專利名稱：一種制備轉(zhuǎn)基因豬精子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種制備轉(zhuǎn)基因豬精子的方法，特別涉及磁性納米顆粒介導(dǎo)的制備轉(zhuǎn)基因豬精子的方法。
背景技術(shù)：
轉(zhuǎn)基因技術(shù)開始于20世紀(jì)80年代，目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有顯微原核注射法，逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法，胚胎干細胞介導(dǎo)法，體細胞核移植技木，精子載體法，胞漿內(nèi)單精子注射法，卵母細胞載體法等。精子載體法是將精子作為外源基因的載體，在受精過程中將外源基因?qū)雱游锱咛ィ⑹雇庠碊NA整合到染色體中，從而使外源基因進入子代的基因組中目前，應(yīng)用精子為載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移獲得轉(zhuǎn)基因動物主要通過以下途徑來實現(xiàn)的體外精子轉(zhuǎn)染法和體內(nèi)精子轉(zhuǎn)染法體外精子轉(zhuǎn)染法又可以分為精子與外源DNA直接共孵育法，體外電穿孔導(dǎo)入法和脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法；體內(nèi)精子轉(zhuǎn)染法又可以分為輸精管注射轉(zhuǎn)染法、曲細精管注射轉(zhuǎn)染法、 睪丸注射轉(zhuǎn)染法等。1971年，Bracket等首次證實精子具有吸附結(jié)合外源DNA能力，并將外源DNA在受精時攜帶進入卵母細胞。1992年，Lavitrano等應(yīng)用此法得到陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)成熟精子頭部具有吸收外源DNA的能力，其吸收區(qū)域是具有特異性的，該區(qū)域位于精子頭部的頂體后區(qū)(post-acrosomal region)，即靠近精核的區(qū)域。沈新明等直接用人巨細胞病毒啟動子調(diào)控的增強型綠色熒光蛋白表達載體注射到小鼠的曲精細管內(nèi)，最后通過與雌鼠交配，成功獲得了表達綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因仔鼠。袁進等報道向通過向曲精細管內(nèi)注射外源DNA，然后再結(jié)合對曲精細管電擊或電穿孔處理，以使外源基因進入睪丸生精細胞然后將這些處理的雄鼠與母鼠交配，得到的小鼠中有一組的陽性檢測率達25%。Sien 等則將處理方法更為簡化，首先直接向雄兔睪丸內(nèi)注射攜帯綠色熒光表達的外源DNA及ニ 甲基亞楓的介質(zhì)，使DNA能夠進入睪丸細胞和生精細胞。一個月后用處理的雄兔與雌兔交配，所產(chǎn)生后代的56%仔兔能高效地表達所導(dǎo)入的外源基因。這ー轉(zhuǎn)入外源基因的陽性率大大高于以往精子載體法或其他非定點轉(zhuǎn)基因方法的結(jié)果。李碧春等以重組的緑色熒光蛋白基因為標(biāo)記，首次在家雞上通過采用公雞睪丸內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞(spermatogonial stem cells, SSCs)和體外轉(zhuǎn)染SSCs再移植的方法成功地生產(chǎn)出了轉(zhuǎn)基因雞，并且在家鴨和家雞上轉(zhuǎn)染功能基因進行驗證，結(jié)果均說明該方法無需特殊的儀器要求，即可完成轉(zhuǎn)染外源基因的過程，方法簡單，操作方便，效率高，成本低，可大批量地生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞群，該方法的建立在家禽上意義重大，突破了制約家禽轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的瓶頸，解決了家禽轉(zhuǎn)基因難的問題，特別是體外轉(zhuǎn)染移植的成功，不僅解決了家禽轉(zhuǎn)基因難的問題，而且為成體干細胞的應(yīng)用開辟了更廣闊的應(yīng)用前景。精子載體法中精子孵育前的預(yù)處理通常使精子的受精能力下降，于是許多學(xué)者嘗試借鑒醫(yī)學(xué)上的輔助生殖技術(shù)ICSI使處理精子受精，精子胞質(zhì)內(nèi)顯微受精技術(shù)是借助顯微操作儀將ー個精子或生精細胞直接注入卵母細胞質(zhì)內(nèi)，從而完成受精的過程。它降低了對精子各種指標(biāo)的要求，使各種在體內(nèi)外不可能發(fā)生正常受精的卵子受精，同時可以避免多精子受精，也為研究異種間受精提供了有效的途徑1999年。