專利名稱：一種制備轉(zhuǎn)基因豬的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，特別涉及脂質(zhì)體介導(dǎo)的制備轉(zhuǎn)基因豬方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)開始于20世紀(jì)80年代，目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有顯微原核注射法，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法，胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法，體細(xì)胞核移植技木，精子載體法，胞漿內(nèi)單精子注射法，卵母細(xì)胞載體法等。精子載體法是將精子作為外源基因的載體，在受精過程中將外源基因?qū)雱游锱咛?，并使外源DNA整合到染色體中，從而使外源基因進(jìn)入子代的基因組中目前，應(yīng)用精子為載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移獲得轉(zhuǎn)基因動物主要通過以下途徑來實現(xiàn)的體外精子轉(zhuǎn)染法和體內(nèi)精子轉(zhuǎn)染法體外精子轉(zhuǎn)染法又可以分為精子與外源DNA直接共孵育法，體外電穿孔導(dǎo)入法和脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法；體內(nèi)精子轉(zhuǎn)染法又可以分為輸精管注射轉(zhuǎn)染法、曲細(xì)精管注射轉(zhuǎn)染法、 睪丸注射轉(zhuǎn)染法等。1971年，Bracket等首次證實精子具有吸附結(jié)合外源DNA能力，并將外源DNA在受精時攜帶進(jìn)入卵母細(xì)胞。1992年，Lavitrano等應(yīng)用此法得到陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)成熟精子頭部具有吸收外源DNA的能力，其吸收區(qū)域是具有特異性的，該區(qū)域位于精子頭部的頂體后區(qū)(post-acrosomal region)，即靠近精核的區(qū)域。沈新明等直接用人巨細(xì)胞病毒啟動子調(diào)控的增強型綠色熒光蛋白表達(dá)載體注射到小鼠的曲精細(xì)管內(nèi)，最后通過與雌鼠交配，成功獲得了表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因仔鼠。袁進(jìn)等報道向通過向曲精細(xì)管內(nèi)注射外源DNA，然后再結(jié)合對曲精細(xì)管電擊或電穿孔處理，以使外源基因進(jìn)入睪丸生精細(xì)胞然后將這些處理的雄鼠與母鼠交配，得到的小鼠中有一組的陽性檢測率達(dá)25%。Sien 等則將處理方法更為簡化，首先直接向雄兔睪丸內(nèi)注射攜帯綠色熒光表達(dá)的外源DNA及ニ 甲基亞楓的介質(zhì)，使DNA能夠進(jìn)入睪丸細(xì)胞和生精細(xì)胞。一個月后用處理的雄兔與雌兔交配，所產(chǎn)生后代的56%仔兔能高效地表達(dá)所導(dǎo)入的外源基因。這ー轉(zhuǎn)入外源基因的陽性率大大高于以往精子載體法或其他非定點轉(zhuǎn)基因方法的結(jié)果。李碧春等以重組的緑色熒光蛋白基因為標(biāo)記，首次在家雞上通過采用公雞睪丸內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cells, SSCs)和體外轉(zhuǎn)染SSCs再移植的方法成功地生產(chǎn)出了轉(zhuǎn)基因雞，并且在家鴨和家雞上轉(zhuǎn)染功能基因進(jìn)行驗證，結(jié)果均說明該方法無需特殊的儀器要求，即可完成轉(zhuǎn)染外源基因的過程，方法簡單，操作方便，效率高，成本低，可大批量地生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞群，該方法的建立在家禽上意義重大，突破了制約家禽轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的瓶頸，解決了家禽轉(zhuǎn)基因難的問題，特別是體外轉(zhuǎn)染移植的成功，不僅解決了家禽轉(zhuǎn)基因難的問題，而且為成體干細(xì)胞的應(yīng)用開辟了更廣闊的應(yīng)用前景。精子載體法中精子孵育前的預(yù)處理通常使精子的受精能力下降，于是許多學(xué)者嘗試借鑒醫(yī)學(xué)上的輔助生殖技術(shù)ICSI使處理精子受精，精子胞質(zhì)內(nèi)顯微受精技術(shù)是借助顯微操作儀將ー個精子或生精細(xì)胞直接注入卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，從而完成受精的過程。它降低了對精子各種指標(biāo)的要求，使各種在體內(nèi)外不可能發(fā)生正常受精的卵子受精，同時可以避免多精子受精，也為研究異種間受精提供了有效的途徑1999年。