng)的速率為約lOOmin-1。此外，已知具有由DNA組成的底物結(jié)合臂的某些修飾錘頭核酶以接近 IOOmin-I的多倍周轉(zhuǎn)(turn-over)速率催化RNA切割。最后，用某些核苷酸類似物取代錘頭的催化核心中的特定殘基得到的修飾核酶表現(xiàn)差不多10倍的催化速率提升。這些發(fā)現(xiàn)說明，核酶可以顯著高于由大多數(shù)天然自我切割核酶在體外表現(xiàn)出的催化速率的催化速率促進(jìn)化學(xué)轉(zhuǎn)變。那么可能的是，可優(yōu)化某些自我切割核酶的結(jié)構(gòu)以獲得最大催化活性，或者可產(chǎn)生表現(xiàn)出顯著更快的RNA磷酸二酯切割速率的全新RNA模體。符合“錘頭”模型的RNA催化劑對RNA底物的分子間切割于1987年首次被表明 (Uhlenbeck，0. C. (1987) Nature, 328 :596-600)?；厥?RNA 催化劑并使之與多種 RNA 分子反應(yīng)，證明其確實(shí)有催化性。基于“錘頭”模體設(shè)計(jì)的催化RNA已被用于通過在催化RNA中作出適當(dāng)?shù)膲A基改變以維持與靶序列的必要堿基配對來切割特定靶序列(Haseloff和Gerlach，(1988) Nature,334,585 ；Walbot 禾口 Bruening， (1988)Nature,334,196 ；Uhlenbeck, 0. C. (1987)Nature, 328 :596-600 ；Koizumi, Μ.，等.(1988)FEBS Lett.，228 :228-230) 這使得能夠利用催化RNA切割特定靶序列并表明，按照“錘頭”模型設(shè)計(jì)的催化RNA也許可體內(nèi)切割特定底物 RNA (參見 Haseloff 和 Gerlach, (1988) Nature, 334, 585 ；Walbot 和 Bruening, (1988) Nature,334，196 ；Uhlenbeck,0.C. (1987)Nature,328 :596-600)。RNA干擾(RNAi)已成為調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因表達(dá)的有力工具。 該方法需要利用表達(dá)質(zhì)粒或病毒和被加工成siRNA的小發(fā)夾RNA的編碼序列將小干擾 RNA (siRNA)作為RNA自身或DNA遞送。該系統(tǒng)能夠?qū)⑶皊iRNA有效轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中，在細(xì)胞質(zhì)中它們有活性，并允許使用受調(diào)節(jié)和組織特異的啟動(dòng)子進(jìn)行基因表達(dá)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸或反義化合物包含核糖核酸(RNA)和/或脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚體或多聚體，或其模擬物、嵌合體、類似物或同源物。該術(shù)語包括由天然存在的核苷酸、糖和共價(jià)核苷間(骨架)鍵組成的寡核苷酸以及類似地起作用的具有非天然存在部分的寡核苷酸。由于所需性質(zhì)，例如增加的細(xì)胞吸收、增強(qiáng)的靶核酸親和力和核酸酶存在下增強(qiáng)的穩(wěn)定性，這種修飾或取代寡核苷酸通常要求以天然形式產(chǎn)生。按照本發(fā)明，寡核苷酸或“反義化合物”包括反義寡核苷酸(例如RNA、DNA、其模擬物、嵌合體、類似物或同源物)、核酶、外部指導(dǎo)序列(EGQ寡核苷酸、siRNA化合物、單鏈或雙鏈RNA干擾(RNAi)化合物例如siRNA化合物、saRNA、aRNA和其它與靶核酸的至少一部分雜交并調(diào)節(jié)其功能的寡聚化合物。同樣地，它們可以是DNA、RNA、類DNA、類RNA或其混合物，或者可以是它們中一種或多種的模擬物。這些化合物可以是單鏈、雙鏈、環(huán)狀或發(fā)夾狀的寡聚化合物，并可包含結(jié)構(gòu)元件，例如內(nèi)部或端部凸起、錯(cuò)配或環(huán)。反義化合物常規(guī)線性制備，但可連接或另外制備成環(huán)狀和/或分支。反義化合物可包括構(gòu)建體，例如雜交形成完全或部分雙鏈化合物的兩條鏈或者具有足夠的自我互補(bǔ)性以允許雜交和形成完全或部分雙鏈化合物的單鏈。兩條鏈可內(nèi)部連接留下游離的3'或5'末端，或者可連接形成連續(xù)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)或環(huán)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)可包含5'或者3'末端的突出端，產(chǎn)生單鏈特征的延伸。雙鏈化合物任選地可包括末端上的突出端。其它修飾可包括連接至末端之一、選定核苷酸位置、糖位置或核苷間鍵之一的綴合基?；蛘?，兩條鏈可通過非核酸部分或連接基團(tuán)連接。當(dāng)僅由一條鏈形成時(shí)，dsRNA可呈現(xiàn)自身互補(bǔ)的發(fā)夾型分子的形式，該發(fā)夾型分子自身對折形成雙鏈體。因此，dsRNA可以是完全或部分雙鏈的。基因表達(dá)的特異性調(diào)節(jié)可通過在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中穩(wěn)定表達(dá) dsRNA 發(fā)夾來實(shí)現(xiàn)(Hammond 等，(1991)Nat. Rev. Genet.，2，110-119 ；Matzke 等，Q001) Curr. Opin. Genet. Dev.，11,221-227 ;Sharp，(2001)Genes Dev.，15，485-490)。 當(dāng)由兩條鏈形成或由呈現(xiàn)自身對折形成雙鏈體的自身互補(bǔ)性發(fā)夾型分子形式的單鏈形成時(shí)，兩條鏈(或單鏈的雙鏈體形成區(qū))是以Watson-Crick方式進(jìn)行堿基配對的互補(bǔ)RNA鏈。一旦被引入系統(tǒng)，本發(fā)明化合物可引起一種或多種酶或結(jié)構(gòu)蛋白的作用以影響靶核酸的切割或其它修飾，或者通過基于占用的機(jī)制工作。通常，核酸(包括寡核苷酸)可被描述為“類DNA”(即通常具有一個(gè)或多個(gè)2'-脫氧糖和通常具有T而非U堿基)或“類 RNA”(即通常具有一個(gè)或多個(gè)2'-羥基或2'-修飾糖和通常具有U而非T堿基)。核酸螺旋可采取多于一種類型的結(jié)構(gòu)，最常見的是A型和B型。據(jù)認(rèn)為，一般而言，具有類似 B型結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“類DNA”，而那些具有類似A型結(jié)構(gòu)的寡核苷酸為“類RNA”。在一些 (嵌合)實(shí)施方案中，反義化合物可同時(shí)包含A型區(qū)和B型區(qū)。
本發(fā)明的反義化合物可包含長度為約5-約80個(gè)核苷酸(即約5-約80個(gè)連接的核苷)的反義部分。這是指反義化合物的反義鏈或部分的長度。換言之，本發(fā)明的單鏈反義化合物包含約5-約80個(gè)核苷酸，本發(fā)明的雙鏈反義化合物(例如dsRNA)包含長度為約 5-約80個(gè)核苷酸的有義和反義鏈或部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這包括以下長度的反義部分5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、 54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79 或80個(gè)核苷酸或其中的任何范圍。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物具有長度為10-50個(gè)核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這包括具有以下長度的反義部分的寡核苷酸10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個(gè)核苷酸或其中任何范圍。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸長度為15個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的反義化合物或寡核苷酸化合物具有長度為12或 13-30個(gè)核苷酸的反義部分。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，這包括具有以下長度的反義部分的反義化合物12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、四或30 個(gè)核苷
酸或其中任何范圍。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的寡聚化合物還包括變體，其中在所述化合物的一個(gè)或多個(gè)核苷酸位置上存在不同堿基。例如，如果第一個(gè)核苷酸是腺苷，則可產(chǎn)生在該位置含有胸苷、鳥苷或胞苷的變體。這可在反義或dsRNA化合物的任何位置上完成。然后， 利用本文所述方法檢驗(yàn)這些化合物，以測定它們抑制靶核酸表達(dá)的能力。在一些實(shí)施方案中，反義化合物和靶標(biāo)之間的同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約 40%-約60%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約60% -約70%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約70% -約80%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約80% -約90%。在一些實(shí)施方案中，同源性、序列同一性或互補(bǔ)性為約90%、約92%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，反義寡核苷酸例如SEQ ID NO :2-5所示核酸分子包含一個(gè)或多個(gè)取代或修飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，用鎖定核酸(LNA)取代核苷酸。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，寡核苷酸靶向與EPO相關(guān)的編碼和/或非編碼序列的有義和/或反義核酸分子的一個(gè)或多個(gè)區(qū)和SEQ ID N0:l、2所示的序列。寡核苷酸也靶向 SEQ ID NO 1,2的重疊區(qū)。本發(fā)明的某些優(yōu)選寡核苷酸是嵌合寡核苷酸。本發(fā)明上下文中的“嵌合寡核苷酸”或“嵌合體”是含有兩個(gè)以上化學(xué)上不同的區(qū)(每個(gè)區(qū)由至少一個(gè)核苷酸組成)的寡核苷酸。這些寡核苷酸通常包含至少一個(gè)賦予一種或多種有益性質(zhì)(例如增加的核酸酶抗性、增加的細(xì)胞吸收、增加的靶結(jié)合親和力)的修飾核苷酸區(qū)，和作為能夠切割RNA:DNA或 RNAiRNA雜合體的酶的底物的區(qū)。舉例來說，RNA酶H是切割RNA:DNA雙鏈體的RNA鏈的細(xì)胞內(nèi)切核酸酶。RNA酶H的活化因此導(dǎo)致對RNA靶標(biāo)的切割，從而極大地提高基因表達(dá)的反義調(diào)節(jié)有效性。因此，相比與相同靶區(qū)雜交的硫代磷酸酯脫氧寡核苷酸，當(dāng)使用嵌合寡核苷酸時(shí)，通?？衫幂^短的寡核苷酸獲得相似結(jié)果。RNA靶標(biāo)的切割可常規(guī)通過凝膠電泳和可能需要的本領(lǐng)域已知的相關(guān)核酸雜交技術(shù)檢測。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，嵌合寡核苷酸包含被修飾以提高靶結(jié)合親和力的至少一個(gè)區(qū)，并通常包含作為RNA酶H底物的區(qū)。寡核苷酸對其靶標(biāo)(該情況下為編碼ras的核酸)的親和力常規(guī)通過測量寡核苷酸/靶標(biāo)對的 Tm而測定，Tm是寡核苷酸和靶標(biāo)解離時(shí)的溫度；解離通過分光光度法檢測。Tm越高，寡核苷酸對靶標(biāo)的親和力越大。本發(fā)明的嵌合反義化合物可形成為兩種以上上述寡核苷酸、修飾寡核苷酸、寡核苷和/或寡核苷酸模擬物的混合結(jié)構(gòu)。這樣的化合物在本領(lǐng)域中也稱為雜合體或 gapmer。教導(dǎo)這種雜合體結(jié)構(gòu)制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5，013，830、 5，149，797、5，220，007、5，256，775、5，366，878、5，403，711、5，491，133、5，565，350、 5，623，065,5, 652，355,5, 652，356和5，700，922，上述專利各通過引用結(jié)合到本文中。