美國科學(xué)家Perry等W4] 人首次將ICSI技術(shù)應(yīng)用于動物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠隨即，研究者們分別在獼猴豬上也進行ICSI轉(zhuǎn)基因的嘗試，胚胎轉(zhuǎn)基因陽性率也很高，然而這些實驗最終并沒有得到出生的轉(zhuǎn)基因動物2006年，Kurom等把精子與攜帯有人白蛋白(hALB)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的DNA序列片斷共孵化，通過ICSI方法生產(chǎn)的胚胎移植后生產(chǎn)出ー頭含有hALB和GFP基因的轉(zhuǎn)基因小豬Garc' a-Va' zquez等將豬的精子經(jīng)不同方法處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)凍融處理(frozen-thawing，F(xiàn)T)，不加冷凍保護劑速凍處理(quick freezing without cryoprotectant agents, QF)以及用iTriton X-IOO (TX-IOO)處理過的精子與新鮮的精子相比，它們結(jié)合外源DNA的能力明顯增強，但其發(fā)育能力降低QF和ΤΧ-100處理精子所造成精子細胞膜的損傷與FT造成的損傷更能促進精子與外源DNA地結(jié)合實驗還發(fā)現(xiàn)，用新鮮的精子與用FT和ΤΧ-100處理的精子經(jīng)ICSI發(fā)育的胚胎中，EGFP表達的胚胎陽性率相近(分別為 37. 04士3. 52%,43. 54士5. 41%和 29. 03士8. 29% )，而經(jīng) QF 處理過的精子，EGFP 胚胎的陽性率明顯提高(80. 43士5. 91%)。這表明精子的細胞膜在DNA相互作用中起著至關(guān)重要的作用，經(jīng)處理過的精子細胞膜更有利于外源DNA與精子染色體結(jié)合，但經(jīng)QF和ΤΧ-100 處理，可能嚴(yán)重損傷精子的細胞核，引起DNA破碎，或?qū)е氯旧w的破損，從而對胚胎將來的發(fā)育有害。目前，轉(zhuǎn)基因技術(shù)主要有DNA顯微注射法、胚胎干細胞介導(dǎo)法、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法、精子載體法等。用這些方法己能有效地將外源基因?qū)氚屑毎麅?nèi)，并獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因動物。這些技術(shù)的成功運用掲示了生產(chǎn)攜帶有外源DNA的動物是可能的，但是這些基因轉(zhuǎn)移方法也存在某些局限性。如顯微注射法操作程序復(fù)雜、對胚胎損傷大，對技術(shù)、設(shè)備要求高，特別是在牛羊豬等有開發(fā)應(yīng)用價值的大型哺乳動物上的低效率(低于)，極大地制約了該技術(shù)的應(yīng)用前景；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法雖然基因轉(zhuǎn)移的效率較高，但是基因插入是隨機的，且逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量有限，僅能攜帶小于IOKb的外源DNA片段，而且逆轉(zhuǎn)錄病毒主要感染早期胚胎的活躍分離期細胞，因而獲得的多為嵌合體動物，對于轉(zhuǎn)基因動物的下游篩選、培育、建系帶來很大的人力、物力、財カ負擔(dān)；此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒易將病原體基因序列引入宿主基因組，動物的生物安全性受都到質(zhì)疑。而精子載體法穩(wěn)定性較差，可重復(fù)率較低。普通的睪丸注射法由于直接注射載體質(zhì)粒，轉(zhuǎn)基因效率較低，且結(jié)果不穩(wěn)定。精子載體法是將精子作為外源基因的載體，在受精過程中將外源基因?qū)雱游锱咛?，并使外源DNA整合到染色體中，從而使外源基因進入子代的基因組中目前，應(yīng)用精子為載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移獲得轉(zhuǎn)基因動物主要通過以下途徑來實現(xiàn)的體外精子轉(zhuǎn)染法和體內(nèi)精子轉(zhuǎn)染法體外精子轉(zhuǎn)染法又可以分為精子與外源DNA直接共孵育法，體外電穿孔導(dǎo)入法和脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法；體內(nèi)精子轉(zhuǎn)染法又可以分為輸精管注射轉(zhuǎn)染法、曲細精管注射轉(zhuǎn)染法、 睪丸注射轉(zhuǎn)染法等。