專(zhuān)利名稱(chēng)：一種實(shí)現(xiàn)細(xì)胞集落均質(zhì)性生長(zhǎng)的裝置和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種細(xì)胞集落生長(zhǎng)裝置，特別涉及一種實(shí)現(xiàn)全能干細(xì)胞集落均質(zhì)性生長(zhǎng)的裝置，同時(shí)也涉及利用該裝置調(diào)控全能干細(xì)胞的自我更新和定向分化的方法。
背景技術(shù)：
全能干細(xì)胞(totipotent stem cell, TSC)是指具有無(wú)限分化潛能,能分化成所有組織和器官的干細(xì)胞，主要包括胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell, ESC)和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cells, iPS)兩類(lèi)。
胚胎干細(xì)胞是從哺乳動(dòng)物早期胚胎中分離培養(yǎng)出來(lái)的，其特點(diǎn)是具有發(fā)育的全能性，參與整個(gè)生物體的發(fā)育，并構(gòu)成人體的各種組織和器官。胚胎干細(xì)胞取自原腸胚期的囊胚，進(jìn)一步分化可形成專(zhuān)能干細(xì)胞。如肝臟祖細(xì)胞，骨髓造血干細(xì)胞等。從技術(shù)角度來(lái)說(shuō)，“全能性”的胚胎干細(xì)胞對(duì)于治療性克隆來(lái)說(shuō)是最理想的。
然而，由于人類(lèi)胚胎干細(xì)胞研究觸及倫理和道德，在很多國(guó)家被法律禁止，相關(guān)研究也處于進(jìn)退兩難的境地。2007年，日本和美國(guó)科學(xué)家分別宣布發(fā)現(xiàn)將普通皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞的方法，這樣得到的干細(xì)胞和具有與胚胎干細(xì)胞類(lèi)似的功能，被稱(chēng)為誘導(dǎo)多功能干細(xì)胞，即iPS細(xì)胞。這一發(fā)現(xiàn)分別被《自然》和《科學(xué)》兩大權(quán)威科學(xué)雜志評(píng)為當(dāng)年重大科學(xué)進(jìn)展。
iPS細(xì)胞是“初始化”后的普通體細(xì)胞，但具有和胚胎干細(xì)胞類(lèi)似的功能，能分化生成各種組織細(xì)胞。更重要的是，它繞開(kāi)了胚胎干細(xì)胞研究一直面臨的倫理和法律等諸多障礙，醫(yī)療領(lǐng)域的應(yīng)用前景非常廣闊。美國(guó)、日本等許多國(guó)家更是以極大熱情，或加大投入，或制訂鼓勵(lì)政策，推動(dòng)這一新興的干細(xì)胞研究。中國(guó)干細(xì)胞基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究起步較早，2001年后，與干細(xì)胞相關(guān)的重大研究項(xiàng)目不少于二十個(gè)。此外，國(guó)家還在研發(fā)網(wǎng)絡(luò)建設(shè)、人才建設(shè)、研究平臺(tái)搭建等方面給予了大力支持，為中國(guó)在該研究領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)地位奠定了基礎(chǔ)。中科院動(dòng)物研究所周琪和北京生命科學(xué)研究所高紹榮的研究團(tuán)隊(duì)分別利用iPS細(xì)胞克隆出小鼠，從而在世界上首次證明了 iPS細(xì)胞的全能性，說(shuō)明完全通過(guò)體外操作可得到與胚胎干細(xì)胞具有同樣分化能力的細(xì)胞。這項(xiàng)成果是從干細(xì)胞研究邁向?qū)嶋H醫(yī)療過(guò)程中的一大步，對(duì)干細(xì)胞全能性的機(jī)理研究以及器官移植、藥物篩選、基因治療等臨床應(yīng)用研究具有重要價(jià)值。
全能干細(xì)胞的集落性生長(zhǎng) 對(duì)于干細(xì)胞全能性的維持具有非常重要的作用。以人胚胎干細(xì)胞(hESC)為例，經(jīng)典培養(yǎng)方法是在以小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)為代表的經(jīng)過(guò)滅活的飼養(yǎng)層細(xì)胞上進(jìn)行的，同時(shí)也有研究證實(shí)，在合適的化學(xué)因素作用下，細(xì)胞外基質(zhì)也能作為培養(yǎng)基底維持hESC的自我更新，如基質(zhì)膠、膠原、層連接蛋白、纖維連接蛋白中的一種或其混合物。在單細(xì)胞狀態(tài)下，hESC的存活率較低，因此經(jīng)典的傳代方法是將其集落消化或切碎成為含有約100個(gè)細(xì)胞的團(tuán)簇。無(wú)論采用何種傳代技術(shù)，操作關(guān)鍵是將hESC保持在細(xì)胞團(tuán)簇的狀態(tài)。然而，這種方法很大程度上取決于操作人員的素質(zhì)和手法，并最終形成形狀和大小隨機(jī)的、細(xì)胞密度隨機(jī)的、異質(zhì)性的hESC集落，但同時(shí)過(guò)大或者過(guò)小的細(xì)胞團(tuán)簇都有更明顯的分化趨勢(shì)。正是由于全能干細(xì)胞自我更新的特殊要求，現(xiàn)階段的培養(yǎng)和傳代方法很難得到均質(zhì)性的全能干細(xì)胞集落。
目前，越來(lái)越多的研究證明，全能干細(xì)胞集落的均質(zhì)性對(duì)其自我更新和后續(xù)分化都具有至關(guān)重要的意義。以hESC為例，集落的尺寸和細(xì)胞組成對(duì)分化誘導(dǎo)因素和全能性維持因素有調(diào)節(jié)作用，尤其是與集落尺寸直接相關(guān)的Smadl信號(hào)是由胚胎干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞衍生的胚胎內(nèi)胚層細(xì)胞的拮抗作用激發(fā)的，介導(dǎo)胚胎內(nèi)胚層細(xì)胞的分泌骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2)和胚胎干細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)分化因子-3(⑶F3)發(fā)生作用。通過(guò)單獨(dú)調(diào)控Smadl激活可以拯救胚胎干細(xì)胞的自發(fā)分化，提示hESC集落的大小可以獨(dú)立調(diào)控干細(xì)胞的分化和自我更新，但是在經(jīng)典培養(yǎng)條件下無(wú)法調(diào)節(jié)集落尺寸大小，在隨機(jī)的集落尺寸、細(xì)胞密度和分子微環(huán)境的共同作用下必然存在不可控的自發(fā)分化，影響胚胎干細(xì)胞的增殖和自我更新。