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾寡核苷酸區(qū)包含至少一個(gè)在糖的2'位置被修飾的核苷酸，最優(yōu)選2' -0-烷基、2' -0-烷基-0-烷基或2'-氟-修飾核苷酸。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，RNA修飾包括在RNA 3'末端的嘧啶、脫堿基殘基或反向堿基的核糖上的 2'-氟、2'-氨基和2' 0-甲基修飾。這種修飾被常規(guī)整合到寡核苷酸中，并已表明這些寡核苷酸相比2'-脫氧寡核苷酸針對給定靶標(biāo)具有較高的Tm(即較高的靶結(jié)合親和力)。 這種增加的親和力的影響極大地增強(qiáng)RNAi寡核苷酸對基因表達(dá)的抑制。RNA酶H是切割 RNAiDNA雙鏈體的RNA鏈的細(xì)胞內(nèi)切核酸酶；該酶的活化因此導(dǎo)致對RNA靶標(biāo)的切割，從而可極大地提高RNAi抑制的有效性。對RNA靶標(biāo)的切割可常規(guī)通過凝膠電泳證明。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，還修飾嵌合寡核苷酸以增強(qiáng)核酸酶抗性。細(xì)胞含有多種可降解核酸的外切和內(nèi)切核酸酶。已表明許多核苷酸和核苷修飾使它們被整合入的寡核苷酸相比天然寡脫氧核苷酸對核酸酶消化更具抗性。核酸酶抗性常規(guī)通過將寡核苷酸與細(xì)胞提取液或分離的核酸酶溶液一起孵育，并測量隨時(shí)間剩余的完整寡核苷酸含量(一般通過凝膠電泳)來測量。已被修飾以增強(qiáng)其核酸酶抗性的寡核苷酸相比未修飾寡核苷酸保持完整持續(xù)更長的時(shí)間。已證明多種寡核苷酸修飾增強(qiáng)或賦予核酸酶抗性。目前更優(yōu)選含有至少一種硫代磷酸酯修飾的寡核苷酸。在某些情況下，增強(qiáng)靶結(jié)合親和力的寡核苷酸修飾還獨(dú)立地能夠增強(qiáng)核酸酶抗性。一些所需修飾可參見De Mesmaeker等(199 Acc. Chem. Res. ,28 :366_374?？深A(yù)見用于本發(fā)明的一些優(yōu)選寡核苷酸的具體實(shí)例包括含有修飾骨架的寡核苷酸，修飾骨架例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短鏈烷基或環(huán)烷基糖間鍵或短鏈雜原子或雜環(huán)糖間鍵。最優(yōu)選寡核苷酸具有硫代磷酸酯骨架和具有雜原子骨架，尤其是CH2—NH—0—CH2、CH, —N(CH3)—0—CH2[稱為亞甲基(甲基亞氨基)或MMI骨架]、 CH2—0—N(CH3) —CH2、CH2-N(CH3) —N(CH3) —CH2 和 0—N(CH3) —CH2—CH2 骨架，其中天然磷酸二酯骨架表示為 0—P—0—CH。還優(yōu)選 De Mesmaeker 等(1995) Acc. Chem. Res. 28 366-374所披露的酰胺骨架。還優(yōu)選具有嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸(Summerton和狗11吐，美國專利號5，034，506)。在其它優(yōu)選實(shí)施方案中，例如寡核苷酸的肽核酸(PNA) 骨架、磷酸二酯骨架為聚酰胺骨架所取代，核苷酸直接或間接結(jié)合聚酰胺骨架的氮雜氮原子(Nielsen等(1991)kienCe2M，1497)。寡核苷酸還可包含一個(gè)或多個(gè)取代糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2'位置包含下述基團(tuán)之一 0H、SH、SCH3、F、OCN, 0CH30CH3、0CH30(CH2) 11013、0(0^)11朋2或0(0^)11013，其中11為1-約10 ；Cl-ClO的低級烷基、烷氧基烷氧基、取代低級烷基、烷芳基或芳烷基；Cl ；Br ；CN ；CF3 ；0CF3 ；0—、S—或N-烷基；0—、S—或N-烯基；S0CH3 ；S02CH3 ；0N02 ；N02 ；N3 ；NH2 ；雜環(huán)烷基；雜環(huán)烷芳基；氨基烷基氨基；聚烷基氨基；取代甲硅烷基；RNA切割基；報(bào)道基；嵌入劑；用于改進(jìn)寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)；或者用于改進(jìn)寡核苷酸的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)和其它具有類似性質(zhì)的取代基。優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧基乙氧基[2' -0-CH2CH20CH3，亦稱為2' -0-(2-甲氧乙基)](Martin 等，(1995)Helv. Chim. Acta，78，486)。其它優(yōu)選的修飾包括 2'-甲氧基 O' -0—CH3)、 2'-丙氧基O' -0CH2CH2CH3)和2'-F)。類似修飾也可產(chǎn)生在寡核苷酸的其
它位置上，尤其是3'末端核苷酸的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸還可具有糖模擬物，例如取代呋喃戊糖基的環(huán)丁基。寡核苷酸還可另外或備選地包含核堿基(本領(lǐng)域中通常簡稱為“堿基”)修飾或取代。本文所用“未修飾”或“天然”核苷酸包含腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括僅罕見或短暫存在于天然核酸中的核苷酸，例如次黃嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶尤其5-甲基胞嘧啶(亦稱為5-甲基-2'脫氧胞嘧啶，且本領(lǐng)域通常稱為5-Me-C)、5-羥甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龍膽二糖基(gentobiosyl) HMC，以及合成核苷酸，例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、 2_(氨基烷基氨基)腺嘌呤或其它雜取代烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶、8-氮鳥嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤、N6 (6-氨基己基)腺嘌呤和2，6- 二氨基嘌呤。(Kornberg，A. ,DNAReplication, W. H. Freeman&Co.，San Francisco，1980，第 75-77 頁；Gebeyehu, G.，(1987)等 Nucl. Acids Res. 15 :4513)?？砂绢I(lǐng)域已知的“通用，，堿基，例如肌苷。已表明5-Me-C取代使核酸雙鏈體穩(wěn)定性增加0. 6-1. 2V (Sanghvi，Y. S.，in Crooke, S. Τ.禾口 Lebleu, B.，主編.,Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993，第276-278頁)，且是當(dāng)前優(yōu)選的堿基取代。本發(fā)明寡核苷酸的另一種修飾涉及將增強(qiáng)寡核苷酸的活性或細(xì)胞吸收的一個(gè)或多個(gè)部分或綴合物與寡核苷酸化學(xué)連接。這樣的部分包括但不限于脂部分，例如膽固醇部分、膽留烯基部分(Letsinger 等，(1989) Proc. Natl. Acad. ki. USA 86，6553)，膽酸 (Manoharan 等.(1994)Bioorg. Med. Chem. Let. 4，1053)，硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醚 (Manoharan 等(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660,306 ；Manoharan 等(1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3，2765)，硫膽固醇(Oberhauser 等，(1992) Nucl. Acids Res. 20，533)，脂肪鏈例如十二烷二醇(dodecandiol)或^^一基殘基(Saison-Behmoaras 等EMBO J. 1991，10，111 ；Kabanov 等(1990)FEBS Lett. 259,327 ;Svinarchuk 等(1993)Biochimie 75，49)，磷脂例如雙十六基-rac-甘油或1，2- 二 -O-十六基_rac_甘油基-3_Η_膦酸三乙銨(Manoharan等(1995) Tetrahedron Lett. 36，3651 ;Shea 等(1990) Nucl. Acids Res. 18，3777)，聚胺或聚乙二醇鏈(Manoharan 等(1995) Nucleosides&Nucleotides，14，969)，或金剛烷乙酸(Manoharan 等 (1995) Tetrahedron Lett. 36，3651)。包含親脂部分的寡核苷酸和用于制備這種寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，例如美國專利號5，138，045,5, 218，105和5，459，255。給定寡核苷酸的所有位置不必被均一地修飾，實(shí)際上可將多于一種的上述修飾整合入單個(gè)寡核苷酸乃至寡核苷酸的單個(gè)核苷中。本發(fā)明還包括是本文之前定義的嵌合寡核苷酸的寡核苷酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸分子與另一部分綴合，該另一部分包括但不限于脫堿基核苷酸、聚醚、聚胺、聚酰胺、肽、糖類、脂或聚烴化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，這些分子可連接到任何核苷酸中的一個(gè)或多個(gè)，所述核苷酸在糖、堿基或磷酸基的若干位置上包含所述核酸分子。本發(fā)明使用的寡核苷酸可合宜且常規(guī)地通過固相合成的公知技術(shù)制備。用于這種合成的設(shè)備由包括Applied Biosystems在內(nèi)的若干供應(yīng)商出售。也可利用用于這種合成的任何其它方法；寡核苷酸的實(shí)際合成完全落入本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技能中。同樣公知的是，利用類似技術(shù)制備其它寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和烷基化衍生物。同樣公知的是， 利用類似技術(shù)和市售修飾amidite和可控孔度玻璃(controlled-pore glass, CPG)產(chǎn)品， 例如生物素、熒光素、吖啶或補(bǔ)骨脂素修飾的amidite和/或CPG (可獲自Glen Research, Sterling VA)，以合成熒光標(biāo)記的、生物素化的或其它修飾寡核苷酸，例如膽固醇修飾的寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，使用修飾例如使用LNA單體以增強(qiáng)作用的功效、特異性和持續(xù)時(shí)間和拓寬寡核苷酸的給藥途徑，寡核苷酸由例如MOE、ANA、FANA、PS等當(dāng)前化學(xué)物質(zhì)組成 (Uhlman,等(2000) Current Opinions in Drug Discovery&Development 第 3 卷第 2 期)。 這可通過用LNA單體取代當(dāng)前寡核苷酸中的一些單體來實(shí)現(xiàn)。LNA修飾寡核苷酸可具有與母體化合物相似的大小，或者可較大或優(yōu)選較小。優(yōu)選地，這種LNA修飾寡核苷酸包含少于約70%、更優(yōu)選少于約60%、最優(yōu)選少于50%的LNA單體，且它們的大小為約5_25個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為約12-20個(gè)核苷酸。優(yōu)選的修飾寡核苷酸骨架包括但不限于具有正常3' -5'鍵的硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、包括3'烯化膦酸酯和手性膦酸酯在內(nèi)的甲基和其它烷基膦酸酯、亞膦酸酯、包括3'-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯在內(nèi)的氨基磷酸酯、硫羰氨基磷酸酯、硫羰烷基磷酸酯、硫羰烷基磷酸三酯和硼烷基磷酸酯(boranophosphate)，它們的2' -5'連接的類似物，和具有反向極性的骨架，其中相鄰對的核苷單位為3' -5'連接至5' -3'或2' -5'連接至5' -2'。還包括多種鹽、 混鹽和游離酸形式。