美國科學(xué)家Perry等W4] 人首次將ICSI技術(shù)應(yīng)用于動物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠隨即，研究者們分別在獼猴豬上也進(jìn)行ICSI轉(zhuǎn)基因的嘗試，胚胎轉(zhuǎn)基因陽性率也很高，然而這些實驗最終并沒有得到出生的轉(zhuǎn)基因動物2006年，Kurom等把精子與攜帯有人白蛋白(hALB)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的DNA序列片斷共孵化，通過ICSI方法生產(chǎn)的胚胎移植后生產(chǎn)出ー頭含有hALB和GFP基因的轉(zhuǎn)基因小豬Garc' a-Va' zquez等將豬的精子經(jīng)不同方法處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)凍融處理(frozen-thawing，F(xiàn)T)，不加冷凍保護(hù)劑速凍處理(quick freezing without cryoprotectant agents, QF)以及用iTriton X-IOO (TX-IOO)處理過的精子與新鮮的精子相比，它們結(jié)合外源DNA的能力明顯增強，但其發(fā)育能力降低QF和ΤΧ-100處理精子所造成精子細(xì)胞膜的損傷與FT造成的損傷更能促進(jìn)精子與外源DNA地結(jié)合實驗還發(fā)現(xiàn)，用新鮮的精子與用FT和ΤΧ-100處理的精子經(jīng)ICSI發(fā)育的胚胎中，EGFP表達(dá)的胚胎陽性率相近(分別為 37. 04士3. 52%,43. 54士5. 41%和 29. 03士8. 29% )，而經(jīng) QF 處理過的精子，EGFP 胚胎的陽性率明顯提高(80. 43士5. 91%)。這表明精子的細(xì)胞膜在DNA相互作用中起著至關(guān)重要的作用，經(jīng)處理過的精子細(xì)胞膜更有利于外源DNA與精子染色體結(jié)合，但經(jīng)QF和ΤΧ-100 處理，可能嚴(yán)重?fù)p傷精子的細(xì)胞核，引起DNA破碎，或?qū)е氯旧w的破損，從而對胚胎將來的發(fā)育有害。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有DNA顯微注射法、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法、精子載體法等。用這些方法己能有效地將外源基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)，并獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因動物。這些技術(shù)的成功運用掲示了生產(chǎn)攜帶有外源DNA的動物是可能的，但是這些基因轉(zhuǎn)移方法也存在某些局限性。如顯微注射法操作程序復(fù)雜、對胚胎損傷大，對技術(shù)、設(shè)備要求高，特別是在牛羊豬等有開發(fā)應(yīng)用價值的大型哺乳動物上的低效率(低于)，極大地制約了該技術(shù)的應(yīng)用前景；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法雖然基因轉(zhuǎn)移的效率較高，但是基因插入是隨機的，且逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量有限，僅能攜帶小于IOKb的外源DNA片段，而且逆轉(zhuǎn)錄病毒主要感染早期胚胎的活躍分離期細(xì)胞，因而獲得的多為嵌合體動物，對于轉(zhuǎn)基因動物的下游篩選、培育、建系帶來很大的人力、物力、財カ負(fù)擔(dān)；此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒易將病原體基因序列引入宿主基因組，動物的生物安全性受都到質(zhì)疑。而精子載體法穩(wěn)定性較差，可重復(fù)率較低。普通的睪丸注射法由于直接注射載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)基因效率較低，且結(jié)果不穩(wěn)定。綜上所述，現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)均存在成本高，投資大，技術(shù)要求高，操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)基因效率較低等缺點。所以，尋找ー種省吋，省力且效率較高的轉(zhuǎn)基因方法迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的在精子載體法基礎(chǔ)上建立起來的，通過對精原細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因，進(jìn)而獲得攜帯目的基因的精子，然后本交或者人工授精，得到轉(zhuǎn)基因豬，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，能夠大大提高轉(zhuǎn)基因的效率。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案本發(fā)明一方面涉及ー種制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其特征在于包括如下步驟(a)將攜帯外源基因的載體與脂質(zhì)體溶液制成混合溶液；(b)將混合溶液注射到成年豬的睪丸中，其中注射點位于睪丸中心線兩側(cè)1.4-1. 6cm左右的位置，注射深度為1.4-1. 6cm左右； (c)兩個月后將睪丸注射的公豬與發(fā)情母豬進(jìn)行本交，所產(chǎn)仔豬即為轉(zhuǎn)基因豬。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方式中，所述的注射點位于睪丸中心線兩側(cè)1. 5cm左右