1971年，Bracket等首次證實精子具有吸附結(jié)合外源DNA能力，并將外源DNA在受精時攜帶進入卵母細胞。1992年，Lavitrano等應(yīng)用此法得到陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，并發(fā)現(xiàn)成熟精子頭部具有吸收外源DNA的能力，其吸收區(qū)域是具有特異性的，該區(qū)域位于精子頭部的頂體后區(qū)(post-acrosomal region)，即靠近精核的區(qū)域。沈新明等直接用人巨細胞病毒啟動子調(diào)控的增強型綠色熒光蛋白表達載體注射到小鼠的曲精細管內(nèi)，最后通過與雌鼠交配，成功獲得了表達綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因仔鼠。袁進等報道向通過向曲精細管內(nèi)注射外源DNA，然后再結(jié)合對曲精細管電擊或電穿孔處理，以使外源基因進入睪丸生精細胞然后將這些處理的雄鼠與母鼠交配，得到的小鼠中有一組的陽性檢測率達25%。Sien 等則將處理方法更為簡化，首先直接向雄兔睪丸內(nèi)注射攜帯綠色熒光表達的外源DNA及ニ 甲基亞楓的介質(zhì)，使DNA能夠進入睪丸細胞和生精細胞。一個月后用處理的雄兔與雌兔交配，所產(chǎn)生后代的56%仔兔能高效地表達所導(dǎo)入的外源基因。這ー轉(zhuǎn)入外源基因的陽性率大大高于以往精子載體法或其他非定點轉(zhuǎn)基因方法的結(jié)果。李碧春等以重組的緑色熒光蛋白基因為標(biāo)記，首次在家雞上通過采用公雞睪丸內(nèi)轉(zhuǎn)染精原干細胞(spermatogonial stem cells, SSCs)和體外轉(zhuǎn)染SSCs再移植的方法成功地生產(chǎn)出了轉(zhuǎn)基因雞，并且在家鴨和家雞上轉(zhuǎn)染功能基因進行驗證，結(jié)果均說明該方法無需特殊的儀器要求，即可完成轉(zhuǎn)染外源基因的過程，方法簡單，操作方便，效率高，成本低，可大批量地生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因雞群，該方法的建立在家禽上意義重大，突破了制約家禽轉(zhuǎn)基因生產(chǎn)的瓶頸，解決了家禽轉(zhuǎn)基因難的問題，特別是體外轉(zhuǎn)染移植的成功，不僅解決了家禽轉(zhuǎn)基因難的問題，而且為成體干細胞的應(yīng)用開辟了更廣闊的應(yīng)用前景。精子載體法中精子孵育前的預(yù)處理通常使精子的受精能力下降，于是許多學(xué)者嘗試借鑒醫(yī)學(xué)上的輔助生殖技術(shù)ICSI使處理精子受精，精子胞質(zhì)內(nèi)顯微受精技術(shù)是借助顯微操作儀將ー個精子或生精細胞直接注入卵母細胞質(zhì)內(nèi)，從而完成受精的過程。它降低了對精子各種指標(biāo)的要求，使各種在體內(nèi)外不可能發(fā)生正常受精的卵子受精，同時可以避免多精子受精，也為研究異種間受精提供了有效的途徑1999年。美國科學(xué)家Perry等W4] 人首次將ICSI技術(shù)應(yīng)用于動物轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域，成功地獲得了轉(zhuǎn)基因小鼠隨即，研究者們分別在獼猴豬上也進行ICSI轉(zhuǎn)基因的嘗試，胚胎轉(zhuǎn)基因陽性率也很高，然而這些實驗最終并沒有得到出生的轉(zhuǎn)基因動物2006年，Kurom等把精子與攜帯有人白蛋白(hALB)基因和綠色熒光蛋白(GFP)基因的DNA序列片斷共孵化，通過ICSI方法生產(chǎn)的胚胎移植后生產(chǎn)出ー頭含有hALB和GFP基因的轉(zhuǎn)基因小豬Garc' a-Va' zquez等將豬的精子經(jīng)不同方法處理，發(fā)現(xiàn)經(jīng)凍融處理(frozen-thawing，F(xiàn)T)，不加冷凍保護劑速凍處理(quick freezing without cryoprotectant agents, QF)以及用iTriton X-IOO (TX-IOO)處理過的精子與新鮮的精子相比，它們結(jié)合外源DNA的能力明顯增強，但其發(fā)育能力降低QF和ΤΧ-100處理精子所造成精子細胞膜的損傷與FT造成的損傷更能促進精子與外源DNA地結(jié)合實驗還發(fā)現(xiàn)，用新鮮的精子與用FT和ΤΧ-100處理的精子經(jīng)ICSI發(fā)育的胚胎中，EGFP表達的胚胎陽性率相近(分別為 37. 