全能干細(xì)胞集落的異質(zhì)性和大小差異對(duì)于干細(xì)胞的分化命運(yùn)同樣具有重要影響，不可控的初始干細(xì)胞集落通常導(dǎo)致不一致或不穩(wěn)定的分化結(jié)果和分化效率，這是全能干細(xì)胞分化研究面臨的普遍問(wèn)題。通過(guò)微圖像化(micropatterning)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),尺寸較小的集落向心肌細(xì)胞分化的趨勢(shì)更明顯，而尺寸較大的集落向神經(jīng)細(xì)胞分化的趨勢(shì)更明顯全能干細(xì)胞培養(yǎng)基底的機(jī)械性能對(duì)于細(xì)胞的自我更新和分化命運(yùn)也有重要影響。研究證明，基底的彈性模量約為0.6kPa時(shí)，對(duì)于小鼠胚胎干細(xì)胞的自我更新有很好的維持作用，此機(jī)械強(qiáng)度與體內(nèi)組織相似；類(lèi)似地，在未添加化學(xué)信號(hào)刺激的條件下，機(jī)械強(qiáng)度較高的培養(yǎng)基底具有誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的作用，而機(jī)械強(qiáng)度較低的基底能誘導(dǎo)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞方向分化；更深入的研究證明合適的機(jī)械應(yīng)力能夠抑制hESC的自發(fā)分化，并促進(jìn)其自我更新，當(dāng)雙向循環(huán)應(yīng)力與化學(xué)信號(hào)協(xié)同作用時(shí)能調(diào)控hESC的自我更新和分化，對(duì)于干細(xì)胞分化和細(xì)胞治療等領(lǐng)域的研究具有重要意義。
因此全能干細(xì)胞最理想的培養(yǎng)平臺(tái)應(yīng)在維持干細(xì)胞顯型和核型正常的前提下包含以下三方面的因素:可控的集落形狀和尺寸、物理和化學(xué)性質(zhì)可調(diào)的培養(yǎng)基底、合適的傳代方法已實(shí)現(xiàn)可調(diào)、穩(wěn)定的細(xì)胞種植密度。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置。
本發(fā)明所提供的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置包括具有若干微圖形空腔的微圖形化模板和位于所述微圖形化 模板下的粘性水凝膠；所述粘性水凝膠與所述微圖形化模板交聯(lián)粘著為整體，所述粘性水凝膠形成所述微圖形空腔的底；所述微圖形化模板的每個(gè)所述微圖形空腔的形狀和體積決定細(xì)胞集落生長(zhǎng)的物理空間。
根據(jù)需要，所述細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置還可包括位于所述粘性水凝膠下的基底，或位于所述粘性水凝膠下并嵌入所述微圖形化模板的多孔培養(yǎng)皿。
所述粘性水凝膠用可交聯(lián)形成水凝膠的天然生物材料和/或人工合成生物材料制成，所述天然生物材料選自下述材料中的至少一種:明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白和纖維連接蛋白；所述人工合成生物材料選自下述材料中的至少一種:聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羥基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，用作所述微圖形化模板的材料具體為聚甲基丙烯酸甲酯；用作所述粘性水凝膠的材料，具體由明膠-甲基丙烯酸甲酯和光引發(fā)劑Irgacure2959(12959,2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮)組成；所述明膠_甲基丙烯酸甲酯為明膠與甲基丙烯酸甲酯的使用配比為Ig所述明膠比Iml所述甲基丙烯酸甲酯的聚合物。所述明膠-甲基丙烯酸甲酯具體可按照如下方法制備:lg明膠粉末加入IOmL DPBS溶液中，50°C水浴加熱，均勻攪拌至完全融化后，以0.5mL/min緩慢加入ImL甲基丙烯酸甲酯，反應(yīng)2h后取下，待溶液冷卻至室溫，加入40mL DPBS溶液稀釋?zhuān)媒亓舴肿恿?000-12000的透析袋在去離子水中60°C透析I周，離心取上清液冷凍干燥I周，形成白色蓬松泡沫狀固體，_80°C保存。
所述粘性水凝膠具體可按照包括如下步驟的方法制備:1)將所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶于DMEM培養(yǎng)液，得到明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中所述明膠-甲基丙烯酸甲酯的含量為每IOOml所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中含有5g所述明膠-甲基丙烯酸甲酯；2)將所述光引發(fā)劑2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于無(wú)水乙醇，得到光引發(fā)劑溶液，所述光引發(fā)劑溶液中所述2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮的含量為每IOOml所述光引發(fā)劑溶液中含有IOg所述2-羥基-4- (2-羥乙氧基)-2_甲基苯丙酮；3)將所述光引發(fā)劑溶液與所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液按照體積比1: 20的比例混合。
所述DMEM培養(yǎng)液可由商業(yè)途徑獲得，如Invitrogen公司的產(chǎn)品編號(hào)為11965092的產(chǎn)品。
在制備所述粘性水凝膠時(shí)，根據(jù)需要，還可在所述粘性水凝的上表面涂覆細(xì)胞外基質(zhì)成分，所述細(xì)胞外基質(zhì)成分包括膠原、明膠、基質(zhì)膠、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白、纖維連接蛋白。同時(shí)，還可以將生長(zhǎng)因子和化學(xué)信號(hào)嵌合于所述粘性水凝膠中。所述粘性水凝膠的厚度通常約為1-10 μ m。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置具體是按照如下方法構(gòu)建的:將所述微圖形化模板裝置于所述多孔培養(yǎng)皿中，將含有交聯(lián)劑的粘性水凝膠基溶液沿所述微圖形化模板底面均勻注入所述多孔培養(yǎng)皿，利用所述交聯(lián)劑的交聯(lián)作用以及所述粘性水凝膠的粘著力作用，將所述微圖形化模板和所述多孔培養(yǎng)皿表面連接成整體，形成由上至下依次為微圖形化模板-基底水凝膠層-培養(yǎng)皿表面的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置。
利用本發(fā)明所提供的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞集落的均質(zhì)性生長(zhǎng)。
本發(fā)明所提供的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置在調(diào)控全能干細(xì)胞自我更新和/或定向分化中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
所述全能干細(xì)胞為人胚胎干細(xì)胞；所述定向分化為人胚胎干細(xì)胞分化為肝樣細(xì)胞。
本發(fā)明與現(xiàn)有研究相比具有 如下優(yōu)點(diǎn):
1、本發(fā)明所提供細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置整合利用微圖形化模板和粘性水凝膠，可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞集落的形狀和尺寸、粘附基底的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)成分、生長(zhǎng)因子和化學(xué)信號(hào)、共培養(yǎng)細(xì)胞等多種因素的調(diào)控，且對(duì)各因素的調(diào)控手段相互獨(dú)立，互不干擾。
