專利名稱：ActA促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種激活素A(ActA)促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法，特別是涉及一種將12. 5dpc (交配后的天數(shù))減數(shù)分裂前的生殖細胞利用體外培養(yǎng)的方法分化發(fā)育成生發(fā)泡(GV)期卵母細胞并誘導成熟，利用體外受精技術檢測體外發(fā)育形成的卵母細胞質量，獲得早期發(fā)育的體外受精后代的方法。屬于生殖醫(yī)學的生物醫(yī)學技術領域。
背景技術：
在先前的研究中，來源于小鼠減數(shù)分裂前的生殖細胞不能恢復減數(shù)分裂并發(fā)育到MII期。在雌性小鼠胚胎中，13. 5dpc生殖細胞經(jīng)歷了進一步的DNA復制，并且進入第一次減數(shù)分裂的前期。然而，來源于胎兒生殖細胞的卵母細胞體外生長僅僅能進入到第一次減數(shù)分裂的雙線期，并停滯在這一時期。研究人員發(fā)現(xiàn)，小鼠11. 5 12. 5dpc的生殖嵴分離獲得的PGCs在沒有體細胞的支持下不能存活，而是快速的凋亡，而利用小鼠胎兒肺細胞與生殖細胞聚合后體外培養(yǎng)，生殖細胞可以像在卵巢里的發(fā)育進程一樣進入第一次減數(shù)分裂。如果進入雌性生殖嵴的生殖細胞數(shù)量過少，顆粒細胞的分化可以被啟動，但是很快就失去了分化能力，卵母細胞也隨后死亡或數(shù)量減少。卵母細胞與顆粒細胞間的的互作是雙向的，這種互作調控了這兩種類型細胞的發(fā)育，它不僅是卵母細胞發(fā)育必需的，也是卵泡發(fā)育所必需的，從原始卵泡的形成到成熟卵泡的排卵始終都有互作的存在。最近，科學家建立了一種生殖細胞與體細胞的共培養(yǎng)方法，并結合KITL、bFGF和LIF等因子的作用，可以使從雌性胎鼠生殖嵴中分離出來的PGC體外發(fā)育到卵母細胞第一次減數(shù)分裂的雙線期，但這種卵母細胞不能成熟和受精。Obata和Niwa等利用12. 5dpc胎鼠完整的卵巢進行體外培養(yǎng)觀山但獲得的卵母細胞不能完成第二次減數(shù)分裂?？赡苁嵌喾N因素制約了卵母細胞的體外發(fā)生。一種原因可能是卵母細胞核、質發(fā)育不同步，而核質同步發(fā)育成熟又是卵母細胞恢復減數(shù)分裂成熟必需的。另一方面，卵泡顆粒細胞與卵母細胞間的間隙連接也影響著卵母細胞的發(fā)育，間隙連接形成不完全會阻礙卵母細胞的減數(shù)分裂恢復。還有一種原因就是體外發(fā)育的卵母細胞不能達到最大直徑的80%，而這是卵母細胞成熟發(fā)育所需的。利用生殖細胞體外培養(yǎng)的方法難以克服這些問題，因為至今對卵母細胞生長、卵泡內顆粒細胞與卵母細胞間隙連接的形成、卵母細胞的減數(shù)分裂啟動等調控機理知之甚少。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術的缺點，提供一種ActA促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法。為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明利用機械法分離12. 5dpc雌性胎鼠生殖嵴，體外培養(yǎng)胎鼠生殖嵴后收集卵母細胞，將12. 5dpc減數(shù)分裂前的生殖細胞利用體外培養(yǎng)的方法分化發(fā)育成GV期卵母細胞并誘導成熟，得到成熟的卵母細胞；并利用體外受精技術檢測體外發(fā)育形成的卵母細胞質量，可獲得早期發(fā)育的體外受精后代。所述胎鼠生殖嵴的分離按照如下步驟操作胎鼠卵巢來源于12. 5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以見栓為0.5dpc。出生后小鼠的卵巢來源于12 14dpp的小鼠。利用機械分離法從胎鼠體內分離出卵巢，并轉移到磷酸鹽緩沖液(PBS)+10% FCS的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手術鑷子去掉與卵巢連接在一起的中腎組織，在新鮮培養(yǎng)液(密理博高糖培養(yǎng)基(α-MEM) ；5%胎牛血清(FCS) ；丙酮酸鈉；青鏈霉素；IOmIU促卵泡素(FSH)) 中將卵巢洗3次。