一種源于靈菌紅素高產(chǎn)菌株粘質(zhì)沙雷氏菌的溫度調(diào)控型啟動子的制作方法
【專利摘要】本課題組前期篩選獲得一株靈菌紅素高產(chǎn)菌株粘質(zhì)沙雷氏菌JNB5-1，該菌株合成靈菌紅素受溫度的影響，即在相對低溫(28℃)條件下發(fā)酵培養(yǎng)時產(chǎn)靈菌紅素，而相對高溫(37℃)條件下發(fā)酵培養(yǎng)不產(chǎn)靈菌紅素。本發(fā)明在2DE的基礎(chǔ)上首次研究了一種與靈菌紅素合成受溫度調(diào)控相關(guān)的溫控型啟動子，即靈菌紅素合成途徑中的氧甲基轉(zhuǎn)移酶(PigF)基因上游的啟動子。將該啟動子導入大腸桿菌在不同溫度條件(28℃和37℃)處理下，能夠促進下游基因的表達，并且在28℃時的強度是37℃時的2.1倍。本發(fā)明中的溫控型啟動子為粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素受溫度影響的原因提供了新線索；為構(gòu)建高產(chǎn)靈菌紅素菌株、提高菌株產(chǎn)靈菌紅素的溫度適應(yīng)性提供了理論指導。
【專利說明】一種源于靈菌紅素高產(chǎn)菌株粘質(zhì)沙雷氏菌的溫度調(diào)控型啟 動子

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學和基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種源于靈菌紅素高產(chǎn)菌株粘 質(zhì)沙雷氏菌的溫度調(diào)控型啟動子。

【背景技術(shù)】
[0002] 啟動子（promoter)是一段RNA聚合酶識別、結(jié)合和起始轉(zhuǎn)錄的特定DNA序列。啟 動子是基因表達所必需的，決定了外源基因表達的空間、時間和表達強度等；是人們定向改 造生物的重要限制因素。生物在生長發(fā)育中可以根據(jù)自身和環(huán)境來定時、定位和定量的表 達特定基因，這種能力是通過生物體的DNA順式作用元件（啟動子、增強子、沉默子）、反式 作用因子和光、熱等外界環(huán)境因素的相互作用來實現(xiàn)的，其中啟動子的作用尤為關(guān)鍵。因 此，研究啟動子的功能對于生物的生長發(fā)育和探討生物適應(yīng)環(huán)境的機制等均有重要意義。
[0003] 報告基因（r印orter gene)是一種編碼易被檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，其與目的 基因融合后的表達產(chǎn)物可用來標定目的基因的表達調(diào)控。作為一種簡便有效的方法，報告 基因在微生物檢測和調(diào)控研究中正發(fā)揮著越來越重要的作用。報告基因在基因時空表達調(diào) 控中發(fā)揮著重要的作用，它是一種分析結(jié)構(gòu)基因旁側(cè)區(qū)域潛在的順式作用元件和反式作用 因子相互作用的強有力的工具。其優(yōu)點是簡單方便、可靠、靈敏度高、適用于大規(guī)模的檢測。 報告基因主要有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、熒光素酶、半乳糖苷酶、分泌型堿性磷酸酶和熒光蛋白 等。目前，在動物、植物、微生物和醫(yī)學等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的有氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、半乳糖苷酶 和熒光蛋白。其中，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶最早應(yīng)用于檢測生物體基因表達，其表達產(chǎn)物較穩(wěn) 定，且在活性很低的水平就能被檢測出來。
[0004] 本課題組前期從土壤中篩選獲得一株靈菌紅素（prodigiosin，PG)高產(chǎn)菌株粘質(zhì) 沙雷氏菌（Serratia marcecens)JNB5-l，其靈菌紅素的產(chǎn)量為6. 14g/L，達國內(nèi)最高產(chǎn)量之 一。研究發(fā)現(xiàn)該菌株合成靈菌紅素受溫度的影響：在相對低溫（28°C )條件下發(fā)酵培養(yǎng)時 產(chǎn)靈菌紅素，而相對高溫（37°C)條件下發(fā)酵培養(yǎng)不產(chǎn)靈菌紅素。并且利用雙向電泳和質(zhì)譜 鑒定初步探究了溫度對該菌合成靈菌紅素受溫度影響的原因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了靈菌紅素合成途 徑中的氧甲基轉(zhuǎn)移酶（PigF)在不同溫度（28°C和37°C )條件下的表達水平具有顯著差異 性。