2、本發(fā)明所提供細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的增殖培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的原位進(jìn)行，使操作大大簡(jiǎn)化，同時(shí)減小對(duì)細(xì)胞的處理和損傷。
3、本發(fā)明所提供的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置制備工藝簡(jiǎn)便，配合商業(yè)化培養(yǎng)皿使用簡(jiǎn)便易行，無(wú)需改變細(xì)胞培養(yǎng)的原有操作步驟和細(xì)節(jié)且能保持很好的無(wú)菌環(huán)境。
4、本發(fā)明所提供細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置充分利用微圖形化技術(shù)，同時(shí)可方便地構(gòu)建多種細(xì)胞共培養(yǎng)環(huán)境，為高通量和高內(nèi)涵的模型構(gòu)建和篩選等研究提供了方便實(shí)用的手段。


圖1為微圖形化模板設(shè)計(jì)示意圖。其中，直徑大小不等的四種圓，根據(jù)直徑由小到大的順序依次代表直徑為300 μ m、500 μ mUOOO μ m或1500 μ m的細(xì)胞培養(yǎng)空間。
圖2為細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置示意圖。其中，I為培養(yǎng)皿，2為微圖形化模板，3為基底水凝膠層，4為細(xì)胞集落。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所提供的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置包括具有若干微圖形空腔的微圖形化模板和位于所述微圖形化模板下的粘性水凝膠；所述粘性水凝膠與所述微圖形化模板交聯(lián)粘著為整體；所述微圖形化模板的每個(gè)所述微圖形空腔的形狀和體積決定細(xì)胞集落生長(zhǎng)的物理空間。
根據(jù)需要，所述細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置還包括位于所述粘性水凝膠下的基底或位于所述粘性水凝膠下并嵌入所述微圖形化模板的多孔培養(yǎng)皿。
上層微圖形化模板可選擇拆卸或固定使用，以適應(yīng)后期細(xì)胞共培養(yǎng)或全能干細(xì)胞分化等用途。
所述微圖形化模板可采用本領(lǐng)域熟知的微圖形化方法獲得，如激光切割和雕刻，微圖形化模具成型等，結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)與制造技術(shù)，可調(diào)節(jié)細(xì)胞集落生長(zhǎng)空間和所述微圖形化模板整體的形狀 和尺寸。具體而言，通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)與制造技術(shù)可方便地實(shí)現(xiàn)各種微圖形空腔的形狀和尺寸，形狀如圓形、正方形、長(zhǎng)方形、菱形、梯形和各種不規(guī)則形狀等，尺寸為IOym 2cm不等，從而決定細(xì)胞集落生長(zhǎng)的物理空間；所述微圖形化模板的整體尺寸和形狀通常配合所用培養(yǎng)皿的使用尺寸而定，形狀多為規(guī)則圓形，直徑等于或略小于培養(yǎng)皿的使用直徑，可通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和制造技術(shù)方便地制備所需尺寸和形狀的所述微圖形模板；模板厚度以節(jié)省材料方便使用為宜，一般在100 μ m 2cm不等。
所述粘性水凝膠是支持培養(yǎng)細(xì)胞(如全能干細(xì)胞)或飼養(yǎng)層細(xì)胞(如小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)的生長(zhǎng)基底。所述粘性水凝膠用可交聯(lián)形成水凝膠的天然生物材料和/或人工合成生物材料制成，所述天然生物材料如明膠及其衍生物、藻酸鹽及其衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白、纖維連接蛋白等，合成生物材料包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羥基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氧化乙烯等，形成基底(下層粘性水凝膠)的材料可以是上述材料中的一種或幾種的混合物。交聯(lián)劑的種類(lèi)和使用量視基底生物材料的種類(lèi)和用量而定，以充分交聯(lián)為前提。
用作所述微圖形化模板的材料具體可為聚甲基丙烯酸甲酯；用作所述粘性水凝膠的材料，具體可由明膠-甲基丙烯酸甲酯和光引發(fā)劑Irgacure 2959 (12959，2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮)組成；所述明膠-甲基丙烯酸甲酯為明膠與甲基丙烯酸甲酯的使用配比為Ig所述明膠比Iml所述甲基丙烯酸甲酯的聚合物。所述明膠-甲基丙烯酸甲酯具體可按照如下方法制備:lg明膠粉末加入IOmL DPBS溶液中，50°C水浴加熱，均勻攪拌至完全融化后，以0.5mL/min緩慢加入ImL甲基丙烯酸甲酯，反應(yīng)2h后取下，待溶液冷卻至室溫，加入40mL DPBS溶液稀釋?zhuān)媒亓舴肿恿?000-12000的透析袋在去離子水中60°C透析I周，離心取上清液冷凍干燥I周，形成白色蓬松泡沫狀固體，_80°C保存。
所述粘性水凝膠具體可按照包括如下步驟的方法制備:1)將所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶于DMEM培養(yǎng)液，得到明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中所述明膠-甲基丙烯酸甲酯的含量為每IOOml所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中含有5g所述明膠-甲基丙烯酸甲酯；
2)將所述光引發(fā)劑2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2_甲基苯丙酮溶于無(wú)水乙醇，得到光引發(fā)劑溶液，所述光引發(fā)劑溶液中所述2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮的含量為每IOOml所述光引發(fā)劑溶液中含有IOg所述2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮；
3)將所述光引發(fā)劑溶液與所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液按照體積比1: 20的比例混合。
所述DMEM培養(yǎng)液可由商業(yè)途徑獲得，如Invitrogen公司的產(chǎn)品編號(hào)為11965092的產(chǎn)品。
根據(jù)需要，可以在所述粘性水凝膠的上表面涂覆細(xì)胞外基質(zhì)成分；所述細(xì)胞外基質(zhì)成分包括膠原、明膠、基質(zhì)膠、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白或纖維連接蛋白；也可以在所述粘性水凝膠中嵌合生長(zhǎng)因子和化學(xué)信號(hào)。