教導(dǎo)上述含磷鍵制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號3，687，808、 4，469，863,4，476，301,5，023，243,5，177，196,5，188，897,5，264，423,5，276，019, 5，278，302、5，286，717、5，321，131、5，399，676、5，405，939、5，453，496、5，455，233、 5，466，677、5，476，925、5，519，126、5，536，821、5，541，306、5，550，111,5, 563，253、 5，571，799,5, 587，361和5，625，050，上述專利各通過引用結(jié)合到本文中。不含磷原子的優(yōu)選修飾寡核苷酸骨架具有由下述鍵組成的骨架短鏈烷基或環(huán)烷基核苷間鍵、混合雜原子和烷基或環(huán)烷基核苷間鍵或者一個(gè)或多個(gè)短鏈雜原子或雜環(huán)的核苷間鍵。它們包括具有嗎啉代鍵(部分地由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物、亞砜和砜骨架；甲酰乙?；土虼柞Ｒ阴；羌埽粊喖谆柞Ｒ阴；土虼柞Ｒ阴；羌?；含鏈烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亞甲基亞氨基和亞甲基胼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和具有混N、0、S和CH2成分的其它骨架。教導(dǎo)上述寡核苷制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5，034，506、 5，166，315,5，185，444,5，214，134,5，216，141,5，235，033,5，264，562,5，264，564, 5，405，938,5，434，257,5，466，677,5，470，967,5，489，677,5，541，307,5，561，225, 5，596，086,5，602，240,5，610，289,5，602，240,5，608，046,5，610，289,5，618，704,5，623，070,5, 663，312,5, 633，360,5, 677，437 和 5，677，439，上述專利各通過引用結(jié)合到
本文中。在其它優(yōu)選的寡核苷酸模擬物中，核苷酸單位的糖和核苷間鍵(即骨架)均為新的基團(tuán)所取代。維持堿基單元以與適當(dāng)?shù)暮怂岚谢衔镫s交。一種這樣的寡聚化合物，即已表明具有優(yōu)異的雜交性質(zhì)的寡核苷酸模擬物被稱為肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被取代為含酰胺的骨架，特別是氨基乙基甘氨酸骨架。核堿基被保留，并直接或間接與骨架的酰胺部分的氮雜氮原子結(jié)合。教導(dǎo)PNA化合物制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號5，539，082,5, 714，331和5，719，262，上述專利各通過引用結(jié)合到本文中。PNA化合物的更多教導(dǎo)可參見Nielsen，等(1991) kience 254，1497-1500。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有雜原子骨架的寡核苷，雜原子骨架特別是-CH2-NH-0-CH2-、稱為亞甲基(甲基亞氨基)或 MMI 骨架的-CH2-N_)-0-CH2-、-CH2-0-N(CH3)-CH2-, -CH2N (CH3)-N (CH3) CH2-和-O-N(CH3)-CH2-CH2-，其中天然磷酸二酯骨架表示為上文引用的美國專利號 5，489，677的-0-P-0-CH2-以及上文引用的美國專利號5，602，240的酰胺骨架。還優(yōu)選的是具有上文引用的美國專利號5，034，506的嗎啉代骨架結(jié)構(gòu)的寡核苷酸。修飾寡核苷酸還可包含一個(gè)或多個(gè)取代糖部分。優(yōu)選的寡核苷酸在2'位置包含下述基團(tuán)之一 0H ；F ；0-、S-、或N-烷基；0-、S-或N-烯基；0-、S-或N-炔基；或者0烷基-0-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的C到CO烷基(C to CO alkyl)或 C2 到 CO 烯基和炔基(C2 to CO alkenyl and alkynyl)。特別優(yōu)選 0 (CH2) n0mCH3、0 (CH2) η，0CH3、0(CH2)ηΝΗ2、0(CH2)nCH3、0(CH2)n0NH2 和 0(CH2n0N(CH2)nCH3) 2，其中 η 和 m 可以是1-約10。其它優(yōu)選的寡核苷酸在2'位置包含下述基團(tuán)之一C到CO (C to CO)、低級烷基、取代低級烷基、烷芳基、芳烷基、0-烷芳基或0-芳烷基、SH、SCH3、0CN、Cl、Br、CN、CF3、 0CF3、S0CH3、S02CH3、0N02、N02、N3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代甲硅烷基、RNA切割基、報(bào)道基、嵌入劑、用于改進(jìn)寡核苷酸的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)或用于改進(jìn)寡核苷酸的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)以及其它具有類似性質(zhì)的取代基。優(yōu)選的修飾包括2'-甲氧基乙氧基O' -0-CH2CH20CH3，亦稱為2' _0_(2-甲氧乙基)或2‘ -Μ0Ε) (Martin 等，(199 Helv. Chim. Acta，78，486-504)，即一種烷氧基烷氧基。另一優(yōu)選的修飾包括下文實(shí)施例所述的2' -二甲基氨基氧基乙氧基(即0(CH2)20N(CH3)2基，亦稱為 2' -DMA(E)和2' -二甲基氨基乙氧基乙氧基(本領(lǐng)域亦稱為2' _0_ 二甲基氨基乙氧基乙基或 2 ‘ -DMAE0E)，即 2 ‘ -0-CH2-0-CH2-N (CH2) 2。其它優(yōu)選的修飾包括2 ‘-甲氧基O ‘ -0CH3)、2 ‘-氨基丙氧基 (2' -0CH2CH2CH2NH2)和2 ‘-F)。類似修飾也可在寡核苷酸的其它位置上進(jìn)行，尤其是3'末端核苷酸的糖的3'位置或2' -5'連接的寡核苷酸中和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸還可具有糖模擬物，例如取代呋喃戊糖基糖的環(huán)丁基部分。教導(dǎo)這種修飾糖結(jié)構(gòu)制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號4，981，957,5, 118，800、 5，319，080,5，359，044,5，393，878,5，446，137,5，466，786,5，514，785,5，519，134, 5，567，811、5，576，427、5，591，722、5，597，909、5，610，300、5，627，053、5，639，873、 5，646，265,5, 658，873,5, 670，633和5，700，920，上述專利各通過引用結(jié)合到本文中。寡核苷酸還可包含核堿基(本領(lǐng)域中通常簡稱為“堿基”)修飾或取代。本文所用“未修飾”或“天然”核苷酸包括嘌呤堿基腺嘌呤(A)和鳥嘌呤(G)，以及嘧啶堿基胸腺嘧啶 (T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修飾核苷酸包括其它合成和天然核苷酸，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羥甲基胞嘧啶，黃嘌呤，次黃嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-鹵基尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫尿嘧啶，8-鹵基、8-氨基、8-硫醇、8-硫烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤，5-鹵基尤其5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鳥嘌呤(7-methylquanine)和7_甲基腺嘌呤，8_氮鳥嘌呤和 8-氮腺嘌呤，7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮腺嘌呤，以及3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。此外，核苷酸包括美國專利號3，687，808披露的核苷酸、“The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering，，，第 858-859 頁，Kroschwitz, J.I.主編，John Wiley&Sons，1990 披露的核苷酸、Englisch 等，“Angewandle Chemie，國際版”，1991，30，第 613 頁披露的核苷酸和 Sanghvi，Y. S.，第 15 章，“Antisense Research and Applications，，，第 289-302 頁，Crooke, S. Τ.和 Lebleu，B. ea.，CRC Press, 1993 披露的核苷酸。這些核苷酸中的一些尤其可用于提高本發(fā)明寡聚化合物的結(jié)合親和力。它們包括5-取代嘧啶、6-氮嘧啶和N-2、N-6和0-6取代嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已表明5-甲基胞嘧啶取代使核酸雙鏈體穩(wěn)定性提高 0. 6-1. 2°C (Sanghvi,Y. S. >Crooke,S. Τ.禾口 Lebleu,B.,主編，‘Antisense Research and Applications'，CRC Press,Boca Raton，1993，第 276-278 頁)，且是當(dāng)前優(yōu)選的堿基取代， 當(dāng)與2' -0甲氧乙基糖修飾結(jié)合時(shí)尤其更為優(yōu)選。教導(dǎo)上述修飾核苷酸以及其它修飾核苷酸制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號 3，687，808 以及 4，845，205,5, 130，302,5, 134，066,5, 175，273,5, 367，066、 5，432，272、5，457，187、5，459，255、5，484，908、5，502，177、5，525，711、5，552，540、 5，587，469,5, 596，091,5, 614，617,5, 750，692 和 5，681，941，上述專利各通過引用結(jié)合到
本文中。本發(fā)明寡核苷酸的另一種修飾涉及將增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞吸收的一個(gè)或多個(gè)部分或綴合物與寡核苷酸化學(xué)連接。這樣的部分包括但不限于脂部分，例如膽固醇部分(Letsinger等，(1989)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86，6553-6556)，膽酸(Manoharan 等，(1994) Bioorg. Med. Chem. Let.， 4，1053-1060)，硫醚例如己基-S-三苯甲基硫醚(Manoharan 等，(1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. ,660,306-309 ；Manoharan 等，(1993) Bioorg. Med. Chem. Let. , 3, 2765-2770),
膽固醇(Oberhauser 等，(1992) Nucl. Acids Res.，20，533-538)，脂肪鏈例如十二燒
二醇(dodecandiol)或 ^--基殘基(Kabanov 等，(1990)FEBS Lett.，259，327-330 ；
Svinarchuk 等，(1993)Biochimie 75，49-54)，磷脂例如二-十六基-rac-甘油或 1， 2- 二 -0-十六基-rac-甘油基-3-H-膦酸三乙銨(Manoharan 等，(1995) Tetrahedron Lett.，36，3651-3654 ;Shea 等，(1990) Nucl. Acids Res.，18，3777-3783)，聚胺或聚乙二 醇鏈(Mancharan 等，(1995)Nucleosides&Nucleotides，14，969-973)，或金剛燒乙酸(Manoharan 等，(1995) Tetrahedron Lett.，36，3651-3654)，棕櫚基部分(Mishra 等， (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237)，或者十八烷基胺或己氨基-羰基_t羥膽固醇部分(Crooke 等，(1996) J. Pharmacol. Exp. Ther.，277，923-937)。 教導(dǎo)這種寡核苷酸綴合物制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利