[0005] 本發(fā)明在以上基礎(chǔ)上首次利用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT)基因作為報告基因，通 過克隆氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因（pigF)上游啟動子序列、構(gòu)建啟動子探測載體、轉(zhuǎn)化大腸桿 菌。獲得重組菌后對啟動子進行功能驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：攜帶氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因上游啟動子 (P-p igF)的重組大腸桿菌在28 °C條件下CAT酶活力是5. 02U/mg ; 37 °C條件下CAT酶活力是 2. 39U/mg。因此，P-pigF具有啟動子的活性，并且28°C條件下比37°C條件下的強度高2. 1 倍，即P-pigF受溫度的調(diào)控。
[0006] 以上研究為粘質(zhì)沙雷氏菌合成靈菌紅素受溫度影響的原因提供了新線索；為進一 步研究粘質(zhì)沙雷氏菌靈菌紅素合成代謝奠定了基礎(chǔ)；也為構(gòu)建高產(chǎn)靈菌紅素菌株、提高菌 株產(chǎn)靈菌紅素的溫度適應(yīng)性提供了理論指導。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種溫控型啟動子，即氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因上游的啟動子。 該啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示，在本發(fā)明中簡稱為P-pigF。P-pigF能在不 同溫度（28°C和37°C )條件下驅(qū)動報告基因（cat)的表達；并且該啟動子受溫度的調(diào)控，即 它在28°C時的強度是37°C時的2. 1倍。本發(fā)明還提供了含有目標啟動子的核苷酸編碼序 列的重組載體，它是通過將氧甲基轉(zhuǎn)移酶基因上游的啟動子插入載體的多克隆位點而得。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0009] 主要試劑：乙酰輔酶4仏〇6七71-(：(^)和5,5'-二硫雙（2-硝基苯甲酸）（0了他）等 購于Sigma公司。
[0010] 氧甲基轉(zhuǎn)移酶（PigF)基因上游啟動子重組探測載體的構(gòu)建：
[0011] 1.粘質(zhì)沙雷氏囷基因組DNA的提取
[0012] 1)挑取粘質(zhì)沙雷氏菌單菌落接種于10mL LB培養(yǎng)基中，28°C 200r/min培養(yǎng)至對數(shù) 生長期。
[0013] 2)取上述菌液1. 5mL于離心管中，8000Xg離心5min，去上清。
[0014] 3)用0. 5mL TE緩沖液（pH8. 0)洗滌細胞2次，重懸細胞。
[0015] 4)加 20 μ L(10mg/mL)溶菌酶，混勻，37°C水浴 30min。
[0016] 5)加 100μ L10% SDS，混勻，37°C水浴 30min。
[0017] 6)加50 μ L蛋白酶K，65°C反應(yīng)3h (每隔半小時混勻1次）。
[0018] 7)加入等體積的飽合酚，混勻，離心。上層溶液移入新的離心管中。
[0019] 8)重復(fù)上步驟1次，然后加入等體積的氯仿抽提2次，離心。
[0020] 9)上層溶液移入新的離心管中（注：盡量不要帶入下層液體）。加入2倍體積的 無水乙醇沉淀，同時加入1/lOKAc。等待沉淀。
[0021] 10)離心去上清，用70%乙醇懸浮洗滌1次，離心，空離除盡液體，晾干。
[0022] 11)用50 μ LTE緩沖液溶解，_20°C保藏。
[0023] 2.目標啟動子片段的克隆及序列分析
[0024] 利用 S. marcecens JNB5-1 染色體 DNA 和 pACYCDuet-1，P-pigF 和 cat 的上、下游 引物進行PCR擴增（擴增條件參照Ex Taq DNA聚合酶說明書）。將擴增出的目標啟動子和 cat基因片段進行膠回收（參照膠回收試劑盒說明書），然后將回收產(chǎn)物分別與pMDIS-T載 體連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。提取重組質(zhì)粒，酶切驗證后送上 海生工測序。登陸 http://www. fruitfly. org/seq-tools/promoter. html，利用在線軟件 (Berkeley Drosophila Genome Project)檢測可能的啟動子功能區(qū)域并分析其保守序列。
[0025] 3.攜帶目標啟動子重組探測載體的構(gòu)建
[0026] 將pMD18-T_cat用Pst I和Hind III雙酶切后，膠回收cat片段與經(jīng)相同限制性 內(nèi)切酶線性化的質(zhì)粒pMD18-T-PpigF經(jīng)T4DNA連接酶連接過夜。轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受 態(tài)細胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。重組質(zhì)粒進行酶切和PCR驗證。
[0027] 4.大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及熱擊轉(zhuǎn)化
[0028] 1)將E. coli JM109和E. coli BL21(DE3)過夜活化，然后轉(zhuǎn)接并在37°C震蕩培養(yǎng) 至 〇D6QQ 約為 0. 3-0. 4。