所述粘性水凝膠材料的使用量視培養(yǎng)皿的使用面積而定，以均勻覆蓋培養(yǎng)皿或硬質(zhì)基底表面為前提，一般為I μ I IOmi不等。
本發(fā)明所述細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置的構(gòu)建方法包括但不局限于以下四種:
I)設(shè)計(jì)和制備出需要尺寸和形狀的微圖形化模板后，裝置于多孔培養(yǎng)皿中，將基底生物材料沿模板底面均勻注入培養(yǎng)`皿后交聯(lián)，利用交聯(lián)劑的交聯(lián)作用和粘性水凝膠的粘性作用，將微圖形化模板和多孔培養(yǎng)皿表面連接形成整體，待交聯(lián)充分后洗去多余交聯(lián)劑和氣泡，即時(shí)使用或低溫保存待用。
2)先將基底生物材料均勻注入培養(yǎng)皿后交聯(lián)形成基底水凝膠層，再利用壓力將微圖形化模板與基底水凝膠層連接成為整體，充分洗去殘余交聯(lián)劑和氣泡后即時(shí)使用或低溫保存待用。
3)將玻璃片、塑料片等硬質(zhì)基底加工成與微圖形化模板一致的整體尺寸，在硬質(zhì)基底上形成基質(zhì)水凝膠層，然后利用壓力將微圖型化模板結(jié)合于水凝膠層表面成為整體，形成由下至上依次為硬質(zhì)基底-水凝膠-模板的三層整體結(jié)構(gòu)，將三層整體結(jié)構(gòu)嵌入培養(yǎng)M中，充分洗去殘余交聯(lián)劑和氣泡后即時(shí)使用或低溫保存待用。
4)先將片狀硬質(zhì)基底與微圖形化模板由下自上對(duì)齊或粘連，再將基底生物材料沿兩者間隙均勻注入并交聯(lián)，形成由下至上依次為硬質(zhì)基底-水凝膠-模板的三層整體結(jié)構(gòu)，將三層整體結(jié)構(gòu)嵌入培養(yǎng)皿中，充分洗去殘余交聯(lián)劑和氣泡后即時(shí)使用或低溫保存待用。
本發(fā)明提供的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞集落的均質(zhì)性生長(zhǎng)，可用于調(diào)控全能干細(xì)胞的自我更新和定向分化。這主要包括對(duì)于集落形狀、尺寸、基底機(jī)械強(qiáng)度等物理因素，基底成分、生長(zhǎng)因子、化學(xué)信號(hào)等化學(xué)要素和共培養(yǎng)細(xì)胞等生物要素的調(diào)控。
本發(fā)明調(diào)控集落形狀、尺寸、基底機(jī)械強(qiáng)度等物理因素的實(shí)現(xiàn)方法具體如下:切除模板材料形成微圖形空腔，構(gòu)成全能干細(xì)胞集落生長(zhǎng)的物理空間，因此集落的形狀和尺寸由微圖形化模板空腔的特征形狀和尺寸決定。通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和制造技術(shù)可方便地實(shí)現(xiàn)各種微圖形空腔的形狀和尺寸，并可通過(guò)在一個(gè)模板上切割不同物理屬性的空腔實(shí)現(xiàn)同一培養(yǎng)條件下不同集落形狀、尺寸和分布的的比較，對(duì)于高通量研究和篩選具有重要意義。以上所述模板空腔的形狀如圓形、正方形、長(zhǎng)方形、菱形、梯形和各種不規(guī)則形狀等，尺寸為10 μ m 2cm不等。
基底機(jī)械強(qiáng)度主要由基底水凝膠的材料(粘性水凝膠的材料)種類(lèi)、用量及其交聯(lián)程度決定，一般而言，基底水凝膠的材料用量越大、交聯(lián)程度越高，則其機(jī)械強(qiáng)度越大。特別地，基底機(jī)械強(qiáng)度可在細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置使用過(guò)程中通過(guò)人為調(diào)控或自發(fā)調(diào)控等過(guò)程來(lái)進(jìn)行干預(yù)，人為調(diào)控基底機(jī)械強(qiáng)度主要通過(guò)基底水凝膠材料的二次或多次交聯(lián)實(shí)現(xiàn)，如采用明膠-甲基丙烯酸甲酯作為基底水凝膠材料時(shí)，可分別通過(guò)紫外光、藍(lán)光等物理交聯(lián)方式和京尼平、戊二醛等化學(xué)交聯(lián)方式，方便地在需要時(shí)間和原位實(shí)現(xiàn)二次或多次交聯(lián)，其結(jié)果通常是基底水凝膠材料機(jī)械強(qiáng)度的提高；自發(fā)調(diào)控基底水凝膠材料的機(jī)械強(qiáng)度主要是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞-材料相互作用和材料降解實(shí)現(xiàn)的，其結(jié)果通常是基底水凝膠材料機(jī)械強(qiáng)度的降低。自發(fā)調(diào)控和人為調(diào)控的結(jié)合可實(shí)現(xiàn)基底水凝膠材料的機(jī)械強(qiáng)度原位、隨時(shí)、多次地調(diào)節(jié)和控制，以適應(yīng)全能干細(xì)胞自我更新和定向分化的要求，如在全能干細(xì)胞培養(yǎng)初期，較低的基底機(jī)械強(qiáng)度有利于干細(xì)胞的自我更新和全能性的維持，當(dāng)全能干細(xì)胞增殖形成均質(zhì)性集落后可進(jìn)行定向分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，如向肝樣細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰腺細(xì)胞等方向分化，此時(shí)較高的基底機(jī)械強(qiáng)度有利于干細(xì)胞的定向分化。通過(guò)本細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置及其調(diào)控方法可在原位實(shí)現(xiàn)全能干細(xì)胞集落的自我更新和定向分化誘導(dǎo)培養(yǎng)。上述基底水凝膠材料的使用量視培養(yǎng)皿的使用面積而定，以均勻覆蓋培養(yǎng)皿或硬質(zhì)基底表面為前提，一般為1μ I IOmi不等，交聯(lián)劑的種類(lèi)和使用量視 基底生物材料的種類(lèi)和用量而定，以充分交聯(lián)為前提。
本發(fā)明調(diào)控基底成分、生長(zhǎng)因子、化學(xué)信號(hào)分子等化學(xué)要素的具體方法如下:由于上層微圖形化模板和下層粘性水凝膠的不同的生物和理化屬性、不同的垂直高度以及吹打抽吸等后續(xù)操作，基底水凝膠材料表面一般是全能干細(xì)胞或飼養(yǎng)層細(xì)胞生長(zhǎng)的直接附著表面，可通過(guò)在基底水凝膠表面涂覆各種生物材料實(shí)現(xiàn)基底成分的改性和調(diào)控，如涂覆膠原、明膠、基質(zhì)膠、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白、纖維連接蛋白等各種細(xì)胞外基質(zhì)成分，以提高細(xì)胞粘附、更好地維持干細(xì)胞的自我更新、或促進(jìn)全能干細(xì)胞的定向分化。此處所述涂覆材料不限于以上種類(lèi)材料，具體使用種類(lèi)和用量視培養(yǎng)細(xì)胞的種類(lèi)和培養(yǎng)目的而定。