04士3. 52%,43. 54士5. 41%和 29. 03士8. 29% )，而經(jīng) QF 處理過的精子，EGFP 胚胎的陽性率明顯提高(80. 43士5. 91%)。這表明精子的細胞膜在DNA相互作用中起著至關(guān)重要的作用，經(jīng)處理過的精子細胞膜更有利于外源DNA與精子染色體結(jié)合，但經(jīng)QF和ΤΧ-100 處理，可能嚴(yán)重損傷精子的細胞核，引起DNA破碎，或?qū)е氯旧w的破損，從而對胚胎將來的發(fā)育有害。胞漿內(nèi)單精子注射仍需顯微操作，但與原核注射相比技術(shù)難度降低很多。另外，對于ー些卵透明度不好的物種(如牛、羊、豬)，ICSI更能體現(xiàn)出技術(shù)上的優(yōu)勢；再有，精子注射針的尖端截面積約為顯微注射針的100倍左右，對DNA沒有任何剪切，尤其適合基因組 DNA, BAC或YAC庫DNA大片段操作。同時ICSI法還具有受精率比較高，多精受精率低，排除透明帶和卵質(zhì)膜對精子入卵的阻礙作用、其受精率，不受精子濃度、形態(tài)和活力的影響等一系列優(yōu)點。但通過該方法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物，體外發(fā)育率低，仍許多問題有待解決。綜上所述，現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因技術(shù)均存在成本高，投資大，技術(shù)要求高，操作復(fù)雜，轉(zhuǎn)基因效率較低等缺點。所以，尋找ー種省吋，省力且效率較高的轉(zhuǎn)基因方法迫在眉睫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的在精子載體法基礎(chǔ)上建立起來的，通過對新鮮豬精子轉(zhuǎn)染外源基因，進而獲得攜帯目的基因的精子，然后通過人工授精，得到轉(zhuǎn)基因豬，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案， 選擇特定的孵育時間，特定的濃度配比，能夠大大提高轉(zhuǎn)基因的效率。為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下技術(shù)方案本發(fā)明一方面涉及ー種制備轉(zhuǎn)基因豬精子的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將新鮮豬精液放置到16_18°C冰箱中平放保存，每7-9個小時輕輕翻轉(zhuǎn)精子， 防止精子沉淀；(2)每80mL精液里面加入500-700微升磁性納米液體材料和500-700微升的質(zhì)粒載體，輕輕混勻，然后室溫孵育，每15-25min輕輕翻轉(zhuǎn)1_10次，孵育SO-IOOmin得到轉(zhuǎn)基因豬斗B子。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方式中，所述的質(zhì)粒載體是pEGFP-Nl-pGH載體，報告基因為EGFP基因-增強型綠色熒光蛋白基因，目的基因為pGH基因-豬生長激素基因。在本發(fā)明的另外ー個優(yōu)選實施方式中，所述的磁性納米顆粒是產(chǎn)品名稱 PolyMAG-1000, PEI修飾的氧化鐵磁性納米顆粒，貨號9003，廠家為Chemicell。本發(fā)明另外一方面還涉及上述轉(zhuǎn)基因豬精子在制備轉(zhuǎn)基因豬中的用途，其特征在于將轉(zhuǎn)基因豬精子通過人工授精的方法給予母豬，所述的人工授精方式優(yōu)選是非外科手術(shù)方式的，例如注射等。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方式中，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因豬精子是新鮮制備的。本發(fā)明另外一方面還涉及制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其包括上述轉(zhuǎn)基因豬精子的制備步驟，其特征在于將攜帯外源基因的豬精子通過人工授精的方法給予母豬，所述的人工授精方式優(yōu)選是非外科手術(shù)方式的。在本發(fā)明的ー個優(yōu)選實施方式中，上述制備轉(zhuǎn)基因豬的用途和方法都是非治療目的和/或非診斷目的的。本發(fā)明通過選擇特定的孵育時間和濃度配比，相比于其它時間和濃度配比，能夠顯著的提高轉(zhuǎn)基因的效率，達到45%左右。
