專利名稱：一種應(yīng)用復(fù)合酶制備殼寡糖的方法
一種應(yīng)用復(fù)合酶制備殼寡糖的方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于低聚糖制備方法領(lǐng)域，具體地說涉及一種應(yīng)用復(fù)合酶制備殼寡糖的方法。
背景技術(shù)：
殼寡糖是非常有價值的天然多糖，其在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景，但是對于殼寡糖的制備，尤其應(yīng)用生物法制備殼寡糖，存在過程復(fù)雜，降解效率低，產(chǎn)品構(gòu)成多樣化等特點。
例如目前應(yīng)用復(fù)合酶來制備殼寡糖的方案主要是利用淀粉酶、蛋白酶和殼聚糖酶等按照一定的比例組成的復(fù)合酶，如專利申請CN101200711A中所公開的復(fù)合酶制劑，其是通過枯草芽孢桿菌發(fā)酵獲得的酶，酶的種類和含量受到微生物體中所已經(jīng)存在酶的數(shù)量限制，所以降解的效率不高。
還有就是應(yīng)用一種非專一性酶來制備殼寡糖，例如專利CN101475969A中所公開的應(yīng)用木瓜蛋白酶來制備殼寡糖，但是木瓜蛋白酶在降解高聚合度的殼聚糖的時候效率高，對于低聚合度的殼聚糖的降解效率比較低，所以其降解的選擇性單一。
還有專利CN101818181A中公開的，應(yīng)用果膠酶、木聚糖酶、纖維素酶、淀粉酶的復(fù)合酶制備殼寡糖，但是其制備殼寡糖的時間長，得到的殼寡糖顏色較深。
目前還有用物理法、化學(xué)法等來降解殼聚糖制備殼寡糖，要么由于降解的不徹底， 使得產(chǎn)品中存在過多的高聚合度殼寡糖，例如聚合度大于50的低聚殼聚糖占多數(shù)，或者是降解得過度，使得產(chǎn)品中存在過多的氨基葡糖糖單體，或者是聚合度為2-10的殼寡糖過多，為了獲得聚合度高低結(jié)合的殼寡糖，目前的制備工藝都存在一定的缺陷。發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種降解殼聚糖制備殼寡糖的復(fù)合酶及其應(yīng)用該復(fù)合酶制備殼寡糖的方法，該復(fù)合酶能夠使得降解產(chǎn)物中殼寡糖聚合度控制在一定范圍內(nèi)，也就是聚合度控制在2-30 (分子量為300-5000D)范圍內(nèi)，不同聚合度的殼寡糖在產(chǎn)品中均勻存在，該殼寡糖使得農(nóng)業(yè)應(yīng)用中更有效率。
具體地，本發(fā)明提供了一種制備殼寡糖的復(fù)合酶，該復(fù)合物含有如下質(zhì)量份數(shù)的酶
纖維素酶15-25份，
溶菌酶5-15份
淀粉酶20-40份
脂肪酶80-100份
葡萄糖酶20-30份
木瓜蛋白酶10-20份。
優(yōu)選的，上述復(fù)合酶含有如下質(zhì)量份數(shù)的酶
纖維素酶20份，
溶菌酶10份
淀粉酶30份
脂肪酶90份
葡萄糖酶25份
木瓜蛋白酶15份。
本發(fā)明的上述復(fù)合酶中，可以包含其他的促進(jìn)酶活的物質(zhì)，例如維生素類物質(zhì)，如維生素C，或者是金屬鹽，如CoS04、MnSO4, FeSO4, MgSO4, ZnSO4, K2SO4等，添加這些物質(zhì)可以促進(jìn)酶的分解速度。
優(yōu)選的，本發(fā)明的上述復(fù)合酶中還含有維生素C，維生素C與復(fù)合酶的質(zhì)量比為 0.5-4 1。或者優(yōu)選的，為1.5-3 1，優(yōu)選的，本發(fā)明的上述復(fù)合酶中還含有CoS04、MnS04、 FeSO4, MgSO4, ZnSO4, K2SO4中的一種或多種，無論包含幾種金屬鹽，各種金屬鹽的摩爾量相同，優(yōu)選的，同時包含其中6種鹽，6種鹽的摩爾量相同，6種鹽的總質(zhì)量與酶的總質(zhì)量的比為 1-10 100，優(yōu)選的 1-5 100。