本發(fā)明可以方便地實(shí)現(xiàn)各種生長(zhǎng)因子和化學(xué)信號(hào)分子在細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置中的復(fù)合和緩釋。通過(guò)因子固定技術(shù)(immobilization)可將生長(zhǎng)因子和化學(xué)信號(hào)分子嵌合于基底水凝膠層中，實(shí)現(xiàn)各種因子仿生、高效、可控的緩釋?zhuān)岣咭蜃拥淖饔眯屎妥饔脮r(shí)間，對(duì)于體外模擬體內(nèi)發(fā)育提供了一種方便實(shí)用的模型，并具有重要的經(jīng)濟(jì)效益。同時(shí)，生長(zhǎng)因子和化學(xué)信號(hào)分子也可以可溶分子的形式參與細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程，可方便地進(jìn)行時(shí)序性可控的因子添加，以適應(yīng)程序性誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的要求。此處所述生長(zhǎng)因子和化學(xué)信號(hào)分子的選用視培養(yǎng)細(xì)胞的種類(lèi)和培養(yǎng)目的而定，是本領(lǐng)域的公知方法。
本發(fā)明可適于全能干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)等多種用途，方便的細(xì)胞共培養(yǎng)途徑是實(shí)現(xiàn)以上功能的重要保證，本發(fā)明在調(diào)控共培養(yǎng)細(xì)胞等生物要素的具體方法包括但不局限于如下兩類(lèi):
I)維持全能干細(xì)胞自我更新的飼養(yǎng)層共培養(yǎng)。在細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置中可先選擇性種植飼養(yǎng)層細(xì)胞，使其貼附于微圖形空腔的基底水凝膠表面或微圖形模板上，其后在細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置上種植全能干細(xì)胞，形成與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)的生理環(huán)境，有利于全能干細(xì)胞的自我更新和全能性的維持。此處所述飼養(yǎng)層細(xì)胞的選擇和種植密度是本領(lǐng)域的公知，具體選擇視全能干細(xì)胞的種類(lèi)而定。
2)促進(jìn)全能干細(xì)胞定向分化的輔助細(xì)胞共培養(yǎng)。在細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置形成全能干細(xì)胞均質(zhì)性集落后可原位進(jìn)行干細(xì)胞定向分化誘導(dǎo)培養(yǎng)，此時(shí)可選擇性進(jìn)行輔助細(xì)胞共培養(yǎng)，共培養(yǎng)方法包括保留微圖形化模板和拆卸微圖形化模板兩種。
在保留模板的情況下可直接將輔助細(xì)胞種植于細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置，此時(shí)輔助細(xì)胞優(yōu)先貼附于微圖形化模板上非空腔表面，形成輔助細(xì)胞與全能干細(xì)胞集落非接觸式共培養(yǎng)環(huán)境；另外，可在形成全能干細(xì)胞均質(zhì)性集落后拆除上層微圖形化模板，保留全能干細(xì)胞集落、基底水凝膠層和/或硬質(zhì)基底，此時(shí)所種植的輔助細(xì)胞優(yōu)先貼附于基底水凝膠層上未被全能干細(xì)胞集落占位的空白表面，形成輔助細(xì)胞與全能干細(xì)胞集落接觸式共培養(yǎng)環(huán)境。以上兩種方式的選擇可根據(jù)基底水凝膠材料種類(lèi)、全能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化方向和輔助細(xì)胞的類(lèi)型等因素而定。輔助細(xì)胞的種類(lèi)和種植密度是本領(lǐng)域的公知，主要由全能干細(xì)胞集落的數(shù)量、細(xì)胞密度和干細(xì)胞誘導(dǎo)分化方向等因素決定。
本發(fā)明所述細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置尤其適用于全能干細(xì)胞的培養(yǎng)，同時(shí)也可用于其它各種細(xì)胞的培養(yǎng)。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明加以闡述，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例1、細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置的制造
一、微圖形化模板的制備
利用激光切割法制備上層微圖形化模板。具體操作如下:采用Rayjet激光雕刻機(jī)切割厚度為0.5cm的聚甲基丙烯酸甲酯平板(尊寶科技)形成上層微圖形化模板。按照?qǐng)D1所示，由軟件AutoCAD設(shè)計(jì)完成微圖形化模板:模板為圓形，直徑尺寸為22.1mm，中央呈正方形均勻分布8X8個(gè)直徑為300μπι、500μπι、1000μπι或1500μπι的空腔作為微圖形化的細(xì)胞(如全能干細(xì)胞)培養(yǎng)空間，相鄰兩個(gè)空腔圓心的距離為1500μπι。激光雕刻機(jī)的主要加工參數(shù)為:切割能量100%，切割次數(shù)2，切割線(xiàn)速度10%。
將加工成型的聚甲基丙烯酸甲酯模板用去離子水漂洗兩次，超聲清洗30min，然后進(jìn)行熱處理以改善平整度:取平整清潔的加熱板，溫度設(shè)置90°C，在受壓狀態(tài)下熱處理聚甲基丙烯酸甲酯模板45min。
將熱處理后的微圖形化模板用無(wú)菌三蒸水浸泡漂洗30min，并用無(wú)菌清潔紙擦拭干凈，于安全柜中雙面照射紫外45min滅菌備用。
二、細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置的制造
用無(wú)水乙醇將光引發(fā)劑(12959,2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2_甲基苯丙酮，106797-53-9，英力，中國(guó))配制成濃度為0.lg/ml的光引發(fā)劑溶液，0.2 μ m濾膜過(guò)濾除菌后分裝成Iml/管并避光4°C低溫保存。
按照如下方法制備明膠-甲基丙烯酸甲酯:lg明膠(G6144, Sigma,美國(guó))粉末加AlOmL DPBS溶液中，50°C水浴加熱，均勻攪拌至完全融化后，以0.5mL/min緩慢加入ImL甲基丙烯酸甲酯(276685，Sigma，美國(guó))，反應(yīng)2h后取下，待溶液冷卻至室溫，加入40mL DPBS溶液稀釋?zhuān)媒亓舴肿恿?000-12000的透析袋在去離子水中60°C透析I周，離心取上清液冷凍干燥I周，形成白色蓬松泡沫狀固體，為明膠-甲基丙烯酸甲酯聚合物，_80°C保存。
將上述制備好的明膠-甲基丙烯酸甲酯溶于DMEM培養(yǎng)液(11965092，Invitrogen,美國(guó))中，60°C助溶3小時(shí)，形成濃度為0.05g/ml明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，用0.2 μ m濾膜過(guò)濾后分裝成Iml/管備用。
使用時(shí)將上述配制好的濃度為0.lg/ml的光引發(fā)劑溶液與濃度為0.05g/ml的明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液以1: 20均勻混合后避光 保存，并且之后的相關(guān)操作均在避光的條件下進(jìn)行。