號4，828，979,4, 948，882,5,218，105,5,525，465、5，541，313、5，545，730.、5:’ 552,,538、5，578，717,5,580，731,5,580，731,5,591，584、5:’ 109，124、5，118，802、5，138，045、5，414，077,5，486，603,5，512，439,5,578，718、5:’ 608，046、4，587，044、4，605，735、4，667，025,4，762，779,4，789，737,4，824，941,4:,835，263、4，876，335、4，904，582、4，958，013,5,082，830,5，112，963,5，214，136、5:’ 082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022,5，254，469,5，258，506,5，262，536、5:,272，250、5，292，873、5，317，098、5，371，241,5,391，723,5,416，203,5,451，463,5;,510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552,5,567，810,5,574，142,5,585，481,5;,587，371、5，595，726、5，597，696、
5，599，923,5, 599，928和5，688，941，上述專利各通過引用結(jié)合到本文中。藥物發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的化合物也可應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)和靶標(biāo)驗(yàn)證領(lǐng)域。本發(fā)明包括在藥物發(fā)現(xiàn)工作中利用本文鑒定的化合物和優(yōu)選的靶區(qū)段以闡明在紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸和疾病狀態(tài)、表型或狀況之間存在的關(guān)系。這些方法包括檢測或調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素 (EPO)多核苷酸，包括將樣品、組織、細(xì)胞或生物體與本發(fā)明的化合物接觸，治療后一定時(shí)間測量紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的核酸或蛋白水平和/或相關(guān)表型或化學(xué)終點(diǎn)，并任選地將測量值與未治療樣品或用本發(fā)明另一化合物治療的樣品作比較。這些方法也可與其它實(shí)驗(yàn)平行或聯(lián)合進(jìn)行，以測定靶標(biāo)驗(yàn)證過程的未知基因的功能，或者測定作為治療或預(yù)防特定疾病、狀況或表型的靶標(biāo)的特定基因產(chǎn)物的有效性。評價(jià)基因表達(dá)的上調(diào)或抑制外源核酸到宿主細(xì)胞或生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)移可通過直接檢測細(xì)胞或生物體中核酸的存在情況而評價(jià)。這種檢測可通過本領(lǐng)域公知的若干方法完成。例如，外源核酸的存在情況可通過DNA印跡或通過利用特異擴(kuò)增與該核酸相關(guān)的核苷酸序列的引物的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)來檢測。外源核酸的表達(dá)也可利用包括基因表達(dá)分析在內(nèi)的常規(guī)方法測量。 例如，從外源核酸產(chǎn)生的mRNA可利用RNA印跡和反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)檢測和定量分析。來自外源核酸的RNA表達(dá)也可通過測量酶活性或報(bào)道蛋白活性來檢測。例如，反義調(diào)節(jié)活性可間接測量為靶核酸表達(dá)的減少或增加，其作為外源核酸正在產(chǎn)生效應(yīng)RNA的指示。基于序列保守，可設(shè)計(jì)并利用引物擴(kuò)增靶基因的編碼區(qū)。首先，可使用各基因的最高表達(dá)的編碼區(qū)建立模型對照基因，但是可使用任何編碼或非編碼區(qū)。通過將各個(gè)編碼區(qū)插入報(bào)道編碼區(qū)和其poly(A)信號之間來裝配各對照基因。這些質(zhì)粒將產(chǎn)生在基因的上游部分帶有報(bào)道基因的mRNA和3'非編碼區(qū)中的潛在RNAi靶標(biāo)。個(gè)體反義寡核苷酸的有效性通過報(bào)道基因的調(diào)節(jié)而測定?？捎糜诒景l(fā)明方法的報(bào)道基因包括乙酰羥酸合酶(AHAS)、堿性磷酸酶(AP)、β半乳糖苷酶(LacZ)、β葡糖醛酸糖苷酶(beta glucoronidase，⑶S)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白(RFP)、黃色熒光蛋白(YFP)、青色熒光蛋白(CFP)、辣根過氧化物酶(HRP)、熒光素酶(Luc)、胭脂氨酸合酶(N0Q、章魚堿合酶(0CQ和其衍生物。可利用多種選擇標(biāo)記，其賦予對氨芐青霉素、博來霉素、氯霉素、慶大霉素、潮霉素、卡那霉素、林可霉素、氨甲蝶呤、膦絲菌素、嘌呤霉素和四環(huán)素的抗性。測定報(bào)道基因的調(diào)節(jié)的方法是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于熒光測定法(例如熒光光譜法、熒光活化細(xì)胞分選(FACS)、熒光顯微術(shù))、抗生素抗性測定。
試劑盒、研究試劑、診斷和治療本發(fā)明的化合物可用來診斷、治療和預(yù)防，和作為研究試劑和試劑盒的組分。此外，能夠以極高的特異性抑制基因表達(dá)的反義寡核苷酸常常為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所使用，以闡明特定基因的功能或區(qū)分生物途徑的不同成員的功能。對于在試劑盒和診斷以及多種生物系統(tǒng)中的使用，本發(fā)明的化合物單獨(dú)或與其它化合物或治療藥聯(lián)合，可用作差別分析和/或組合分析中的工具，以闡明細(xì)胞和組織中表達(dá)的基因的部分或完整互補(bǔ)序列的表達(dá)模式。本文所用術(shù)語“生物系統(tǒng)”或“系統(tǒng)”定義為表達(dá)或使之有能力表達(dá)紅細(xì)胞生成素 (EPO)基因產(chǎn)物的任何生物體、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或組織。它們包括但不限于人、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物、組織、異種移植物、移植體及其組合。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，將用一種或多種反義化合物治療的細(xì)胞或組織中的表達(dá)模式與未用反義化合物治療的對照細(xì)胞或組織作比較，對所產(chǎn)生模式分析基因表達(dá)的差別水平，因?yàn)樗鼈兝缗c受檢基因的疾病關(guān)聯(lián)性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、細(xì)胞定位、表達(dá)水平、大小、 結(jié)構(gòu)或功能有關(guān)?？稍谄渌绊懕磉_(dá)模式的化合物存在或不存在的情況下對刺激或未刺激的細(xì)胞進(jìn)行這些分析。本領(lǐng)域已知的基因表達(dá)分析方法的實(shí)例包括DNA陣列或微陣列(Brazma和Vilo， (2000) FEBS Lett.，480，17-24 ;Celis，等，(2000) FEBS Lett.，480，2-16)、SAGE (基因表達(dá)序列分析)(Madden，等，Q000)Drug Discov. iToday, 5，415-425)、READS (消化 cDNA 的限制酶擴(kuò)增)(Prashar 和 Weissman，(1999)Methods Enzymo 1.，303，258-72)、TOGA (總基因表達(dá)分析)(Sutcliffe,等，(2000)Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，97，1976-81)、蛋白質(zhì)陣列和蛋白質(zhì)組學(xué)(Celis，等，(2000)FEBS Lett.，480，2-16 Jungblut，等，Electrophoresis, 1999，20，2100-10)、表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)測序(Celis，等，F(xiàn)EBS Lett.，2000，480，2-16 ； Larsson,等，J. Biotechnol.，2000，80，143-57)、消減式 RNA 指紋分析(subtractive RNA fingerprinting, SuRF) (Fuchs,等，(2000)Anal. Biochem. 286,91-98 ；Larson,等，(2000) Cytometry 41，203-208)、消減式克隆(subtractive cloning)、差別顯示(DD) (Jurecic 和 Belmont，(2000) Curr. Opin. Microbiol. 3，316-21)、比較基因組雜交(Carull i,等， (1998) J. Cell Biochem. Suppl.，31，286-96)、FISH(熒光原位雜交)技術(shù)(Going 和 Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35,1895-904)和質(zhì)譜分析法(To, Comb. (2000) Chem. High Throughput Screen,3,235-41)。本發(fā)明的化合物可用于研究和診斷，因?yàn)檫@些化合物與編碼紅細(xì)胞生成素(EPO) 的核酸雜交。例如，作為有效的紅細(xì)胞生成素(EPO)調(diào)節(jié)劑以本文公開的這種有效性和在這樣的條件下雜交的寡核苷酸在有助于基因擴(kuò)增或檢測的條件下分別是有效的引物或探針。這些引物和探針可用于需要特異性檢測編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)的核酸分子的方法和用于檢測的所述核酸分子的擴(kuò)增，或者用于紅細(xì)胞生成素(EPO)的其它研究。本發(fā)明的反義寡核苷酸(尤其是引物和探針)與編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)的核酸的雜交可通過本領(lǐng)域已知方法檢測。這樣的方法可包括酶與寡核苷酸的綴合、放射性標(biāo)記寡核苷酸或任何其它適當(dāng)?shù)臋z測方法。也可制備利用這種檢測方法檢測樣品中紅細(xì)胞生成素(EPO)水平的試劑
品.ο本領(lǐng)域技術(shù)人員還為治療用途控制反義的特異性和靈敏度。在動(dòng)物(包括人)的疾病狀態(tài)治療中已使用反義化合物作為治療部分。已將反義寡核苷酸藥物安全有效地給予人，多種臨床試驗(yàn)?zāi)壳罢谶M(jìn)行中。因此確定的是，反義化合物可以是有用的治療方式，其可被設(shè)計(jì)用于治療細(xì)胞、組織和動(dòng)物(尤其人)的治療方案。對于治療，通過給予本發(fā)明的反義化合物來治療動(dòng)物，優(yōu)選人，所述動(dòng)物疑似患有可通過調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的表達(dá)而治療的疾病或病癥。例如，在一個(gè)非限制性實(shí)施方案中，方法包括將治療有效量的紅細(xì)胞生成素(EPO)調(diào)節(jié)劑給予需要治療的動(dòng)物的步驟。本發(fā)明的紅細(xì)胞生成素(EPO)調(diào)節(jié)劑有效調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素(EPO)的活性，或者調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素(EPO)蛋白的表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比對照，動(dòng)物中紅細(xì)胞生成素(EPO)的活性或表達(dá)被抑制約10%。優(yōu)選地，動(dòng)物中紅細(xì)胞生成素(EPO)的活性或表達(dá)被抑制約30%。更優(yōu)選地，動(dòng)物中紅細(xì)胞生成素(EPO)的活性或表達(dá)被抑制50%以上。因此，相比對照，寡聚化合物對紅細(xì)胞生成素(EPO)mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)為至少10%、至少50%、 至少25%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或100%。在一個(gè)實(shí)施方案中，相比對照，動(dòng)物中紅細(xì)胞生成素(EPO)的活性或表達(dá)被提高約10%。