專利名稱：用于檢測(cè)裂谷熱病毒s片段的引物和探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種用于檢測(cè)裂谷熱病毒S片段的引物和探針。
背景技術(shù)：
裂谷熱(Rift valley fever, RVF)是一種嚴(yán)重的人獸共患病，也是自古以來(lái)流行于東非大峽谷地帶的地方病，主要是在綿羊、山羊和牛中間傳播，?？梢鹪行蟮牧鳟a(chǎn)風(fēng)暴 (abortion storm)，幼齡羊死亡率高達(dá)90%以上。該病的流行周期約為5_10年。該病可感染人，患者表現(xiàn)發(fā)熱、頭痛和關(guān)節(jié)痛等流感樣癥狀，少數(shù)有出血熱和腦炎表現(xiàn)，偶可引發(fā)視網(wǎng)膜炎以至失明，病死率約1%，表現(xiàn)出血熱癥狀時(shí)死亡率可高達(dá)50%左右。RVF主要經(jīng)蚊蟲傳播，具有明顯的季節(jié)性，也可通過(guò)接觸感染。裂谷熱病毒(RVFV)是白蛉熱病毒屬(Phlebovirus)，布尼病毒科(Bunyaviridae) 成員，為一種單一血清型的病毒，具有布尼病毒的典型形態(tài)學(xué)和理化特性。病毒有囊膜，直徑90 llOnm，呈球形，表面有清楚的糖蛋白突起，突起直徑長(zhǎng)lOnm。病毒核酸位于病毒的核衣殼內(nèi)，為單股負(fù)鏈RNA，RNA可分為L(zhǎng)(大)、M(中)、S(小)三個(gè)節(jié)段。其中的S節(jié)段為雙意義的RNA，即具有雙定向編碼功能，編碼N蛋白和另外一種非結(jié)構(gòu)蛋白(Nk) ；M節(jié)段編碼Gl與G2兩種外膜糖蛋白和兩種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSm，大小分別為14kD和78kD)，Gl和G2 糖蛋白都能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體，但在體內(nèi)只有G2能刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體；L節(jié)段編碼L 蛋白，L蛋白具有病毒轉(zhuǎn)錄酶的功能。病毒粒子不含基質(zhì)蛋白。目前還未發(fā)現(xiàn)RVFV的分離株和試驗(yàn)室傳代株的特異性抗原差異，但已證明各毒株的致病性存在著一定差異。目前，裂谷熱病毒的診斷方法主要有病毒分離、瓊脂糖免疫擴(kuò)散技術(shù)、免疫熒光染色技術(shù)、血清學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)等診斷技術(shù)。其中病毒分離方法是RVF診斷最為高效敏感的方法，一直作為RVF診斷的經(jīng)典方法。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，實(shí)時(shí)熒光PCR 技術(shù)以其快速、敏感、特異性好的優(yōu)點(diǎn)占有很大優(yōu)勢(shì)，引起了眾多研究者的關(guān)注。熒光PCR(FQ-PCR)技術(shù)是美國(guó)PE (Perkin Elmer)公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)，該法自產(chǎn)生以來(lái)，不斷發(fā)展完善，特別是隨著TaqMan探針的廣泛使用，到目前為止該技術(shù)已經(jīng)非常成熟，具有靈敏度高(比普通PCR高100倍以上)、特異性強(qiáng)(在普通PCR —對(duì)引物的基礎(chǔ)上，中間還設(shè)計(jì)有探針，只有引物和探針均完全配對(duì)，才可能得到擴(kuò)增，可對(duì)少至2個(gè)核苷酸的序列差異進(jìn)行鑒定，從而保證了反應(yīng)的特異性)、操作安全方便(無(wú)須凝膠電泳，避免了 EB染色對(duì)人體的危害)等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、病毒等病原體檢測(cè)、腫瘤基因檢測(cè)、免疫分析、基因表達(dá)、突變及其多態(tài)性的研究等多個(gè)領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供用于檢測(cè)裂谷熱病毒S片段的引物和探針。本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測(cè)裂谷熱病毒的熒光RT-PCR法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種用于檢測(cè)裂谷熱病毒S片段的引物和探針，上游引物 RVFVUl :5，-GGATTACTTTCCTGTGATATCTGTTG-3，，下游弓丨物 RVFVLl 5，-GTATCCTGGGAGGRCCATCWC-3 ‘ (R 為 A 或G，W為 T 或 A)，探針 RVFVPl :5，-F1-ACTCCACT GACACAACACGACGACCACT-Q1-3‘；其中，F(xiàn)l為報(bào)告熒光基團(tuán)，Ql為淬滅熒光基團(tuán)。優(yōu)選Fl 為FAM，Ql為ECLIPSE。其中Fl還可以是FAM、HEX、TET等熒光基團(tuán)，對(duì)應(yīng)的Ql還可以是 TAMARA, BHQ、MGB等淬滅基團(tuán)。本發(fā)明還提供檢測(cè)裂谷熱病毒的熒光PCR法，其以樣品RNA為模板，用上述引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線判定樣品中是否攜帶裂谷熱病毒。25yL的反應(yīng)體系含有成分如下10XPCR緩沖液(Mg2+)2.5yL;2.5mM MgCL2 5. 0 μ L ；2. 5mM dNTP 2· 5 μ L ；反轉(zhuǎn)錄酶 AMV 2. 5U ；Rnase 抑制劑 20U ； 10 μ M RVFVUl