在安全柜中按照無(wú)菌操作規(guī)范將步驟一中所述微圖形化模板1:1嵌入12孔板培養(yǎng)皿(Corning公司)的培養(yǎng)孔中，在避光條件下沿微圖形模板底面緩慢注入70 μ I無(wú)菌的明膠-甲基丙烯酸甲酯/光引發(fā)劑溶液，此時(shí)在模板底面與培養(yǎng)皿表面之間形成一層均勻的基底生物材料層。利用紫外光交聯(lián)明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，紫外光能量約為5.4mff/cm2,作用時(shí)間40s，形成厚度為1_10 μ m的基底水凝膠層(下層粘性水凝膠)。此時(shí)在交聯(lián)劑的交聯(lián)作用和明膠-甲基丙烯酸甲酯水凝膠粘著力的共同作用下形成由上至下依次為微圖形化模板-基底水凝膠層-培養(yǎng)皿表面的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置(如圖2所示)。然后用Iml/孔DMEM溶液潤(rùn)洗細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置兩次，立即使用或低溫?zé)o菌保存。
實(shí)施例2、利用實(shí)施例1的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置培養(yǎng)人胚胎干細(xì)胞
1、人胚胎干細(xì)胞增殖培養(yǎng)
MEF 培養(yǎng)液:每 250ml MEF 培養(yǎng)液含 DMEM (11965092，Invitrogen) 225ml，胎牛血清(10099141, Invitrogen) 25ml,谷丙氨酸二妝(Glutamax I) (35050061, Invitrogen) 2.5ml,MEM非必需氨基酸(MEM NEAA) (11140050, Invitrogen) 2.5ml,青霉素/鏈霉素(Pen/strep)(100X(15140122, Invitrogen)2.5ml。
人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液:每250ml培養(yǎng)液含knock out DMEM(10829018,Invitrogen) 200ml, Knockout serum replacer (10828028, Invitrogen) 50ml,谷丙氨酸二肽(Glutamax I) (35050061，Invitrogen) 2.5ml，MEM 非必需氨基酸(MEM NEAA) (11140050，Invitrogen) 2.5ml，青霉素 / 鏈霉素(Pen/strep) (15140122, Invitrogen) 2.5ml,人喊性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hbFGF) (25 μ g/ml) (233-FB-025, R&D) 0.08ml。
一、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的獲取
獲取小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)的具體操作步驟如下:
(I)用孕馬血清促性腺激素(H0R-272，上海高創(chuàng))處理小鼠，使其同期發(fā)情和超數(shù)排卵。
(2)將雌雄小鼠按照2: I的比例合籠過(guò)夜。
(3)第二天，取出有陰道栓(即乳白色或淡黃色凍膠狀物，確定其已經(jīng)懷孕)的雌性小鼠。此時(shí)，小鼠懷孕時(shí)間記錄為0.5天。
(4)取出妊娠12.5-14.5天的雌性小鼠為下述進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的材料。
(5)頸椎脫臼法處死步驟⑷的懷孕小鼠，放于盛有75%酒精的燒杯中消毒，拿到超凈工作臺(tái)上解剖，先剖開(kāi)腹部皮膚，暴露子宮，然后換另外一套手術(shù)器械，用眼科鑷提起近子宮頸端，分離子宮系膜，剪斷子宮角，取出子宮，置于裝有PBS的培養(yǎng)皿中。
(6)取出胎鼠，在 PBS中洗滌數(shù)次。去除頭、尾、內(nèi)臟和四肢，僅留軀干部。在PBS中充分漂洗，棄除紅細(xì)胞。
(7)在新的培養(yǎng)皿中加入少量PBS，放入軀干部分，用眼科剪刀剪成Imm3以下的組織塊碎片。
(8)加入2 4ml 0.25%胰蛋白酶，培養(yǎng)箱中消化10_15min，消化結(jié)束后加入等體積MEF培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)，輕輕吹打，使細(xì)胞分散。
(9)將收集的細(xì)胞懸液離心，1500rpm, 4min,棄上清，加入紅細(xì)胞裂解液(3 5倍體積的細(xì)胞體積)，輕輕吹打lmin，離心除上清，若仍有紅細(xì)胞殘留，則須繼續(xù)進(jìn)行前述的紅細(xì)胞裂解步驟。
(10)離心，棄上清，重懸細(xì)胞，過(guò)濾(200目篩網(wǎng))并收集濾液，離心除去上清。
(11)用MEF培養(yǎng)液洗滌沉淀，離心除上清，重懸細(xì)胞并鋪板后置于37°C、5% 0)2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(12)第二天換液，隨后每2天換液一次。培養(yǎng)2 4d后，MEF接近匯合，即可按I: 3比例傳代培養(yǎng)。
(13)收集細(xì)胞進(jìn)行X射線(xiàn)滅活，劑量為70戈瑞(Gy)。
將滅活的MEF (以下簡(jiǎn)稱(chēng)Ιη-MEF)以2.5 X IO4個(gè)/cm2的細(xì)胞密度均勻種植于實(shí)施例I構(gòu)建的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置中，如為低溫?zé)o菌保存的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置，則PBS潤(rùn)洗兩次后37°C孵育IOmin使用。細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置種植In-MEF后，置于培養(yǎng)箱中靜置lOmin，稍?xún)A斜吸出上清，沿培養(yǎng)皿的孔壁加入Iml/孔MEF培養(yǎng)液潤(rùn)洗兩次，以去除模板表面的細(xì)胞，留下微圖形化空腔中的In-MEF細(xì)胞。沿培養(yǎng)皿的孔壁加入1.5ml/孔MEF培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行In-MEF細(xì)胞培養(yǎng)。
24h后，吸去細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置中的MEF培養(yǎng)液。將在六孔板培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)的匯合度約為60-70%的人胚胎干細(xì)胞H9 (Wicell)均勻傳代至細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置中，將六孔板一個(gè)培養(yǎng)孔中的人胚胎干細(xì)胞H9，傳到上述含有In-MEF細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置12孔板的一個(gè)培養(yǎng)孔中，即人胚胎干細(xì)胞H9約為3:1種植。將細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置置于培養(yǎng)箱中靜置lOmin，稍?xún)A斜吸出上清，以去除模板表面的人胚胎干細(xì)胞H9，留下微圖形化空腔中的人胚胎干細(xì)胞H9。沿培養(yǎng)皿的孔壁加入1.5ml/孔人胚胎干細(xì)胞H9培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中進(jìn)行MEF和人胚胎干細(xì)胞H9共培養(yǎng)，每天換液、觀(guān)察，采用堿性磷酸酶活性測(cè)定、特異性表面抗原表達(dá)檢測(cè)(如SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60)、核轉(zhuǎn)錄因子檢測(cè)(如0CT4)等方法鑒定人胚胎干細(xì)胞H9的生物學(xué)特性。