[0029] 2)將上述菌液置于冰上，輕輕搖晃使菌液迅速冷卻約lOmin (注：甘油和CaCl2溶 液同樣置于冰上）。
[0030] 3)冷卻后的菌液分裝至1. 5mL離心管中（裝液量約1. 2mL)，離心管迅速置于冰上 10min〇
[0031] 4)上述菌液4°C 5000Xg離心30s，迅速置于冰上靜置2min。棄上清，用400yL 預(yù)冷的CaCl2重懸菌體，然后置于冰上放置15min。
[0032] 5)重復(fù)4)步驟一次。
[0033] 6)4°C 5000Xg離心30s，棄上清。用80yL預(yù)冷的CaCl2重懸菌體，然后加 40 μ L50%甘油，混勻，-40°C保藏備用。
[0034] 7)將基因連接產(chǎn)物（約10 μ L)和感受態(tài)細胞混勻，迅速置于冰上放置45min。
[0035] 8)將上述混合物進行熱擊（42°C水浴lmin30s)，冰上放置5min。
[0036] 9)加入800yL LB培養(yǎng)基，37°C震蕩培養(yǎng)60min。5000Xg離心2min，棄上清（保 留約200 μ L細胞培養(yǎng)物）。涂布抗生素平板，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。
[0037] 啟動子功能分析（不同溫度下啟動子強度分析）：
[0038] 挑取上述重組大腸桿菌菌落（在100 μ g/mL的氨芐青霉素平板上生長）接到 10mL LB培養(yǎng)基中，37°C 160r/min培養(yǎng)12h，然后轉(zhuǎn)接到50mL培養(yǎng)基中，分別在28°C和 37°C，160r/min培養(yǎng)12h，收集發(fā)酵液。4°C 5000Xg離心5min收集菌體，用100mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 8)洗滌2遍。重懸細胞后在冰浴中超聲破碎（（工作3秒間歇2秒））5min， 離心，取上清用于CAT酶活的測定。E. coli JM109作為陰性對照。
[0039] CAT 酶活測定參考文獻，反應(yīng)體系包括 250mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 8)，0· lmmol/ L aCetyl-C〇A，0.4mg/mL DTNB和適量的粗酶液。將上述反應(yīng)混合物置于37°C水浴中溫育 2min，加入氯霉素至終濃度為0. lmmol/L，混勻后立即測定光吸收值A(chǔ)412 ;以未加氯霉素的 反應(yīng)液為對照。CAT酶活單位定義：在上述條件下，每分鐘乙?；? μ mol氯霉素所需的酶 量為一個活力單位（U)?？偟鞍缀坎捎肂radford法測定。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1啟動子和報告基因 PCR產(chǎn)物電泳圖；
[0041] 圖 2pMD18_T-PpigF_cat 的酶切驗證
[0042] 圖3啟動子重組探測載體PCR驗證
[0043] 圖4CAT酶活測定的結(jié)果

【具體實施方式】
[0044] 實施例1 :pigF上游啟動子序列分析
[0045] 根據(jù)GenBank中報道的序列確定pigF的轉(zhuǎn)錄起始點，選取其上游579bp的序列， 并將其命名為 P_pigF。登陸 http: //www. fruitf ly. org/seq-tools/promoter. html，利用 在線軟件（Berkeley Drosophila Genome Project)預(yù)測可能的啟動子功能區(qū)域并分析其 保守序列。分析結(jié)果表明，一段得分為0.79的核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示
[0046] (gcgcctttgccacggtgtgcgaggaactctccacctttttatacttagggagccagcaatg)中存在 與細菌標準的-10區(qū)（TATAAT)和-35區(qū)（TTGACA)相似的序列，說明核心啟動子區(qū)的可靠 性很高。目標啟動子序列越接近上述保守序列，啟動子的強度可能越高。
[0047] 實施例2 :啟動子和報告基因的克隆
[0048] 根據(jù)啟動子和報告基因的序列設(shè)計PCR引物。以S.marcecens JNB5-1染色體DNA 為模版，利用P-pigF上下游引物進行PCR擴增，得到大小約為579bp的目的基因片段（圖 1);以pACY⑶uet-Ι為模版，利用cat基因上下游引物進行PCR擴增，得到大小約654bp的 cat片段（圖1)。
[0049] P-pigF 引物序列為：F :5' -ACCCGTCTAGAAAAAAGCCTATGGCACGGCGG-3'
[0050] R :5, -CGCCTGCAGTGCTGGCTCCCTAGTCTAAAAAGG-3'
[0051] cat 引物序列為：F : 5 ' -CGCCTGCAGATGGAGAAAAAAATCACTGG-3 '
[0052] R :5, -CCCAAGCTTTCATTCTTCG TCACCTCC-3，
[0053] 擴增產(chǎn)物采用上海生工膠回收試劑盒回收，然后與pMDIS-T載體連接得到重組質(zhì) 粒pMD18-T-PpigF和pMD18-T-cat，酶切驗證后送上海生物工程有限公司測序。