所述胎鼠生殖嵴的體外培養(yǎng)按照如下步驟操作生殖嵴分離出來培養(yǎng)的當天定為 0天。分離出的12. 5dpc胎鼠生殖嵴，一分為二，并在培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)觀天。組織在37°C、 5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，培養(yǎng)液每兩天換半液，換液時觀察卵母細胞的發(fā)育情況等。此處所用的培養(yǎng)基分為兩種培養(yǎng)液，培養(yǎng)液的配方如下培養(yǎng)液培養(yǎng)液A包含密理博高糖培養(yǎng)基(α -MEM) ； 10%胎牛血清(FCS) ； 1 %丙酮酸鈉；青鏈霉素；IOmIU促卵泡素(FSH) ；lOOng/ml激活素A(ActA)；培養(yǎng)液B包含 α-MEM FCS 胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物(ITS-mix) ；1 %丙酮酸鈉；1 %青鏈霉素；100mIU/ml FSH ； lng/ml 上皮生長因子(EGF) ； 100ng/ml ActA0所述卵母細胞的收集按照如下步驟操作收集添加ActA體外培養(yǎng)到28天的小鼠卵巢，并撕成碎小的組織塊，0. 25%胰酶(Gibco-BRL)，0. 2%膠原酶IV(Gibco-BRL)和 0. 02% DNAse-I (Sigma)消化，37°C處理lOmin。加入膠原酶等體積的胎牛血清終止消化，洗滌3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸鹽緩沖液(PBS)中反復洗滌，直至收集的樣品中不再含有顆粒細胞，根據(jù)試驗需要將收集的卵母細胞進行分類。所述卵母細胞的培養(yǎng)及成熟誘導按照如下步驟操作使用口吸管吸出卵母細胞， 然后挑出直徑在75 μ m以上的卵母細胞，每個液滴20個卵母細胞放入培養(yǎng)24h后的顆粒細胞層上(12 14dpp腔前卵泡顆粒細胞收集后放入提前做好的培養(yǎng)液滴中。6cm培養(yǎng)皿，每個液滴100 μ 1，37°C，5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜)，進行共培養(yǎng)。此處培養(yǎng)卵母細胞分為對照組和實驗組，對照組和實驗組培養(yǎng)液的配方如下對照組培養(yǎng)液α-MEM ； 10% FCS ； 1 % ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ；EGF 5ng/ml ；1% 丙酮酸鈉；青鏈霉素。實驗組培養(yǎng)液α-MEM ；10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ；EGF 5ng/ml ；ActA 100ng/ml ； 丙酮酸鈉；青鏈霉素。共培養(yǎng)7天后，取出卵母細胞，挑出沒有凋亡的卵母細胞，以每個液滴20個，放入提前做好的成熟培養(yǎng)液培養(yǎng)滴中(6cm培養(yǎng)皿，每個液滴ΙΟΟμ 1，37°C，5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜)，在37°C，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)18h，統(tǒng)計卵母細胞成熟的比例。成熟培養(yǎng)液的配方如下成熟培養(yǎng)液α-MEM ；10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 100mIU/ml ；EGF lng/ml ； 丙
酮酸鈉；青鏈霉素。本發(fā)明方法建立了 ActA促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法，將從理論上探索原始生殖細胞的體外發(fā)生與卵泡的體外發(fā)育的細胞分子機制，并為卵巢性不孕癥病人提供優(yōu)質的卵母細胞，創(chuàng)造巨大的社會和經(jīng)濟價值。