優(yōu)選地，動(dòng)物中紅細(xì)胞生成素(EPO)的活性或表達(dá)被提高約30%。更優(yōu)選地，動(dòng)物中紅細(xì)胞生成素(EPO)的活性或表達(dá)被提高50%以上。因此，相比對照，寡聚化合物對紅細(xì)胞生成素(EPO)mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)為至少10%、至少50%、至少25%、至少30%、至少40%、 至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98%、至少99%或100%。例如，紅細(xì)胞生成素(EPO)表達(dá)的減少可在動(dòng)物的血清、血液、脂肪組織、肝臟或任何其它體液、組織或器官中利用文獻(xiàn)中所述方法和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法測量。優(yōu)選地，包含在待分析的所述體液、組織或器官中的細(xì)胞包含編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)肽的核酸分子和/或紅細(xì)胞生成素(EPO)蛋白自身。通過將有效量的化合物加入合適的藥學(xué)上可接受的稀釋劑或載體中，本發(fā)明的化合物可用于藥物組合物。本發(fā)明的化合物和方法也可用于預(yù)防用途。綴合物本發(fā)明寡核苷酸的另一種修飾涉及將增強(qiáng)寡核苷酸的活性、細(xì)胞分布或細(xì)胞吸收的一種或多種部分或綴合物與寡核苷酸化學(xué)連接。這些部分或綴合物可包括共價(jià)連接功能性基團(tuán)的綴合基，例如伯羥基或仲羥基。本發(fā)明的綴合基包括嵌入劑、報(bào)道分子、聚胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增強(qiáng)寡聚體的藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)和增強(qiáng)寡聚體藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)。典型的綴合基包括膽固醇、脂類、磷脂、生物素、吩嗪、葉酸、菲啶、蒽醌、吖啶、熒光素、羅丹明、香豆素和染料。本發(fā)明上下文中增強(qiáng)藥效學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括提高吸收、增強(qiáng)降解抗性和/或加強(qiáng)與靶核酸的序列特異性雜交的基團(tuán)。本發(fā)明上下文中增強(qiáng)藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的基團(tuán)包括改善本發(fā)明化合物的吸收、分布、新陳代謝或排出的基團(tuán)。代表性綴合基披露于1992年10月23日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US92/09196和美國專利號6，觀7，860， "Antisense inhibition of MEKK2 expression(MEKK2 表達(dá)的反義抑制)”，二者通過引用結(jié)合到本文中。綴合部分包括但不限于脂部分例如膽固醇部分，膽酸，硫醚例如己基-5-三苯甲基硫醚，硫膽固醇，脂肪鏈例如十二烷二醇或十一基殘基，磷脂例如二 -十六基-rac-甘油或1，2- 二 -0-十六基-rac-甘油基_3_H膦酸三乙銨，聚胺或聚乙二醇鏈，或金剛烷乙酸，棕櫚基部分，或十八烷基胺或己氨基-羰基-氧基膽固醇部分。本發(fā)明的寡核苷酸還可與活性藥物綴合，活性藥物例如阿斯匹林、華法林、苯基丁氮酮、布洛芬、舒洛芬、 芬布芬、酮洛芬、(S)_(+)_普拉洛芬、卡洛芬、丹磺酰肌氨酸、2，3，5_三碘苯甲酸、氟芬那酸、亞葉酸、苯并噻二嗪(benzothiadiazide)、氯噻嗪、二氮雜、吲哚美辛(indomethicin)、 巴比妥類藥物、頭孢菌素、磺胺藥、抗糖尿病藥、抗菌藥或抗生素。 教導(dǎo)這種寡核苷酸綴合物制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利
號4，828，979,4, 948，882,5,218，105,5,525，465、5，541，313、5，545，730、5:’ 552,,538、5，578，717,5,580，731,5,580，731,5,591，584,5’ 109，124、5，118，802、5，138，045、5，414，077,5,486，603,5，512，439,5，578，718,5，608，046、4，587，044、4，605，735、4，667，025,4，762，779,4，789，737,4，824，941,4:’ 835，263、4，876，335、4，904，582、4，958，013,5,082，830,5，112，963,5，214，136、5:,082，830、5，112，963、5，214，136、5，245，022,5，254，469,5,258，506,5,262，536,5;,272，250、5，292，873、5，317，098、5，371，241,5，391，723,5，416，203,5，451，463,5;,510，475、5，512，667、5，514，785、5，565，552,5，567，810,5,574，142,5,585，481,5’ 587，371、5，595，726、5，597，696、
5，599，923,5, 599，928 和 5，688，941。制劑本發(fā)明的化合物還可與其它分子、分子結(jié)構(gòu)或化合物混合物一起混合、包封、綴合或者以其它方式關(guān)聯(lián)，作為例如脂質(zhì)體、靶向受體的分子、口服、直腸、局部或其它制劑，以幫助攝取、分布和/或吸收。教導(dǎo)這種幫助攝取、分布和/或吸收的制劑制備的代表性美國專利包括但不限于美國專利號 5，108，921,5, 354，844,5, 416，016,5, 459，127,5, 521，291、
5，543，165、5，547，932、5，583，020,5，591，721,4,426，330,4,534，899、5，013，556、5，108，921、5，213，804、5，227，170,5,264，221,5，356，633,5,395，619、5，416，016、5，417，978、5，462，854、5，469，854,5，512，295,5，527，528,5，534，259、5，543，152、
5，556，948,5, 580，575和5，595，756，上述專利各通過引用結(jié)合到本文中。雖然反義寡核苷酸不必在載體情況中給予以調(diào)節(jié)靶標(biāo)表達(dá)和/或功能，但是本發(fā)明的實(shí)施方案涉及用于表達(dá)反義寡核苷酸的表達(dá)載體構(gòu)建體，其包含啟動(dòng)子、雜合啟動(dòng)子基因序列，并具有強(qiáng)的組成性啟動(dòng)子活性或可在所需情況下誘導(dǎo)的啟動(dòng)子活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明實(shí)踐涉及利用適當(dāng)?shù)暮怂徇f送系統(tǒng)給予至少一種前述反義寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，該系統(tǒng)包含與多核苷酸有效連接(operably linked)的非病毒載體。這種非病毒載體的實(shí)例僅包含寡核苷酸(例如SEQ ID NO :3-5中的任何一種或多種)，或包含與適當(dāng)?shù)鞍?、多糖或脂類制備物?lián)合的寡核苷酸。其它合適的核酸遞送系統(tǒng)包括病毒載體，通常為來自腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、 依賴輔助病毒的腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒或日本血凝病毒-脂質(zhì)體(HVJ)復(fù)合體中至少一種的序列。優(yōu)選地，病毒載體包含與多核苷酸有效連接的強(qiáng)真核啟動(dòng)子，例如巨細(xì)胞病毒(CMV) 啟動(dòng)子。其它優(yōu)選載體包括病毒載體、融合蛋白和化學(xué)綴合物。反轉(zhuǎn)錄病毒載體包括莫洛尼鼠白血病病毒和基于HIV的病毒。一種優(yōu)選的基于HIV的病毒載體包含至少兩個(gè)載體， 其中g(shù)ag和pol基因來自HIV基因組，env基因來自另一種病毒。優(yōu)選DNA病毒載體。這些載體包括痘病毒載體例如正痘病毒載體或禽痘病毒載體，皰疹病毒載體例如單純性皰疹 I 型病毒(HSV)載體[Geller, Α. I.等，(1995) J. Neurochem,64 :487 ；Lim, F.，等，載于 DNA Cloning :Mammalian Systems, D.Glover,編(Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995) ；Geller, A. I.等，(1993)Proc Natl. Acad. Sci. :U. S. A. :90 7603 ；Geller, A. I., 等，(1990)Proc Natl. Acad. Sci USA :87 :1149]，腺病毒載體(LeGal LaSalle 等，Science， 259 :988(1993) ；Davidson,等，(1993)Nat. Genet. 3 219 ；Yang,等，(1995) J. Virol. 69 2004)和腺伴隨病毒載體(Kaplitt, Μ. G.，等，(1994)Nat. Genet. 8 :148)。本發(fā)明的反義化合物包括任何藥學(xué)上可接受的鹽、酯或這種酯的鹽，或者任何其它在給予動(dòng)物(包括人)時(shí)能夠提供(直接或間接)其生物活性代謝物或殘余物的化合物。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指本發(fā)明化合物的生理學(xué)和藥學(xué)上可接受的鹽即， 保留母體化合物的所需生物活性且不使其具有不希望的毒理學(xué)作用的鹽。對于寡核苷酸， 藥學(xué)上可接受的鹽及其應(yīng)用的優(yōu)選實(shí)例還參見美國專利號6，觀7，860，其通過引用結(jié)合到本文中。本發(fā)明還包括含有本發(fā)明反義化合物的藥物組合物和制劑。本發(fā)明的藥物組合物可以多種方式給予，視需要局部治療或系統(tǒng)性治療和待治療區(qū)域而定。給藥可以是局部的 (包括眼科和粘膜，包括陰道和直腸遞送)，肺部的例如通過吸入或吹入粉末或氣霧劑(包括通過噴霧器)；氣管內(nèi)的，鼻內(nèi)的，表皮的和透皮的)，口服或胃腸外的。胃腸外給藥包括靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或肌內(nèi)注射或輸注；或顱內(nèi)例如鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥。帶有至少一個(gè)2' -0-甲氧乙基修飾的寡核苷酸被認(rèn)為尤其可用于口服給藥。用于局部給藥的藥物組合物和制劑可包括透皮貼劑、軟膏劑、洗劑、乳膏劑、凝膠劑、滴劑、栓劑、噴霧劑、液體劑和散劑。常規(guī)藥學(xué)載體、水性、粉或油狀基料、增稠劑等可能是必要或所需的。包被避孕套、 手套等也可能是有用的?？珊弦说匾詥挝粍┬痛嬖诘谋景l(fā)明的藥物制劑，可按照制藥工業(yè)中公知的傳統(tǒng)技術(shù)制備。這樣的技術(shù)包括使活性成分與藥學(xué)載體或賦形劑聯(lián)合的步驟。通常，制劑通過使活性成分與液體載體或細(xì)碎的固體載體或者二者均一且緊密地聯(lián)合并視需要將產(chǎn)物成形來制備。本發(fā)明的組合物可配制成多種可能劑型中的任何一種，例如但不限于片劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、液體糖漿劑、軟凝膠劑、栓劑和灌腸劑。本發(fā)明的組合物還可配制為水、非水或混合介質(zhì)中的混懸劑。水混懸劑還可包含增加混懸劑粘度的物質(zhì)，其包括例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇和/或葡聚糖。混懸劑還可包含穩(wěn)定劑。本發(fā)明的藥物組合物包括但不限于溶液劑、乳劑、泡沫劑和含脂質(zhì)體的制劑。本發(fā)明的藥物組合物和制劑可包含一種或多種滲透促進(jìn)劑、載體、賦形劑或其它活性或非活性成分。乳劑一般為一種液體以小滴形式分散在另一種液體中的多相系，小滴直徑通常大于0. 1 μ m。乳劑可包含除分散相外的其它組分和活性藥物，活性藥物可作為水相、油相中的溶液或自身作為分離相存在。還包括微乳狀液作為本發(fā)明的實(shí)施方案。乳劑及其使用是本領(lǐng)域公知的，此外參見美國專利號6，287, 860。本發(fā)明的制劑包括脂質(zhì)體制劑。本發(fā)明所用術(shù)語“脂質(zhì)體”是指由在一個(gè)或多個(gè)球形雙分子層中布置的兩親性脂組成的囊泡。脂質(zhì)體為單層或多層囊泡，其具有由親脂性物質(zhì)形成的膜和含有待遞送組合物的水腔。陽離子脂質(zhì)體為帶正電荷的脂質(zhì)體，其被認(rèn)為與帶負(fù)電荷的DNA分子相互作用形成穩(wěn)定的復(fù)合體。pH敏感或帶負(fù)電荷的脂質(zhì)體被認(rèn)為誘捕DNA，而不是具有它的復(fù)合體。陽離子和非陽離子脂質(zhì)體均已用于遞送DNA到細(xì)胞。