本發(fā)明還提供了應(yīng)用上述復(fù)合酶制備殼寡糖的方法，該方法包括在殼聚糖的反應(yīng)緩沖液中加入復(fù)合酶，使得復(fù)合酶與殼聚糖的質(zhì)量比為1-20 100，優(yōu)選的，復(fù)合酶與殼聚糖的質(zhì)量比為5-15 100。
具體的，本發(fā)明提供了一種應(yīng)用上述復(fù)合酶制備殼寡糖的方法，該方法包括如下步驟
1)將殼聚糖用醋酸溶液溶解，然后用醋酸鈉溶液調(diào)pH為5-6，配制成殼聚糖濃度在50-70g/L，得殼聚糖溶液；
2)向步驟1)制得的殼聚糖溶液中加入復(fù)合酶，復(fù)合酶的組分及其質(zhì)量份數(shù)如下
纖維素酶15-25份，
溶菌酶5-15份
淀粉酶20-40份
脂肪酶80-100份
葡萄糖酶20-30份
木瓜蛋白酶10-20份。
復(fù)合酶與殼聚糖的質(zhì)量比為1-20 100，在溫度50_60°C搖床振蕩速度為50-100 轉(zhuǎn)/分鐘的條件下降解2-3小時，制備得到殼寡糖粗品溶液；
3)將殼寡糖粗品溶液通過5000D的分子篩，濾出液再通過300D的分子篩，將截留物冷凍干燥，制備得到殼寡糖。
上述方法中，由于本發(fā)明的復(fù)合酶能夠適用于高脫乙酰度的殼聚糖的降解，也可適用于低脫乙酰度殼聚糖的降解，所以殼聚糖的脫乙酰度一般沒有特殊的限制。一般的，本發(fā)明的上述制備方法所用的原料殼聚糖的脫乙酰度為60-99%。
上述方法中，所用的醋酸溶液的濃度不受限制，一般的濃度為0. 6mol/L，醋酸鈉溶液的濃度也不受限制，一般的濃度為0. 6mol/L。
優(yōu)選的，上述方法中，復(fù)合酶由如下質(zhì)量份數(shù)的酶組成
纖維素酶20份，
溶菌酶10份
淀粉酶30份
脂肪酶90份
葡萄糖酶25份
木瓜蛋白酶15份。
優(yōu)選的，上述方法中，復(fù)合酶與殼聚糖的質(zhì)量比為5-15 100。
優(yōu)選的，上述方法中，在加入復(fù)合酶的同時可加入一定比例的維生素C，維生素C 與復(fù)合酶的質(zhì)量比為0.5-4 1?；蛘邇?yōu)選的，為1.5-3 1，上述方法中，在加入復(fù)合酶的同時可加入CoS04、MnS04、FeS04、MgS04、ZnS04、K2S04中的一種或多種，無論加入幾種金屬鹽， 各種金屬鹽的摩爾量相同，優(yōu)選的，同時包含其中6種鹽，6種鹽的摩爾量相同，6種鹽的總質(zhì)量與酶的總質(zhì)量的比為1-10 100，優(yōu)選的1-5 100。
本發(fā)明的復(fù)合酶中含有多種非專一性的降解酶，其中溶菌酶能夠降解由于脫乙酰不完全的殼聚糖，也就是切割乙酰氨基葡糖糖聚合物，而纖維素酶由于是內(nèi)切酶，能夠?qū)ぞ厶墙到獾降头肿恿俊Ｄ竟系鞍酌改軌驅(qū)⒏呔酆隙鹊臍ぞ厶墙到?，降解效率高。將上述幾種酶混合在一起，使得降解的效率提高，針對不同聚合物度的殼聚糖、脫乙酰和未脫乙酰的殼聚糖等都能夠具有有效的降解，避免了單種非專一性殼聚糖降解的缺陷，而且通過不同非專一性酶的集合，使得降解得到的產(chǎn)物中不同聚合度的氨基葡萄糖聚合物均勻存在，并且分子量分布范圍為1000-5000的殼寡糖比例高，制備目標(biāo)殼寡糖的產(chǎn)率高。
應(yīng)用酶法降解殼聚糖獲得的殼寡糖的活性不受影響，一般保持天然的殼寡糖結(jié)構(gòu)，所以在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)應(yīng)用中具有良好的效果。而且本發(fā)明的復(fù)合酶及其應(yīng)用復(fù)合酶制備得到的殼寡糖分子量分布均勻，產(chǎn)率高。