圖1為12. 5dpc胎鼠生殖嵴的分離顯微圖。圖2為小鼠卵巢卵母細胞的體外發(fā)生過程顯微圖。圖3為卵母細胞數(shù)量和直徑統(tǒng)計圖。圖4為體外發(fā)生的卵巢卵母細胞的成熟顯微圖。圖5為來源于12. 5dpc胎鼠卵巢卵母細胞體外培養(yǎng)得到的卵母細胞質量的檢測圖。圖6為小鼠不同時期卵母細胞紡錘體的檢測圖。圖7為胎鼠卵巢卵母細胞發(fā)育成熟后支持胚胎發(fā)育到期圖。
具體實施例方式下面通過具體實施例對本發(fā)明方法做進一步闡述。實施例1、(一 )材料與方法1胎鼠生殖嵴的分離胎鼠卵巢來源于12. 5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以見栓為0. 5dpc。出生后小鼠的卵巢來源于12 14dpp的小鼠。利用機械分離法從胎鼠體內分離出卵巢，并轉移到磷酸鹽緩沖液(PBS，pH = 7. 2)+10%胎牛血清(FCS)的操作液中，在操作液中洗3次，并利用手術鑷子去掉與卵巢連接在一起的中腎組織，在新鮮培養(yǎng)液(密理博高糖培養(yǎng)基(α-ΜΕΜ， HyClone公司)；5%胎牛血清(FCS，HyClone公司)；丙酮酸鈉(HyClone公司)；青鏈霉素；10mIU/ml的促卵泡素(FSH，sigma公司)中將卵巢洗3次。2胎鼠生殖嵴的體外培養(yǎng)生殖嵴分離出來培養(yǎng)的當天定為O天。分離出的12. 5dpc胎鼠生殖嵴，一分為二， 并在培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)觀天。組織在37°C、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，培養(yǎng)液每兩天換半液，換液時觀察卵母細胞的發(fā)育情況等。試驗分為兩組，對照組和試驗組，兩個組除了培養(yǎng)液成分不同之外其它的均相同。對照組培養(yǎng)液培養(yǎng)液A包含密理博高糖培養(yǎng)基(α -MEM, HyClone公司)；10 %胎牛血清(FCS, HyClone公司)；丙酮酸鈉；青鏈霉素；IOmIU促卵泡素(FSH，sigma公司)。培養(yǎng)液B包含α -MEM ；5% FCS ；胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物(ITS-mix) ；1% 丙酮酸鈉；青鏈霉素；100mIU/ml FSH ;lng/ml上皮生長因子(EGF，sigma公司)。試驗組培養(yǎng)液培養(yǎng)液A包含α -MEM ； 10%胎牛血清(FCS，HyClone公司)； 丙酮酸鈉；青鏈霉素；IOmIU促卵泡素(FSH，sigma公司)；100ng/ml ActA0培養(yǎng)液B 包含α-ΜΕΜ;5%胎牛血清(FCS，，HyClone公司)；1 %胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物 (ITS-mix) ； 丙酮酸鈉；青鏈霉素；100mIU/ml促卵泡素(FSH，sigma公司)；lng/ml上皮生長因子(EGF，sigma 公司)；100ng/ml ActA0天根生化科技(北京)有限公司3卵母細胞的收集收集未添加和添加AcU體外培養(yǎng)到觀天的小鼠卵巢，并撕成碎小的組織塊， 0.25% 胰酶(Gibco-BRL)，0· 2% 膠原酶 IV(Gibco-BRL)和 0. 02 % DNAse-I (Sigma)消化，37°C處理lOmin。加入與膠原酶等體積的胎牛血清終止消化，洗滌3次后，用口吸管收集裸卵，在PBS中反復洗滌，直至收集的樣品中不再含有顆粒細胞，根據(jù)試驗需要將收集的卵母細胞進行分類。4卵母細胞的培養(yǎng)及成熟誘導使用口吸管吸出卵母細胞，然后挑出直徑在75μπι以上的卵母細胞，每個液滴20 個卵母細胞放入培養(yǎng)24h后的顆粒細胞層上(12 14dpp腔前卵泡顆粒細胞收集后放入提前做好的培養(yǎng)液滴中。6cm培養(yǎng)皿，每個液滴100 μ 1,37°C,5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜)，進行共培養(yǎng)。處培養(yǎng)卵母細胞分為對照組和實驗組，對照組和實驗組培養(yǎng)液的配方如下對照組培養(yǎng)液α-MEM ； 10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ；EGF 5ng/ml ；1% 丙酮酸鈉；青鏈霉素。