脂質(zhì)體還包括“空間穩(wěn)定”脂質(zhì)體，如本文所用，該術(shù)語是指含有一種或多種特化脂類的脂質(zhì)體。當(dāng)被整合到脂質(zhì)體中時(shí)，這些特化脂類導(dǎo)致脂質(zhì)體相對缺乏這種特化脂類的脂質(zhì)體具有增強(qiáng)的循環(huán)壽命。空間穩(wěn)定脂質(zhì)體的實(shí)例是這樣的脂質(zhì)體其中脂質(zhì)體的形成囊泡的脂部分的一部分包含一種或多種糖脂或用一種或多種親水聚合物衍生，例如聚乙二醇(PEG)部分。脂質(zhì)體及其使用進(jìn)一步參見美國專利號6，觀7，860。
本發(fā)明的藥物制劑和組合物還可包含表面活性劑。表面活性劑在藥物制品、制劑和乳劑中的使用是本領(lǐng)域公知的。表面活性劑及其使用進(jìn)一步參見美國專利號6，287, 860， 其通過引用結(jié)合到本文中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明使用多種滲透促進(jìn)劑，以影響核酸尤其寡核苷酸的有效遞送。除了幫助非親脂性藥物跨細(xì)胞膜的擴(kuò)散外，滲透促進(jìn)劑還增強(qiáng)親脂性藥物的透性。 滲透促進(jìn)劑可歸類為屬于五大類(即表面活性劑、脂肪酸、膽汁鹽、螯合劑和非螯合非表面活性劑)之一。滲透促進(jìn)劑及其使用進(jìn)一步參見美國專利號6，觀7，860，其通過引用結(jié)合到本文中。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，按照制劑的預(yù)期使用(即給藥途徑)常規(guī)設(shè)計(jì)制劑。用于局部給藥的優(yōu)選制劑包括這樣的制劑其中本發(fā)明的寡核苷酸與局部遞送試劑混合，局部遞送試劑例如脂類、脂質(zhì)體、脂肪酸、脂肪酸酯、類固醇、螯合劑和表面活性劑。 優(yōu)選的脂類和脂質(zhì)體包括中性的(例如二油酰-磷脂酰DOPE乙醇胺、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿DMPC、二硬脂酰磷脂酰膽堿)、陰性的(例如二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG)和陽離子型 (例如二油酰四甲氨基丙基DOTAP和二油酰-磷脂酰乙醇胺D0TMA)。對于局部或其它給藥，可將本發(fā)明的寡核苷酸包封到脂質(zhì)體中，或者可與脂質(zhì)體形成復(fù)合體，特別是陽離子型脂質(zhì)體?；蛘?，可將寡核苷酸與脂類尤其陽離子脂類絡(luò)合。優(yōu)選的脂肪酸和酯、其藥學(xué)上可接受的鹽及它們的應(yīng)用進(jìn)一步參見美國專利號6，287, 860。用于口服給藥的組合物和制劑包括散劑或顆粒劑、微粒(microparticulate)、納米顆粒(nanoparticulate)、水或非水介質(zhì)中的混懸劑或溶液劑、膠囊劑、凝膠膠囊劑、小藥囊、片劑或小片。增稠劑、矯味劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或粘合劑可能是所需的。優(yōu)選的口服制劑是這樣的制劑其中本發(fā)明的寡核苷酸與一種或多種滲透促進(jìn)劑、表面活性劑和螯合劑聯(lián)合給予。優(yōu)選的表面活性劑包括脂肪酸和/或其酯或鹽、膽汁酸和/或其鹽。優(yōu)選的膽汁酸/鹽和脂肪酸及它們的使用進(jìn)一步參見美國專利號6，287, 860，其通過引用結(jié)合到本文中。還優(yōu)選滲透促進(jìn)劑的組合，例如脂肪酸/鹽與膽汁酸/鹽聯(lián)合。特別優(yōu)選的組合是十二烷酸、癸酸和UDCA的鈉鹽。其它滲透促進(jìn)劑包括聚氧乙烯-9-十二烷基醚、聚氧乙烯-20-鯨蠟基醚。本發(fā)明的寡核苷酸可以含噴霧干燥顆粒的顆粒形式口服遞送，或絡(luò)合形成微?；蚣{米顆粒。寡核苷酸絡(luò)合劑及其使用進(jìn)一步參見美國專利號6，觀7，860，其通過引用結(jié)合到本文中。干擾RNA的體內(nèi)給藥已載于例如在美國專利號7，528，118,"RNAi modulation of ApoB and uses thereof (ApoB的RNAi調(diào)節(jié)及其應(yīng)用)”，其通過引用以其整體結(jié)合到本文中。用于胃腸外、鞘內(nèi)或心室內(nèi)給藥的組合物和制劑可包括無菌水溶液，該無菌水溶液還可含有緩沖劑、稀釋劑和其它合適添加劑，例如但不限于滲透促進(jìn)劑、載體化合物及其它藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。本發(fā)明的某些實(shí)施方案提供含有一種或多種寡聚化合物和一種或多種其它通過非反義機(jī)制起作用的化療藥物的藥物組合物。這種化療藥物的實(shí)例包括但不限于癌癥化療藥物，例如柔紅霉素、道諾霉素、放線菌素、多柔比星、表柔比星、伊達(dá)比星、依索比星、博來霉素、馬磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氯乙亞硝脲 (bischloroethyl-nitrosurea)、白消安、絲裂霉素C、放線菌素D、光神霉素、潑尼松、羥孕酮、睪酮、他莫昔芬、達(dá)卡巴嗪、丙卡巴胼、六甲蜜胺、五甲密胺、米托蒽醌、安吖啶、苯丁酸氮芥、甲基環(huán)己基亞硝脲(methylcyclohexylnitrosurea)、氮芥、美法侖、環(huán)磷酰胺、6-巰基嘌呤、6-硫鳥嘌呤、阿糖胞苷(cytarabine)、5_氮胞苷、羥基脲、脫氧考福霉素、4_羥基過氧環(huán)磷酰胺、5-氟尿嘧啶(5-FU)、5-氟脫氧尿苷(5-FUdR)、氨甲蝶呤(MTX)、秋水仙堿、泰素 (taxol)、長春新堿、長春堿、依托泊苷(VP-16)、三甲曲沙、伊立替康、托泊替康、吉西他濱、 替尼泊苷、順鉬和己烯雌酚(DES)。當(dāng)與本發(fā)明的化合物一起使用時(shí)，這樣的化療藥物可單獨(dú)使用(例如，5-FU和寡核苷酸)、序貫使用(例如，5-FU和寡核苷酸使用一段時(shí)間后接著用MTX和寡核苷酸)或與一種或多種其它這樣的化療藥物聯(lián)合使用(例如，5-FU、MTX和寡核苷酸，或者5-FU、放射療法和寡核苷酸)?？寡姿幬?包括但不限于非留類抗炎藥物和皮質(zhì)類固醇)和抗病毒藥物(包括但不限于利巴韋林(ribivirin)、阿糖腺苷、阿昔洛韋和更昔洛韋)也可與本發(fā)明的組合物聯(lián)合。反義化合物和其它非反義藥物的組合也落入本發(fā)明的范圍內(nèi)。兩種以上聯(lián)合化合物可同時(shí)或序貫使用。在另一個(gè)相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合物可包含靶向第一核酸的一種或多種反義化合物(尤其寡核苷酸)和靶向第二核酸靶標(biāo)的一種或多種其它反義化合物。例如，第一靶標(biāo)可以是紅細(xì)胞生成素(EPO)的特定反義序列，第二靶標(biāo)可以是來自另一核苷酸序列的區(qū)?；蛘撸景l(fā)明的組合物可包含兩種以上靶向相同紅細(xì)胞生成素(EPO)核酸靶標(biāo)的不同區(qū)的反義化合物。本文闡明了反義化合物的多個(gè)實(shí)例，其它實(shí)例可從本領(lǐng)域已知的合適化合物中選出。兩種以上聯(lián)合化合物可同時(shí)或序貫使用。給藥治療組合物的制劑和它們的后續(xù)用藥(給藥)被認(rèn)為是本領(lǐng)域公知技術(shù)。給藥取決于待治療疾病狀態(tài)的嚴(yán)重性和響應(yīng)性，具有長達(dá)數(shù)天至數(shù)月的治療療程，或者直到實(shí)現(xiàn)治愈或?qū)崿F(xiàn)疾病狀態(tài)的縮減。最佳給藥方案可根據(jù)對患者體內(nèi)蓄積藥物的測量來計(jì)算。 普通技術(shù)人員可容易地測定最佳劑量、給藥方法和重復(fù)率。最佳劑量可視各種寡核苷酸的相對效能而變化，且通常可根據(jù)被認(rèn)為在體外和體內(nèi)動(dòng)物模型中有效的EC50來估計(jì)。通常，劑量為0. 01 μ g-100g每kg體重，并可每天、每周、每月或每年給予一次或多次，或者每 2-20年給予一次。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可容易地根據(jù)測量的藥物在體液或組織中的停留時(shí)間和濃度估計(jì)給藥重復(fù)率。在成功治療后，可能需要患者進(jìn)行維持治療以防止疾病狀態(tài)復(fù)發(fā)，其中以維持劑量給予寡核苷酸，維持劑量為0. 01 μ g-100g每kg體重，每天一次或多次至每20年一次。在劑量放大研究中將核糖核苷酸還原酶反義寡核苷酸給予患有急性骨髓性白血病的患者，參見 Klisovic 等，2008，“Phase I study ofGTI-2040, an antisense to ribonucleotide reductase, in combination with high-dose cytarabine in patients with acute myeloid leukemia(核糖核苷酸還原酶反義物GTI-2040聯(lián)合高劑量阿糖胞苷在急性髓性白血病患者中的I期研究)，”Clin Cancer Research :14(12) :3889_95，其通過引用結(jié)合到本文中。雖然上文已說明本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施方案，應(yīng)當(dāng)理解它們僅提供作為實(shí)施例而非限制。依據(jù)本文公開內(nèi)容可對公開的實(shí)施方案作出多種改變，而不偏離本發(fā)明的精神或范圍。 因此，本發(fā)明的廣度和范圍將不受任何上述實(shí)施方案的限制。本文提及的所有文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中。本申請中引用的所有出版物和專利文獻(xiàn)通過引用結(jié)合到本文中用于所有目的，到與如同各個(gè)體出版物或?qū)＠墨I(xiàn)如此分別表示的相同程度。至于在該文件中對多種參考文獻(xiàn)的引用，申請人不承認(rèn)任何具體參考文獻(xiàn)相對他們的發(fā)明是“現(xiàn)有技術(shù)”。以下實(shí)施例中對發(fā)明組合物和方法的實(shí)施方案進(jìn)行說明。
實(shí)施例以下非限制性實(shí)施例用來闡明本發(fā)明的選定實(shí)施方案。應(yīng)當(dāng)理解，所示組分的比例變化和備選要素對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的，并落入本發(fā)明實(shí)施方案的范圍內(nèi)。實(shí)施例1 設(shè)計(jì)對紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義核酸分子和/或有義鏈特異的反義寡核苷酸如上所指出，術(shù)語“對...特異的寡核苷酸”或“靶向...的寡核苷酸”是指具有下述序列的寡核苷酸其(i)能夠與靶基因的一部分形成穩(wěn)定復(fù)合體，或(ii)能夠與靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄物的一部分形成穩(wěn)定雙鏈體。通過使用自動(dòng)比對核酸序列并指明同一性或同源性區(qū)的計(jì)算機(jī)程序，有助于選擇適當(dāng)?shù)墓押塑账?。這種程序用于比較所得核酸序列，例如通過檢索數(shù)據(jù)庫(例如GenBank) 或通過對PCR產(chǎn)物測序。比較多個(gè)物種的核酸序列使能夠選擇在物種間顯示適當(dāng)?shù)耐恍猿潭鹊暮怂嵝蛄?。在未測序基因的情況下，進(jìn)行DNA印跡以使能夠測定靶物種和其它物種的基因間的同一性程度。通過在不同嚴(yán)格程度下進(jìn)行DNA印跡，如本領(lǐng)域公知的，可獲得同一性的近似測量。這些步驟使能夠選擇這樣的寡核苷酸其對待控制受試者的靶核酸序列表現(xiàn)高度互補(bǔ)性，而對其它物種的對應(yīng)核酸序列表現(xiàn)低度互補(bǔ)性。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，在選擇用于本發(fā)明的適當(dāng)基因區(qū)方面存在相當(dāng)大的自由。當(dāng)反義化合物與靶核酸的結(jié)合干擾靶核酸的正常功能而引起功能和/或活性的調(diào)節(jié)，并存在足夠程度的互補(bǔ)性以避免在需要特異性結(jié)合的條件下(即在體內(nèi)測定或治療性治療情況中的生理?xiàng)l件和體外測定情況中進(jìn)行測定的條件下)該反義化合物與非靶核酸序列非特異性結(jié)合時(shí)，反義化合物是“可特異性雜交的”。