具體實施例方式材料磁性納米顆粒購于Chemicell、產(chǎn)品名稱PolyMAG-1000，PEI修飾的氧化鐵磁性納米顆粒，貨號9003 ；攜帶外源基因的載體質(zhì)粒pEGFP-Nl-pGH載體，報告基因為EGFP 基因-增強型綠色熒光蛋白基因，目的基因為PGH基因-豬生長激素基因。步驟(1)購買新鮮豬精液兩瓶，每瓶80毫升，有效精子數(shù)為30億，每毫升為3. 75千萬精子，然后將精子放置到17°C冰箱中平放保存，每8個小時輕輕翻轉(zhuǎn)精子，防止精子沉淀；(2)每瓶精液里面加入600微升磁性納米液體材料和600微升的質(zhì)粒載體，輕輕混勻，然后放置在室溫(25°C )孵育，每20min輕輕翻轉(zhuǎn)幾次。90min后人工授精至發(fā)情的母豬；(3) 114天妊娠后產(chǎn)仔，檢測，轉(zhuǎn)基因豬出生，待產(chǎn)仔后經(jīng)檢測其基因的表達情況， 檢測綠色熒光蛋白基因的表達，其中在100頭仔豬中有45頭仔豬為陽性轉(zhuǎn)基因豬，即帶有外源綠色熒光蛋白基因的仔豬占所有仔豬的比例為45%左右。當(dāng)理解的是，上述具體實施方式
僅僅是舉例性說明，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說， 可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護范圍。
權(quán)利要求
1.ー種制備轉(zhuǎn)基因豬精子的方法，其特征在于包括如下步驟(1)將新鮮豬精液放置到16-18°C冰箱中平放保存，每7-9個小時輕輕翻轉(zhuǎn)精子，防止精子沉淀；(2)每80mL精液里面加入500-700微升聚乙烯亞胺(PEI)包裹的氧化鐵磁性磁性納米顆粒液體材料和500-700微升的濃度為500-800 μ g/ml質(zhì)粒載體，輕輕混勻，然后室溫孵育，每15-25min輕輕翻轉(zhuǎn)1_10次，孵育SO-IOOmin得到轉(zhuǎn)基因豬精子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備轉(zhuǎn)基因豬精子的方法，所述的質(zhì)粒載體是pEGFP-Nl-pGH 載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備轉(zhuǎn)基因豬精子的方法，所述的磁性納米顆粒是 Chemicell 公司生產(chǎn)的 PolyMAG-1000。
4.權(quán)利要求1-3任意一項所述的方法制備的轉(zhuǎn)基因豬精子在制備轉(zhuǎn)基因豬中的用途， 其特征在于將轉(zhuǎn)基因豬精子通過人工授精的方法給予母豬，所述的人工授精方式優(yōu)選是非外科手術(shù)方式的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于人工授精是通過注射來實現(xiàn)的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因豬精子是新鮮制備的。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任意一項所述的用途，制備轉(zhuǎn)基因豬的用途是非治療目的和/或非診斷目的的。
8.ー種制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其包括權(quán)利要求1-3任意ー項所述的轉(zhuǎn)基因豬精子的制備方法，其特征在于將轉(zhuǎn)基因豬精子通過人工授精的方法給予母豬，所述的人工授精方式優(yōu)選是非外科手術(shù)方式的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其特征在于人工授精是通過注射來實現(xiàn)的。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備轉(zhuǎn)基因豬的方法，其特征在于所述的轉(zhuǎn)基因豬精子是新鮮制備的。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備轉(zhuǎn)基因豬精子的方法，通過對新鮮豬精子轉(zhuǎn)染外源基因，進而獲得攜帶目的基因的轉(zhuǎn)基因精子，然后通過人工授精，得到轉(zhuǎn)基因豬。相比于其它方法，通過本發(fā)明的方法，選擇特定的孵育時間和濃度比例，能夠顯著的提高轉(zhuǎn)基因的效率。
文檔編號C12N15/85GK102559751SQ20111038556
公開日2012年7月11日 申請日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者吳明明, 孫金海, 崔海信, 李奎 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)