實驗組培養(yǎng)液α-MEM ；10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 10mIU/ml ；EGF 5ng/ml ；ActA 100ng/ml ； 丙酮酸鈉；青鏈霉素。共培養(yǎng)7天后，取出卵母細胞，挑出沒有凋亡的卵母細胞，以每個液滴20個，放入提前做好的成熟培養(yǎng)液培養(yǎng)滴中(6cm培養(yǎng)皿，每個液滴ΙΟΟμ 1，37°C，5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜)，在37°C，5% CO2，飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)18h，統(tǒng)計卵母細胞成熟的比例。成熟培養(yǎng)液的配方如下成熟培養(yǎng)液α-MEM ；10% FCS ；1% ITS-mix ；FSH 100mIU/ml ；EGF lng/ml ； 丙
酮酸鈉；青鏈霉素。5卵母細胞細胞質谷胱甘肽GSH分析卵母細胞細胞質谷胱甘肽GSH的分析采用上海碧云天生物技術有限公司生產(chǎn)的總谷胱甘肽檢測試劑盒，具體實驗步驟和方法可參考其說明書。收集體外培養(yǎng)^d的小鼠卵母細胞(+/-ActA)，14dpp和21dpp小鼠卵母細胞作為對照，進行GSH的檢測。收集新鮮的細胞，PBS洗滌細胞一次，離心收集細胞，吸盡上清。加入細胞沉淀體積3倍量的蛋白去除試劑溶液，充分Vortex(細胞沉淀的體積可以根據(jù)細胞沉淀的重量進行估算。收集細胞前后分別對離心管進行稱重，從而就可以計算出細胞沉淀的重量。IOmg細胞沉淀的體積可以粗略地看做10 μ 1)。然后利用液氮和37°C水浴對樣品進行兩次快速的凍融。4°C或冰浴放置5min。4°C，IOOOOrpm離心lOmin。取上清用于總谷胱甘肽的測定。具體步驟如下(1)參考表1，本實驗利用96孔板，參照碧云天的總谷胱甘肽檢測試劑盒(Total Glutathione Assay kit)依次加入樣品或標準品，混勻。加入150 μ 1總谷胱甘肽檢測工作液后，混勻，室溫孵育5min。(2)加入 5O 微升 0. 16mg/ml NADPH 溶液，混勻。(3)立即用酶標儀測定A412，每5分鐘測定一次或實時測定，共測定25分鐘，測得 5個數(shù)據(jù)。(為了簡化實驗步驟，可以在加入NADPH溶液混勻后25分鐘，僅測定一次A412)。表IGSH的檢測體系
權利要求
1.一種ActA促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法，其特征在于利用機械法分離12. 5dpc雌性胎鼠生殖嵴，體外培養(yǎng)胎鼠生殖嵴后收集卵母細胞，將12. 5dpc減數(shù)分裂前的生殖細胞利用體外培養(yǎng)的方法分化發(fā)育成生發(fā)泡期卵母細胞并誘導成熟，得到成熟的卵母細胞；并利用體外受精技術檢測體外發(fā)育形成的卵母細胞質量，獲得早期發(fā)育的體外受精后代。
2.根據(jù)權利要求1所述的AcU促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法， 其特征在于胎鼠生殖嵴的分離按照如下步驟操作胎鼠卵巢來源于12. 5dpc的孕鼠，孕鼠的判定以見栓為0. 5dpc,出生后小鼠的卵巢來源于12 14dpp的小鼠，利用機械分離法從胎鼠體內分離出卵巢，并轉移到磷酸鹽緩沖液+10%胎牛血清的操作液中，在操作液中洗3 次，并利用手術鑷子去掉與卵巢連接在一起的中腎組織，在由密理博高糖培養(yǎng)基；5%胎牛血清；丙酮酸鈉；青鏈霉素；IOmIU促卵泡素配制成的新鮮培養(yǎng)液中將卵巢洗3次。