4CN 102533827 A
的位置，注射深度為1. 5cm左右。在本發(fā)明的另外ー個優(yōu)選實施方式中，還包括對所產(chǎn)仔豬進(jìn)行基因表達(dá)情況檢測以篩選轉(zhuǎn)基因豬。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方式中，在睪丸中心線兩側(cè)各包括至少3個注射位點， 優(yōu)選為5個注射位點。 在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方式中，上述制備轉(zhuǎn)基因豬方法是非治療目的和/或非診斷目的的。通過本發(fā)明的方法，相比于隨機注射，選擇特定的注射位點和注射深度能夠極大的提高轉(zhuǎn)基因的效率。
具體實施例方式材料脂質(zhì)體；碘酊；安定注射劑，攜帯外源基因的載體質(zhì)粒pEGFP-Nl-pGH載體， 報告基因為EGFP基因-增強型綠色熒光蛋白基因，目的基因為pGH基因-豬生長激素基因。步驟1.將6ml濃度為400-500ng/l·! 1左右質(zhì)粒載體與6ml脂質(zhì)體 (LipofectamineTM2000)溶液混合均勻，室溫下孵育半個小時；2.睪丸注射前將成年公豬進(jìn)行麻酔或者綁定，待其安定后，用酒精棉球?qū)⒇i睪丸表面皮膚擦拭干凈；3.在睪丸中心線兩側(cè)1. 5cm左右的位置隨機各選擇5個注射點，用Iml注射器吸取600微升載體與脂質(zhì)體混合物注射到豬睪丸組織中，針頭插入深度根據(jù)豬體型大小來確定，大約1.5cm左右，ー邊注射一邊向外拉針，注射完畢后將針頭停留在睪丸組織中30s左右，防止液體外流；4.兩個月后將睪丸注射的公豬與發(fā)情母豬進(jìn)行本交，待產(chǎn)仔后經(jīng)檢測其基因的表達(dá)情況，經(jīng)檢測，在100頭仔豬中有43頭仔豬為陽性轉(zhuǎn)基因豬，即帶有外源基因的仔豬占所有仔豬的比例為43%左右。當(dāng)理解的是，上述具體實施方式
僅僅是舉例性說明，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說， 可以根據(jù)上述說明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其特征在于包括如下步驟(a)將攜帶外源基因的載體與脂質(zhì)體溶液制成混合溶液；(b)將混合溶液注射到成年豬的睪丸中，其中注射點位于睪丸中心線兩側(cè)1.4-1. 6cm左右的位置，注射深度為1.4-1. 6cm左右；(c)兩個月后將睪丸注射的公豬與發(fā)情母豬進(jìn)行本交，所產(chǎn)仔豬即為轉(zhuǎn)基因豬。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備轉(zhuǎn)基因豬方法，所述的注射點位于睪丸中心線兩側(cè) 1. 5cm左右的位置，注射深度為1. 5cm左右。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備轉(zhuǎn)基因豬方法，還包括對所產(chǎn)仔豬進(jìn)行基因表達(dá)情況檢測以篩選轉(zhuǎn)基因豬。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備轉(zhuǎn)基因豬方法，在睪丸中心線兩側(cè)各包括至少3個注射位點，優(yōu)選為5個注射位點。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項所述的制備轉(zhuǎn)基因豬方法，所述制備轉(zhuǎn)基因豬方法是非治療目的和/或非診斷目的的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其特征在于包括如下步驟(a)將攜帶外源基因的載體與脂質(zhì)體溶液制成混合溶液；(b)將混合溶液注射到成年豬的睪丸中，其中注射點位于睪丸中心線兩側(cè)1.4-1.6cm左右的位置，注射深度為1.4-1.6cm左右；(c)兩個月后將睪丸注射的公豬與發(fā)情母豬進(jìn)行本交，所產(chǎn)仔豬即為轉(zhuǎn)基因豬。相比于隨機注射，通過本發(fā)明的方法，選擇特定的注射位點和注射深度能夠極大的提高轉(zhuǎn)基因的效率。
文檔編號C12N15/63GK102533827SQ20111038556
公開日2012年7月4日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者孫仁遠(yuǎn), 張元法, 林李, 胡愛梅, 陳東 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)