In-MEF和人胚胎干細(xì)胞H9在實(shí)施例1的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置中共培養(yǎng)約3 4天后，人胚胎干細(xì)胞H9形成與微圖形化模板的空腔形狀一致的，8X8個(gè)直徑為300 μ m、500 μ m、1000 μ m 或 1500 μ m 均一集落。
上述MEF細(xì)胞培養(yǎng)和傳代、人胚胎干細(xì)胞H9的常規(guī)培養(yǎng)、傳代和檢測(cè)方法是本領(lǐng)域的公知，優(yōu)先采用目前經(jīng)典操作規(guī)范進(jìn)行。
2、原位人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化
I)原位人胚胎干細(xì)胞程序性定向誘導(dǎo)分化
約3 4天后，可觀(guān)察到上述步驟I培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞H9，在微圖形化空腔中形成8X8個(gè)直徑為30(^111、50(^111、100(^111或150(^111的均質(zhì)性人胚胎干細(xì)胞!19集落(經(jīng)所述生物學(xué)特性鑒定較好)，之后在細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置中進(jìn)行原位人胚胎干細(xì)胞H9誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，此處所述以肝樣細(xì)胞程序性誘導(dǎo)分化為例。
程序性誘導(dǎo)分化以體內(nèi)肝臟發(fā)育為指導(dǎo)，依次分為限定性?xún)?nèi)胚層誘導(dǎo)、肝祖細(xì)胞特化誘導(dǎo)和肝細(xì)胞成熟誘導(dǎo)等階段。各個(gè)階段的誘導(dǎo)培養(yǎng)液是基于成分培養(yǎng)液配制的，成分培養(yǎng)液配方為:50% IMDM 培養(yǎng)基(Iscove，s modified DulbeccoJ s medium)與 50%F12NUT-MIX,添加7 μ g/ml胰島素、15 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、450 μ mol/L硫代甘油和5mg/ml牛血清白蛋白。以誘導(dǎo)起始時(shí)間記為第I天，誘導(dǎo)分化方法為:第 I 2天，采用添加IOng/mL活化素(activin)和12ng/ml人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 (FGF2)的成分培養(yǎng)液培養(yǎng)干細(xì)胞，每天換液；第3 5天，采用添加100ng/mL activin, 20ng/mL FGF2,10ng/mL骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP4)和10 μ mol/L LY294003 (PI3K抑制劑)的成分培養(yǎng)液誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞H9向內(nèi)胚層細(xì)胞分化,每天換液；第6 8天,采用添加50ng/mL人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子IO(FGFlO)的成分培養(yǎng)液誘導(dǎo)向前部限定性?xún)?nèi)胚層的定向分化，每天換液；第9 10天，采用添加 50ng/mL FGF10,10_7mol/L 視黃酸和 10 μ mol/L SB431542 (TGF-Smads 信號(hào)通路抑制劑)的成分培養(yǎng)液誘導(dǎo)向肝祖細(xì)胞的定向分化，每天換液；第11 20天，采用添加30ng/mL人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子4(FGF4)，50ng/mL肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和50ng/mL上皮生長(zhǎng)因子(EGF)的成分培養(yǎng)液誘導(dǎo)向肝樣細(xì)胞的定向分化，每2 3天換液。以上培養(yǎng)過(guò)程都將細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置置于37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，每次每孔加液1.5ml。
經(jīng)上述誘導(dǎo)后人胚胎干細(xì)胞H9分化的細(xì)胞能夠表達(dá)肝臟特定基因AFP，分泌白蛋白，由此判定人胚胎干細(xì)胞H9定向分化為了肝樣細(xì)胞。
2)原位人胚胎干細(xì)胞共培養(yǎng)定向誘導(dǎo)分化
觀(guān)察到上述步驟I培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞H9，在微圖形化空腔中形成8X8個(gè)直徑為1000 μ m的均質(zhì)性人胚胎干細(xì)胞H9集落后，在細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置中進(jìn)行原位共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，此處所述以肝樣細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化為例。
將人來(lái)源的肝星狀細(xì)胞系(HumanHepatic Stellate Cells, cat#5300,Sciencell)培養(yǎng)于37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為添加10% FBS和200U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。
開(kāi)始肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)前用鑷子揭下上層微圖形化模板，用人胚胎干細(xì)胞H9全培養(yǎng)液潤(rùn)洗培養(yǎng)皿兩次，此時(shí)培養(yǎng)皿中留下基底水凝膠層和微圖形化的人胚胎干細(xì)胞H9集落。將肝星狀細(xì)胞重懸于人胚胎干細(xì)胞H9全培養(yǎng)液中，以2.5X IO4個(gè)/cm2的細(xì)胞密度均勻種植于培養(yǎng)皿中，一天后換液，此時(shí)星狀細(xì)胞優(yōu)先貼附于基底水凝膠層，圍繞人胚胎干細(xì)胞H9集落形成兩種細(xì)胞共培養(yǎng)環(huán)境。