3.根據(jù)權利要求1所述的AcU促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法， 其特征在于胎鼠生殖嵴的體外培養(yǎng)按照如下步驟操作生殖嵴分離出來培養(yǎng)的當天定為0 天，分離出的12. 5dpc胎鼠生殖嵴，一分為二，并在培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)觀天，組織在37°C、 5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，培養(yǎng)液每兩天換半液，培養(yǎng)液A包含密理博高糖培養(yǎng)基； 10%胎牛血清；丙酮酸鈉；青鏈霉素；IOmIU促卵泡素；lOOng/ml ActA ；培養(yǎng)液B包含密理博高糖培養(yǎng)基；5%胎牛血清；胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物；丙酮酸鈉；青鏈霉素；100mIU/ml促卵泡素；lng/ml上皮生長因子；100ng/ml ActA0
4.根據(jù)權利要求1所述的AcU促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法， 其特征在于卵母細胞的收集按照如下步驟操作收集添加ActA體外培養(yǎng)到觀天的小鼠卵巢，并撕成碎小的組織塊，0. 25%胰酶，0. 2%膠原酶IV和0. 02% DNAse-I消化，37°C處理 IOmin,加入膠原酶等體積的胎牛血清終止消化，洗滌3次后，用口吸管收集裸卵，在磷酸鹽緩沖液中反復洗滌，直至收集的樣品中不再含有顆粒細胞。
5.根據(jù)權利要求1所述的AcU促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法， 其特征在于卵母細胞的培養(yǎng)及成熟誘導按照如下步驟操作使用口吸管吸出卵母細胞，然后挑出直徑在75 μ m以上的卵母細胞，每個液滴20個卵母細胞放入培養(yǎng)24h后的顆粒細胞層上，12 14dpp腔前卵泡顆粒細胞收集后放入提前做好的培養(yǎng)液滴中，培養(yǎng)液配方密理博高糖培養(yǎng)基；10%胎牛血清；胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物；促卵泡素10mIU/ml ； 上皮生長因子5ng/ml ；ActA 100ng/ml ； 丙酮酸鈉；青鏈霉素；6cm培養(yǎng)皿，每個液滴 100μ 1,37°C,5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜；共培養(yǎng)7天后，取出卵母細胞，挑出沒有凋亡的卵母細胞，以每個液滴20個，放入提前做好的成熟培養(yǎng)液培養(yǎng)滴中，6cm培養(yǎng)皿，每個液滴100 μ 1,37°C,5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)過夜，在37°C ,5% CO2,飽和濕度的培養(yǎng)箱里培養(yǎng)18小時，統(tǒng)計卵母細胞成熟的比例；成熟培養(yǎng)液的配方為密理博高糖培養(yǎng)基；10%胎牛血清；胰島素轉鐵蛋白亞硒酸鈉復合物；促卵泡素100mIU/ml ；上皮生長因子lng/ml ； 丙酮酸鈉；青鏈霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種ActA促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法。利用機械法分離12.5dpc雌性胎鼠生殖嵴，體外培養(yǎng)胎鼠生殖嵴后收集卵母細胞，將12.5dpc減數(shù)分裂前的生殖細胞利用體外培養(yǎng)的方法分化發(fā)育成GV期卵母細胞并誘導成熟，得到成熟的卵母細胞；并利用體外受精技術檢測體外發(fā)育形成的卵母細胞質量，可獲得早期發(fā)育的體外受精后代。本發(fā)明方法建立了ActA促進減數(shù)分裂前雌性生殖細胞體外發(fā)育的技術方法，簡便易行，從理論上探索原始生殖細胞的體外發(fā)生與卵泡的體外發(fā)育的細胞分子機制，并為卵巢性不孕癥病人提供優(yōu)質的卵母細胞，創(chuàng)造巨大的社會和經(jīng)濟價值。
文檔編號C12N5/075GK102363765SQ20111034175
公開日2012年2月29日 申請日期2011年11月2日 優(yōu)先權日2011年11月2日
發(fā)明者張志鵬, 張西鋒, 李蘭, 沈偉 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學