具體實施方式
為了理解本發(fā)明，下面以實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不限制本發(fā)明。
實施例中所用的原料均是能夠從市場購買得到的原料，殼聚糖的脫乙酰度為 85%，其他的原料均為分析純的原料。
實施例1 復(fù)合酶I的制備
將纖維素酶20g，溶菌酶10g，淀粉酶30g，脂肪酶90g，葡萄糖酶25g，木瓜蛋白酶 15g混合，制備得到復(fù)合酶I。
實施例2 復(fù)合酶II的制備
將纖維素酶25g，溶菌酶5g，淀粉酶20g，脂肪酶90g，葡萄糖酶30g，木瓜蛋白酶 IOg混合，加入317g的維生素C，制備得到復(fù)合酶II。
實施例3 復(fù)合酶111的制備
將纖維素酶15g，溶菌酶15g，淀粉酶40g，脂肪酶80g，葡萄糖酶20g，木瓜蛋白酶 20g 混合，加入 0. 155g 的 CoS04、0. 151g 的 MnS04、0. 152g 的 FeS04、0. 12g 的 MgS04、0. 161g 的 ZnSO4,0. 174g的K2SO4，制備得到復(fù)合酶III。
實施例4殼寡糖的制備
1)將IOOg殼聚糖用0. 6mol/L的醋酸溶液溶解，然后用0. 6mol/L醋酸鈉溶液調(diào)至 PH= 5.8,配制成2L的殼聚糖溶液；
2)向殼聚糖溶液中加入15g的實施例1制備得到的復(fù)合酶I。在溫度55°C搖床振蕩速度為70轉(zhuǎn)/分鐘的條件下降解3小時，制備得到殼寡糖粗品溶液；
3)將殼寡糖粗品溶液通過5000D的分子篩，濾出液再通過300D的分子篩，將截留物冷凍干燥，制備得到87. 4g殼寡糖。
實施例5殼寡糖的制備
1)將IOOg殼聚糖用0. 6mol/L的醋酸溶液溶解，然后用0. 6mol/L醋酸鈉溶液調(diào)至 PH= 5.9,配制成2L的殼聚糖溶液；
2)向殼聚糖溶液中加入12g的實施例2制備得到的復(fù)合酶II。在溫度57°C搖床振蕩速度為80轉(zhuǎn)/分鐘的條件下降解2. 5小時，制備得到殼寡糖粗品溶液；
3)將殼寡糖粗品溶液通過5000D的分子篩，濾出液再通過300D的分子篩，將截留物冷凍干燥，制備得到89. 6g殼寡糖。
實施例6殼寡糖的制備
1)將IOOg殼聚糖用0. 6mol/L的醋酸溶液溶解，然后用0. 6mol/L醋酸鈉溶液調(diào)至 PH = 5. 7，配制成2L的殼聚糖溶液；
2)向殼聚糖溶液中加入IOg的實施例3制備得到的復(fù)合酶III。在溫度58°C搖床振蕩速度為90轉(zhuǎn)/分鐘的條件下降解2小時，制備得到殼寡糖粗品溶液；
3)將殼寡糖粗品溶液通過5000D的分子篩，濾出液再通過300D的分子篩，將截留物冷凍干燥，制備得到90. Ig殼寡糖。
實施例4、5和6制備得到的殼寡糖的分子量分布為300-5000D，而且產(chǎn)率大于 85%，該殼寡糖經(jīng)過分子量分級分離，測得在不同分子量段的殼寡糖分布較為均勻，沒有出現(xiàn)分子量高的殼寡糖占多數(shù)或分子量低的殼寡糖占多數(shù)，也就是說，經(jīng)過本發(fā)明的復(fù)合酶制備得到的殼寡糖分子量分布均勻。而且應(yīng)用本發(fā)明的方法制備殼寡糖的時間短，一般為 2-3小時即可實現(xiàn)殼寡糖的降解。
通過上述實施例還可以看出，加入了復(fù)合酶活性促進(jìn)的物質(zhì)，維生素C和金屬鹽等，不僅降低了復(fù)合酶的用量，而且降解反應(yīng)時間縮短，反應(yīng)的產(chǎn)物的產(chǎn)率反而提高。