[0054] 實施例3 :啟動子重組探測載體的構(gòu)建
[0055] 將pMD18-T_cat用Pst I和Hind III酶切，膠回收后與用相同限制性內(nèi)切酶線性 化的pMD18-T-PpigF經(jīng)T4DNA連接酶連接，構(gòu)建重組載體pMD18-T-PpigF-cat，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細胞，提取重組質(zhì)粒進行酶切和PCR驗證，如圖2、3所示，pMD18-T-PpigF-cat 用Pst I和Hind III雙酶切后得到3269bp和649bp的片段，表明啟動子探測載體構(gòu)建 成功。以攜帶啟動子的重組質(zhì)粒為模板進行PCR，擴增出啟動子片段，與陽性對照（以 S.marcecens JNB5-1基因組DNA為模板）的片段大小一致，而陰性對照（以pMD18-T-cat 為模板）中無條帶顯示，表明啟動子探測載體構(gòu)建成功。
[0056] 實施例4 :不同溫度條件下啟動子強度分析
[0057] 挑取上述在100 μ g/mL的氨芐青霉素平板上生長的重組大腸桿菌菌落，接到 10mL LB培養(yǎng)基中，37°C 160r/min培養(yǎng)12h，然后轉(zhuǎn)接到50mL培養(yǎng)基中，分別在28°C和 37°C，160r/min培養(yǎng)12h，收集發(fā)酵液。4°C 5000Xg離心5min收集菌體，用100mmol/L Tris-HCl (pH7. 8)洗滌2遍。重懸細胞后在冰浴中超聲破碎（工作3秒間歇2秒）5min，離 心，取上清用于CAT酶活的測定。E. coli JM109作為陰性對照。
[0058] CAT 酶活測定反應(yīng)體系包括 250mmol/L Tris-HCl (ρΗ7· 8)，0· lmmol/L acetyl-C〇A，0. 4mg/mL DTNB和適量的粗酶液。將上述反應(yīng)混合物置于37°C水浴中溫育 2min，加入氯霉素至終濃度為0. lmmol/L，混勻后立即測定光吸收值A(chǔ)412 ;以未加氯霉素的 反應(yīng)液為對照。CAT酶活單位定義：在上述條件下，每分鐘乙酰化1 μ mol氯霉素所需的酶 量為一個活力單位（U)。蛋白含量采用Bradford法測定。不同溫度（28°C和37°C)條件 下測定CAT酶活力的結(jié)果如圖4所示，陰性對照E. coli JM109無 CAT活性；E. coli JM109/ pMD18-T-PpigF-cat 在 28°C和 37°C 下的酶活分別為 5. 02U/mg 和 2. 39U/mg ;因此，P-pigF 具有啟動子的功能，并且在28°C時的強度是37°C時的2. 1倍，即P-pigF受溫度的調(diào)控。
[0001] 序列表 <110>江南大學 <120> -種高產(chǎn)靈歯紅桌粘質(zhì)沙冚氏菌溫度凋控型啟動了 <160> 1 <211> 61bp <212> DNA <213> Serratia marcecens <222> (1)..(61) <223>溫度調(diào)控型啟動了 <400> 1 1 GCGCCTTTGC CACGGTGTGC GAGGAACTCT CCACCTTTTT ATACTTAGGG AGCCAGCAAT 61 G
【權(quán)利要求】
1. PigF基因啟動子，其中包含下述（a)?（d)中任意一項DNA: (a) SEQ ID NO :1 所示的 DNA ; (b) 包含SEQ ID NO :1所示的堿基序列、并且具有啟動子活性的DNA ; (c) 包含在SEQ ID NO :1所示的堿基序列中缺失、取代或添加至少1個堿基所得的堿 基序列、并且具有啟動子活性的DNA ; (d) 與SEQ ID NO :1所示的堿基序列在嚴緊條件下雜交、并且具有啟動子活性/來源 于沙雷氏菌屬細菌的DNA。
2. -種質(zhì)粒，其中含有權(quán)利要求1所述的PigF基因啟動子。
3. 權(quán)利要求2所述的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為pMD18-T-PpigF。
4. 一種質(zhì)粒，將氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因 cat與權(quán)利要求3所述的質(zhì)粒連接構(gòu)建而獲得。
5. 權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒，該質(zhì)粒為pMD18-T-PpigF-cat。
6. -種轉(zhuǎn)化細胞，其通過往宿主細胞中導入權(quán)利要求2、3、4或5所述的質(zhì)粒而獲得。
7. 權(quán)利要求6所述的轉(zhuǎn)化細胞，其中所述宿主細胞為大腸桿菌。
8. 擴增權(quán)利要求1所述DNA分子全長或任以片段的引物對。
【文檔編號】C12N15/11GK104059913SQ201410250011
【公開日】2014年9月24日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月5日
【發(fā)明者】饒志明, 楊套偉, 徐美娟, 張顯, 徐虹 申請人:江南大學