本文所述寡核苷酸的雜交性質(zhì)可通過本領(lǐng)域已知的一種或多種體外測定來確定。 例如，本文所述寡核苷酸的性質(zhì)可通過利用解鏈曲線測定來確定靶天然反義物和潛在藥物分子之間的結(jié)合強(qiáng)度而獲得。靶天然反義物和潛在藥物分子(Molecule)之間的結(jié)合強(qiáng)度可利用任何測量分子間相互作用強(qiáng)度的已建立方法(例如解鏈曲線測定)來估計(jì)。解鏈曲線測定法確定天然反義物/Molecule復(fù)合體發(fā)生從雙鏈構(gòu)象到單鏈構(gòu)象的快速轉(zhuǎn)變的溫度。該溫度被廣泛接受為兩分子間相互作用強(qiáng)度的可靠量度。解鏈曲線測定可利用實(shí)際的天然反義RNA分子的cDNA拷貝或相當(dāng)于Molecule的結(jié)合位點(diǎn)的合成DNA或RNA核苷酸進(jìn)行。多種含有用于進(jìn)行該測定的所有必需試劑的試劑盒是可用的(例如Applied Biosystems Inc. MeltDoctor試劑盒)。這些試劑盒包含合適的緩沖溶液，該緩沖溶液含有一種雙鏈DNA (dsDNA)結(jié)合染料(例如ABI HRM染料、STOR Green、SYTO等)。dsDNA染料的性質(zhì)使得它們的游離形式幾乎不發(fā)出熒光，而與dsDNA結(jié)合時(shí)是高度熒光的。為進(jìn)行測定，將cDNA或?qū)?yīng)寡核苷酸與Molecule以由具體制造商的方案規(guī)定的濃度混合。將混合物加熱到95°C以解離所有預(yù)先形成的dsDNA復(fù)合體，之后緩慢冷卻至室溫或試劑盒制造商規(guī)定的其它更低溫度，以使DNA分子能夠退火。然后，將重新形成的復(fù)合體緩慢加熱到95°C，并同時(shí)連續(xù)收集由該反應(yīng)產(chǎn)生的熒光量的數(shù)據(jù)。熒光強(qiáng)度與反應(yīng)中存在的dsDNA量成反比。數(shù)據(jù)采集可利用與試劑盒兼容的實(shí)時(shí)PCR儀器(例如ABI’s StepOne Plus Real Time PCR System或LightTyper instrument, Roche Diagnostics, Lewes,UK)。通過利用適當(dāng)軟件(例如LightTyper(Roche)或 SDS Dissociation Curve, ABI) 將熒光關(guān)于溫度的負(fù)導(dǎo)數(shù)(y軸上的-d(熒光)/dT)對溫度(χ軸)作圖，構(gòu)建解鏈峰。分析數(shù)據(jù)，以鑒定dsDNA復(fù)合體快速轉(zhuǎn)變成單鏈分子的溫度。該溫度稱為Tm，與兩分子間的相互作用強(qiáng)度成正比。通常，Tm大于40°C。實(shí)施例2 =EPO多核苷酸的調(diào)節(jié)在37°C和5% CO2條件下的生長培養(yǎng)基(MEM/raSS(Hyclone目錄號SH300M或 Mediatech 目錄號 MT-IO-OIO-CV) +10% FBS (Mediatech 目錄號 MT35-011-CV) + 青霉素 / 鏈霉素(Mediatech目錄號MT30-002-CI))中培養(yǎng)來自ATCC的H印G2細(xì)胞(目錄號HB-8065)。 在實(shí)驗(yàn)前一天，將細(xì)胞以1. 5XlOVml的密度再次鋪板到6孔板中并在37°C和5% CO2條件下孵育。在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將6孔板中的培養(yǎng)基更換為新鮮生長培養(yǎng)基。將所有反義寡核苷酸稀釋為20 μ M的濃度。將2 μ 1該溶液與400 μ 1 Opti-MEM培養(yǎng)基(Gibco目錄號31985-070) 和 4 μ 1 Lipofectamine 2000 (Invitrogen 目錄號 11668019) —起在室溫下孵育 20 分鐘，并施用到具有HepG2細(xì)胞的6孔板的各孔。含有2 μ 1代替寡核苷酸溶液的水的類似混合物用作模擬轉(zhuǎn)染對照。在37°C和5% CO2條件下孵育3-18小時(shí)后，將培養(yǎng)基更換為新鮮生長培養(yǎng)基。在加入反義寡核苷酸48小時(shí)后，除去培養(yǎng)基，并按照制造商說明書利用!Iomega的SV Total RNA Isolation System(目錄號 Z3105)或 Qiagen 的 RNeasy Total RNA Isolation 試劑盒(目錄號74181)提取細(xì)胞RNA。將600ng RNA加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按制造商方案所述利用Thermo Scientific的Verso cDNA試劑盒(目錄號AB1453B)或High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(目錄號 4368813)進(jìn)行。來自該反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的cDNA用來通過實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測基因表達(dá)，該實(shí)時(shí)PCR利用ABI Taqman Gene Expression Mix (目錄號 4369510)禾口 ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay Hs00171267_ml, Applied Biosystems Inc. , Foster City CA)設(shè)計(jì)的引物 / 探針進(jìn)行。 使用以下PCR循環(huán)50°C 2分鐘、95°C 10分鐘，40個(gè)循環(huán)(95°C 15秒，60°C 1分鐘)，使用 StepOne Plus Real Time PCR Machine(Applied Biosystems)。根據(jù)治療樣品和模擬轉(zhuǎn)染樣品之間的18S-標(biāo)準(zhǔn)化dCt值的差異，計(jì)算在用反義寡核苷酸治療后基因表達(dá)的倍數(shù)變化。用于常規(guī)設(shè)計(jì)Taqman測定EPO天然反義序列EPOAS (SEQ ID NO 2)的引物和探針正向引物序列ACCACCCCGGTGTCAAG(SEQ ID NO 9)反向引物序列TTTACCTGTTTTCGCACCTACCAT(SEQ ID NO :10)
報(bào)道序列CAAGCTGTGACTTCTC (SEQ ID NO: 11)報(bào)道染料1 :FAM結(jié)果實(shí)時(shí)PCR結(jié)果顯示，在用針對印oas設(shè)計(jì)的兩種siRNA處理的4 后顯著提高了 HepG2 細(xì)胞中 EPO mRNA 的水平(印oas_l，P = 0. 02 和印oa_2，P = O. 04，圖 1A)。在相同樣品中，在用針對印oas的siRNA處理后可能降低了印oas RNA的水平(圖1B)。實(shí)施例3 =EPO蛋白產(chǎn)物的體外調(diào)節(jié)對按照實(shí)施例2所述利用EPO反義寡核苷酸治療的H印G2細(xì)胞測定EPO蛋白表達(dá)。 按照制造商說明書，利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(市售，例如Quantikine人紅細(xì)胞生成素，R&DSyStemS，Mirmeap0liS，MN)測定細(xì)胞上清液中存在的人EPO蛋白濃度和分泌水平，并與未轉(zhuǎn)染對照樣品中的水平作比較。實(shí)施例4 =ICGN小鼠中EPO多核苷酸和蛋白產(chǎn)物的調(diào)節(jié)將對EPO-AS特異的反義寡核苷酸給予基因貧血小鼠模型ICGN(ICR衍生腎小球腎炎)小鼠，并監(jiān)測貧血癥的改善。參見例如Nagasaki，等，2009，“Amelioration of Anemia in the ICGN Mouse,a Renal Anemia Model, with a Subcutaneous Bolus Injection of Erythropoietin Adsorbed to Hydroxyapatite Matrix ( ^TicfiiiIi11IPiiW 紅細(xì)胞生成素改善腎貧血模型ICGN小鼠的貧血癥)，”J. Vet. Med. Sci. 71 (10) 1365-1371， 通過引用結(jié)合到本文中。通過使用27G針進(jìn)行的尾靜脈注射給予寡核苷酸。將推注給藥的反義寡核苷酸(SEQ ID NO :3、4和幻溶于PBS，濃度使得遞送的預(yù)期劑量為8ul/g體重。在給藥前，將小鼠在紅外燈下保持約3分鐘以易于注射。僅給予對照小鼠相同體積的PBS。在給藥的數(shù)天前，通過采集4-7滴尾靜脈血而采集預(yù)先治療的血樣。在用(X)2或醚麻醉的情況下，從腔靜脈采集血樣，并用于血液學(xué)分析。如前所述，通過RT-PCR測定來測量EPO mRNA水平。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)利用Human EPO ELISA Kit (可獲自例如 Quantikine 人紅細(xì)胞生成素，R&D Systems，Minneapolis，MN 或 Memcell Technologies, Vancouver,BC,Canada)進(jìn)行，以測定血漿rhEPO濃度。按照使用手冊使用自動(dòng)計(jì)數(shù)器(KX-21NV ；Sysmex,Kobe, Japan)進(jìn)行血液學(xué)分析。在用Brecher，s New Methylene Blue Solution染色的載玻片上的血涂片中對網(wǎng)織紅細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并計(jì)算網(wǎng)織紅細(xì)胞的比。將RBC數(shù)量、血紅蛋白濃度、血細(xì)胞比容值和持續(xù)比(sustaining rate)作為造血作用的持續(xù)功效評價(jià)，持續(xù)比是第21天的值對第0天的值的比。通過過量醚吸入處死小鼠，對它們的摘出肝臟、腎臟和脾稱重。將肝、脾和皮下組織固定到10%中性緩沖甲醛中，并在蘇木精和伊紅染色后進(jìn)行組織病理學(xué)分析。實(shí)施例5 貧血癥患者的EPO多核苷酸和蛋白產(chǎn)物的調(diào)節(jié)用EPO反義寡核苷酸治療貧血癥患者。通過靜脈內(nèi)輸注以每周一至五次5mg/kg 的比率將反義寡核苷酸(SEQ ID而3、4和幻給予患者。通過標(biāo)準(zhǔn)分光光度測定定期(例如每周一次)測量血紅蛋白。視不同周觀察的血紅蛋白水平的相對變化，相應(yīng)調(diào)節(jié)治療。 隨著在任何2周的時(shí)間段內(nèi)血紅蛋白接近12g/dL，或者增加多于lg/dL，減少劑量。(參見例如Epogen 包裝說明書中的紅細(xì)胞生成素給藥指南，可獲自http://www. epoRen. com/ pdf/epoRen pi. pdf，通過引用結(jié)合到本文中。)測定了 EPO蛋白和mRNA的表達(dá)。按照制造商說明書，利用酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(市售，例如 Quantikine 人紅細(xì)胞生成素，R&D Systems,Minneapolis,MN) 測定人EPO蛋白濃度和分泌水平。如本文它處所述，利用RT-PCR測定mRNA水平。雖然已參照一種或多種實(shí)現(xiàn)方式對本發(fā)明進(jìn)行了解釋和說明，但是在閱讀和理解本說明書和附圖后，本領(lǐng)域技術(shù)人員會想到等價(jià)的改變和變化。此外，雖然可能已經(jīng)僅參照若干實(shí)現(xiàn)方式之一公開了本發(fā)明的某具體特征，但是該特征可與其它實(shí)現(xiàn)方式的一個(gè)或多個(gè)其它特征聯(lián)合，因?yàn)閷θ魏谓o定或具體應(yīng)用可能是所需和有利的。本公開文本的摘要使讀者能夠快速確定本技術(shù)公開的實(shí)質(zhì)。它被提交的條件是， 它不會用來解釋或限制以下權(quán)利要求的范圍或含義。
權(quán)利要求
1.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與至少一種長度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與在SEQ ID NO :2(圖3)的第1-156個(gè)核苷酸中含有5_30個(gè)核苷酸的多核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
2.—種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與至少一種長度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義寡核苷酸的反向互補(bǔ)序列具有至少50% 的序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