權(quán)利要求
1.一種制備殼寡糖的復(fù)合酶，該復(fù)合物包含如下質(zhì)量份數(shù)的酶 纖維素酶15-25份，溶菌酶5-15份淀粉酶20-40份脂肪酶80-100份葡萄糖酶20-30份木瓜蛋白酶10-20份。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合酶，所述復(fù)合酶包含如下質(zhì)量份數(shù)的酶 纖維素酶20份，溶菌酶10份淀粉酶30份脂肪酶90份葡萄糖酶％份木瓜蛋白酶15份。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合酶，該復(fù)合酶中還含有維生素C，維生素C與復(fù)合酶的質(zhì)量比為0.5-4 1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合酶，該復(fù)合酶中還含有金屬鹽CoS04、MnS04、FeS04, MgS04、ZnS04和K2S04，各種金屬鹽的摩爾量相同，金屬鹽的總質(zhì)量與酶的總質(zhì)量的比為 1-10 100。
5.一種應(yīng)用復(fù)合酶制備殼寡糖的方法，該方法包括如下步驟1)將殼聚糖用醋酸溶液溶解，然后用醋酸鈉溶液調(diào)PH為5-6，配制成殼聚糖濃度在 50-70g/L，得殼聚糖溶液；2)向步驟1)制得的殼聚糖溶液中加入復(fù)合酶，復(fù)合酶的組分及其質(zhì)量份數(shù)如下 纖維素酶15-25份，溶菌酶5-15份淀粉酶20-40份脂肪酶80-100份葡萄糖酶20-30份木瓜蛋白酶10-20份，復(fù)合酶與殼聚糖的質(zhì)量比為1-20 100，在溫度50-60°C搖床振蕩速度為50-100轉(zhuǎn)/ 分鐘的條件下降解2-3小時，制備得到殼寡糖粗品溶液；3)將殼寡糖粗品溶液通過5000D的分子篩，濾出液再通過300D的分子篩，將截留物冷凍干燥，制備得到殼寡糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中醋酸溶液的濃度為0.6mol/L，醋酸鈉溶液的濃度為 0.6mol/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中復(fù)合酶包含如下質(zhì)量份數(shù)的酶 纖維素酶20份，溶菌酶10份淀粉酶30份脂肪酶90份葡萄糖酶％份木瓜蛋白酶15份。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中復(fù)合酶與殼聚糖的質(zhì)量比為5-15 100。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種應(yīng)用復(fù)合酶制備殼寡糖的方法，其中復(fù)合酶包含纖維素酶，溶菌酶，淀粉酶，脂肪酶，葡萄糖酶，木瓜蛋白酶。本發(fā)明還提供了應(yīng)用復(fù)合酶制備殼寡糖的方法，該方法包括在殼聚糖的反應(yīng)緩沖液中加入復(fù)合酶，使得復(fù)合酶與殼聚糖的質(zhì)量比為1-20∶100，優(yōu)選的，復(fù)合酶與殼聚糖的質(zhì)量比為5-15∶100。本發(fā)明的復(fù)合酶及其應(yīng)用復(fù)合酶制備得到的殼寡糖分子量分布均勻，產(chǎn)率高。
文檔編號C12P19/14GK102492664SQ20111040528
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月8日
發(fā)明者張善學(xué) 申請人:海南正業(yè)中農(nóng)高科股份有限公司