其后6天，采用誘導(dǎo)培養(yǎng)液誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞H9向肝樣細(xì)胞定向分化，誘導(dǎo)培養(yǎng)液的成分為:50% IMDM培養(yǎng)基與50% F12NUT-MIX，添加7 μ g/ml胰島素、15 μ g/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白、450 μ mol/L 硫代甘油、5mg/ml 牛血清白蛋白、50ng/mL FGF4, 50ng/mL HGF 和 50ng/mLEGF,每2 3天換液。以上培養(yǎng)過(guò)程都將細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置置于37°C、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中進(jìn)行，每次每孔加液1.5ml。
經(jīng)上述誘導(dǎo)后人胚胎干細(xì)胞H9分化的細(xì)胞能夠表達(dá)肝臟特定基因AFP，分泌白蛋白，由此判定人胚胎干細(xì)胞H9定向分 化為了肝樣細(xì)胞。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置，包括具有若干微圖形空腔的微圖形化模板和位于所述微圖形化模板下的粘性水凝膠；所述粘性水凝膠與所述微圖形化模板交聯(lián)粘著為整體；所述微圖形化模板的每個(gè)所述微圖形空腔的形狀和體積決定細(xì)胞集落生長(zhǎng)的物理空間。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置，其特征在于:所述細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置還包括位于所述粘性水凝膠下的基底。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置，其特征在于:所述細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置還包括位于所述粘性水凝膠下并嵌入所述微圖形化模板的多孔培養(yǎng)皿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置，其特征在于:所述粘性水凝膠用可交聯(lián)形成水凝膠的天然生物材料和/或人工合成生物材料制成，所述天然生物材料選自下述材料中的至少一種:明膠、明膠衍生物、藻酸鹽、藻酸鹽衍生物、瓊脂、基質(zhì)膠、膠原、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白和纖維連接蛋白；所述人工合成生物材料選自下述材料中的至少一種:聚丙烯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚乳酸、聚羥基酸、聚乳酸醇酸共聚物、聚二甲基硅氧烷、聚酸酐、聚酸酯、聚酰胺、聚氨基酸、聚縮醛、聚氰基丙烯酸酯、聚氨基甲酸酯、聚吡咯、聚酯、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯、聚碳酸酯和聚氧化乙烯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置，其特征在于:用作所述微圖形化模板的材料為聚甲基丙烯酸甲酯；用作所述粘性水凝膠的材料由明膠-甲基丙烯酸甲酯和光引發(fā)劑2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮組成；所述明膠-甲基丙烯酸甲酯為明膠與甲基丙烯酸甲酯的使用配比為Ig所述明膠比Iml所述甲基丙烯酸甲酯的聚合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的細(xì) 胞集落體外培養(yǎng)裝置，其特征在于:所述粘性水凝膠按照包括如下步驟的方法制備: 1)將所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶于DMEM培養(yǎng)液，得到明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液，所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中所述明膠-甲基丙烯酸甲酯的含量為每IOOml所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液中含有5g所述明膠-甲基丙烯酸甲酯； 2)將所述光引發(fā)劑2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮溶于無(wú)水乙醇，得到光引發(fā)劑溶液，所述光引發(fā)劑溶液中所述2-羥基-4- (2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮的含量為每IOOml所述光引發(fā)劑溶液中含有IOg所述2-羥基-4-(2-羥乙氧基)-2-甲基苯丙酮； 3)將所述光引發(fā)劑溶液與所述明膠-甲基丙烯酸甲酯溶液按照體積比1: 20的比例混合。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置，其特征在于:所述粘性水凝膠的上表面涂覆有細(xì)胞外基質(zhì)成分；所述細(xì)胞外基質(zhì)成分包括膠原、明膠、基質(zhì)膠、蛋白多糖、糖蛋白、透明質(zhì)酸、層連接蛋白或纖維連接蛋白；和/或， 所述粘性水凝膠中嵌合有生長(zhǎng)因子和化學(xué)信號(hào)分子。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一所述的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置，其特征在于:所述粘性水凝膠的厚度為1-10 μ m。
9.權(quán)利要求1-8中任一所述的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置在調(diào)控全能干細(xì)胞自我更新中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求1-8中任一所述的細(xì)胞集落體外培養(yǎng)裝置在調(diào)控全能干細(xì)胞定向分化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞集落生長(zhǎng)裝置。本發(fā)明所提供的裝置包括具有若干微圖形空腔的微圖形化模板和位于所述微圖形化模板下的粘性水凝膠，兩者交聯(lián)粘著為整體；每個(gè)所述微圖形空腔的形狀和尺寸決定細(xì)胞集落生長(zhǎng)的物理空間。用作所述粘性水凝膠的材料由可交聯(lián)形成水凝膠的天然生物材料和/或人工合成生物材料，以及交聯(lián)劑組成。本發(fā)明所提供的平臺(tái)制備工藝簡(jiǎn)單，配合培養(yǎng)皿使用簡(jiǎn)便易行；利用微圖形化技術(shù)構(gòu)建多種細(xì)胞共培養(yǎng)環(huán)境，為高通量模型構(gòu)建和篩選提供了方便實(shí)用的手段；同時(shí)還可實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞集落形狀和尺寸、粘附基底機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)成分、生長(zhǎng)因子和化學(xué)信號(hào)、共培養(yǎng)細(xì)胞等多種因素的獨(dú)立調(diào)控；以及原位進(jìn)行細(xì)胞增殖培養(yǎng)和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)。
文檔編號(hào)C12M3/00GK103146572SQ20111040398
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
發(fā)明者杜亞楠, 姚睿, 王婧宇 申請(qǐng)人:清華大學(xué)