3.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與至少一種長度為5-30個(gè)核苷酸的反義寡核苷酸接觸，其中所述寡核苷酸與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義寡核苷酸具有至少50%的序列同一性；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
4.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的功能和/或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與靶向紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反義寡核苷酸的區(qū)的至少一種反義寡核苷酸接觸；從而體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)患者細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO) 多核苷酸的功能和/或表達(dá)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中相比對照體內(nèi)或體外提高紅細(xì)胞生成素(EPO)的表達(dá)和/ 或功能。
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反義序列。
7.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向含有紅細(xì)胞生成素(EPO) 多核苷酸的編碼和非編碼核酸序列的核酸序列。
8.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸靶向紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的重疊和/或非重疊序列。
9.權(quán)利要求4的方法，其中所述至少一種反義寡核苷酸包含選自以下的一種或多種修飾至少一種修飾糖部分、至少一種修飾核苷間鍵、至少一種修飾核苷酸及其組合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾糖部分2' -0-甲氧乙基修飾糖部分、2'-甲氧基修飾糖部分、2' -0-烷基修飾糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾核苷間鍵硫代磷酸酯、2' -0-甲氧乙基(M0E)、2'-氟、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述一種或多種修飾包括選自以下的至少一種修飾核苷酸肽核酸(PNA)、鎖定核酸(LNA)、阿糖核酸(FANA)、其類似物、衍生物及其組合。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種寡核苷酸包含至少一種SEQID N0:3-5所示寡核苷酸序列。
14.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)基因的功能和/ 或表達(dá)的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與至少一種長度為5-30個(gè)核苷酸的短干擾RNA (siRNA)寡核苷酸接觸，所述至少一種siRNA寡核苷酸對紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義多核苷酸特異，其中所述至少一種siRNA寡核苷酸與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子的至少約五個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少50%的序列同一性；和體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)基因的表達(dá)和/或功能。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述寡核苷酸與至少約5個(gè)連續(xù)核酸的序列具有至少 80%的序列同一性，所述序列與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義和/或有義核酸分子互補(bǔ)。
16.一種體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)基因表達(dá)和/或功能的方法，其包括將所述細(xì)胞或組織與長度為約5-30個(gè)核苷酸、對編碼紅細(xì)胞生成素(EPO)分子的多核苷酸的有義和/或天然反義鏈的非編碼和/或編碼序列特異的至少一種反義寡核苷酸接觸，其中所述至少一種反義寡核苷酸與至少一種SEQ ID NO :1、2所示核酸序列具有至少 50%的序列同一性；和體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物細(xì)胞或組織中紅細(xì)胞生成素(EPO)基因的表達(dá)和/或功能。
17.一種合成修飾寡核苷酸，其包含至少一種修飾，其中所述至少一種修飾選自至少一種修飾糖部分、至少一種修飾核苷酸間鍵、至少一種修飾核苷酸及其組合；其中所述寡核苷酸是與紅細(xì)胞生成素(EPO)基因雜交并相比正常對照體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能的反義化合物。
18.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述至少一種修飾包括選自以下的至少一種核苷酸間鍵硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、二硫代磷酸酯、烷基硫代膦酸酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯、 碳酸酯、磷酸三酯、氨基乙酸酯、羧甲基酯及其組合。
19.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含至少一種硫代磷酸酯核苷酸間鍵。
20.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含硫代磷酸酯核苷酸間鍵骨架。
21.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含選自以下的至少一種修飾核苷酸肽核酸、鎖定核酸(LNA)、類似物、衍生物及其組合。
22.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含選自以下的修飾糖部分 2' -0-甲氧乙基修飾糖部分、2'-甲氧基修飾糖部分、2' -0-烷基修飾糖部分、二環(huán)糖部分及其組合。
23.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸長度為至少約5-約30個(gè)核苷酸，并與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義和/或有義鏈雜交，其中所述反義化合物與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約20%的序列同一性。
24.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的反義和/或有義編碼和/或非編碼核酸序列的至少約5個(gè)連續(xù)核酸的互補(bǔ)序列具有至少約 80%的序列同一性。
25.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸與至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸雜交并相比正常對照體內(nèi)或體外調(diào)節(jié)其表達(dá)和/或功能。
26.權(quán)利要求17的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含SEQID NO :3_5所示序列之一。
27.一種組合物，其包含對一種或多種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸特異的一種或多種寡核苷酸，所述多核苷酸包括反義序列、互補(bǔ)序列、等位基因、同源物、同種型、變體、衍生物、突變體、片段或其組合。
28.權(quán)利要求27的組合物，其中所述寡核苷酸與任一種SEQID N0:3_5所示核苷酸序列相比具有至少約40%的序列同一性。
29.權(quán)利要求27的組合物，其中所述寡核苷酸包含任一種SEQID N0:3_5所示核苷酸序列。
30.權(quán)利要求27的組合物，其中SEQID NO :3_5所示寡核苷酸包含一種或多種修飾或核苷酸取代。
31.權(quán)利要求30的組合物，其中所述一種或多種修飾或核苷酸取代選自硫代磷酸酯、 甲基膦酸酯、肽核酸、鎖定核酸(LNA)分子及其組合。
32.一種預(yù)防或治療與至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸和/或其至少一種編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病或病癥的方法，其包括將治療有效劑量的至少一種反義寡核苷酸給予患者，所述至少一種反義寡核苷酸結(jié)合所述至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的天然反義序列，并調(diào)節(jié)所述至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸的表達(dá)；從而預(yù)防或治療與至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸和/或其至少一種編碼產(chǎn)物相關(guān)的疾病或病癥。
33.權(quán)利要求32的方法，其中與至少一種紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸相關(guān)的疾病或病癥選自血液異常的疾病、障礙或狀態(tài)，以紅細(xì)胞產(chǎn)生少或缺陷為特征的血液障礙，貧血癥，鐮狀細(xì)胞貧血，地中海貧血，紅細(xì)胞生成異常，妊娠障礙或月經(jīng)紊亂，早期早產(chǎn)兒貧血，腎機(jī)能不全，慢性腎衰竭，高血壓，手術(shù)相關(guān)疾病或病癥，兒科患者透析疾病或病癥， 血細(xì)胞比容水平不足相關(guān)疾病或狀況，AIDS,化學(xué)療法治療相關(guān)障礙，囊性纖維化，癌癥或腫瘤，傳染病，性病，免疫相關(guān)疾病和/或自身免疫疾病或病癥，心血管疾病例如中風(fēng)、低血壓、心搏停止，缺血特別是缺血-再灌注損傷，心肌梗死例如急性心肌梗死，慢性心力衰竭， 心絞痛，心臟肥大，心肺疾病，心肺分流，呼吸道疾病，腎、泌尿/生殖疾病，內(nèi)分泌/新陳代謝異常，胃腸疾病，主要具有神經(jīng)病學(xué)或精神病學(xué)癥狀的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病，認(rèn)知功能的年齡相關(guān)喪失，大腦性麻搏，神經(jīng)變性疾病，阿爾茨海默氏病，帕金森氏病，利氏病，癡呆，記憶喪失，肌萎縮性側(cè)索硬化，酒精中毒，心境障礙，焦慮障礙，注意力缺陷障礙，過興奮，孤獨(dú)癥，精神分裂癥，抑郁癥，腦或脊髓創(chuàng)傷或缺血，克-雅病，眼病，癲癇障礙，多發(fā)性硬化，炎癥，輻射損傷，黃斑變性，糖尿病性神經(jīng)病，糖尿病性視網(wǎng)膜病，青光眼，視網(wǎng)膜缺血，和視網(wǎng)膜創(chuàng)傷，脊髓損傷，宇宙飛行狀態(tài)，急性失血狀態(tài)，老化和腫瘤疾病狀態(tài)。
34.一種鑒定和選擇用于體內(nèi)給藥的至少一種寡核苷酸的方法，其包括選擇與疾病狀態(tài)相關(guān)的靶多核苷酸；鑒定包含至少五個(gè)連續(xù)核苷酸的寡核苷酸，所述至少五個(gè)連續(xù)核苷酸與選定的靶多核苷酸互補(bǔ)，或相對其處于反義方向上；和測量嚴(yán)格雜交條件下反義寡核苷酸和靶多核苷酸的雜合體的熱解鏈溫度；和基于所得信息選擇用于體內(nèi)給藥的至少一種寡核苷酸。
全文摘要
寡核苷酸化合物調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成素(EPO)多核苷酸及其編碼產(chǎn)物的表達(dá)和/或功能。用于治療紅細(xì)胞生成素(EPO)相關(guān)疾病的方法包括將一種或多種設(shè)計(jì)用以抑制EPO天然反義轉(zhuǎn)錄物的寡核苷酸化合物給予患者。
文檔編號A61K48/00GK102317458SQ200980156404
公開日2012年1月11日 申請日期2009年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月4日
發(fā)明者J·科拉德, 謝爾曼 O·霍爾科瓦 申請人:歐科庫爾納有限責(zé)任公司