0.5 μ L ； 10 μ M RVFVLl 0. 5 μ L, 10 μ MRVFVP1 0. 5 μ L, rTaq 聚合酶 2. 5U ；RNA 模板
1.6 X Kr6 1. 6 X KT1Iig,余量為雙蒸水；反應(yīng)程序?yàn)?0°C反轉(zhuǎn)錄30min ；95°C預(yù)變性5min ；95°C變性10s，47°C退火20s， 45個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)采集FAM通道熒光信號(hào)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)儀器自動(dòng)給出的CT值判定陰陽(yáng)性，當(dāng)CT值<38時(shí)判定為陽(yáng)性， 當(dāng)CT值> 40時(shí)判定為陰性，當(dāng)38 < CT < 40時(shí)判定為可疑，可疑樣品需復(fù)檢，復(fù)檢仍為可疑者判為陽(yáng)性。本發(fā)明進(jìn)一步提供用于檢測(cè)裂谷熱病毒S片段的試劑盒，其包括前述的引物和探針。本發(fā)明引物和探針的特異性強(qiáng)、靈敏度高，以其建立的裂谷熱病毒S片段實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法，具有反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)裂谷熱病毒的檢測(cè)。


圖1顯示的是裂谷熱病毒S片段實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)梯度標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線圖。圖2顯示的是裂谷熱病毒S片段實(shí)時(shí)熒光PCR特異性擴(kuò)增曲線圖。圖3顯示的是裂谷熱病毒S片段實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測(cè)裂谷熱病毒樣顆粒的擴(kuò)增曲線圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。實(shí)施例1引物和探針的制備1. 1引物和探針的設(shè)計(jì)與合成在美國(guó)國(guó)立生物信息中心NCBI基因庫(kù)(GenBank)中檢索獲得裂谷熱病毒S片段的保守序列，登錄號(hào)為(DQ380149)。應(yīng)用MegAlign軟件分析其基因序列，根據(jù)引物和探針的設(shè)計(jì)原則，用BeaconDesigner 5. 0在序列的保守區(qū)域篩選到一對(duì)引物，并在該引物對(duì)的擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)設(shè)定一條熒光TaqMan探針。引物序列為RVFVUl 5' -GGATTACTTTCCTGTGATATCTGTTG-3’
RVFVLl :5，-GTATCCTGGGAGGRCCATCWC-3，(R 為 A 或 G，W 為 T 或 A)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為 92bp ；所述探針(RVFVPl)的序列為5，-ACTCCACTGACACAACACGACGACCACT-3‘，該探針的5’端用報(bào)告熒光染料FAM標(biāo)記，3’端用淬滅熒光染料ECLIPSE標(biāo)記。該探針的設(shè)計(jì)針對(duì)于所擴(kuò)增序列間的高GC含量區(qū)。1.2引物和探針的制備引物和探針合成后，引物稀釋為ΙΟμπιοΙ/l，探針稀釋為ΙΟμπιοΙ/l，上、下游引物按照1 1的比例等體積混合，探針避光，分裝后-20°C保存?zhèn)溆?。?shí)施例2熒光PCR檢測(cè)方法的建立1. 1裂谷熱S片段重組質(zhì)粒的制備在美國(guó)國(guó)立生物信息中心NCBI基因庫(kù)(GenBank)中檢索獲得裂谷熱病毒S片段的保守序列，化學(xué)合成后分別在兩端引入一個(gè)酶切位點(diǎn)(KpnI和HindIII)，然后連入克隆載體pGEM-T中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)BL21，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，挑取白斑搖菌，陽(yáng)性菌液經(jīng)測(cè)序后提取質(zhì)粒及重組質(zhì)粒(pGEM-T-rvfv-s)，測(cè)濃度為1.0X108拷貝/yL，制備成含裂谷熱病毒S片段保守序列的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。以Dilution緩沖液(TaKaRa)將該質(zhì)粒依次10倍倍比稀釋至 1. 0X107、1. 0X106、1. 0X105、1. 0X104、1. 0X103、1. 0X102、1. OXlO1 拷貝 / μ L，制備成一系列梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。1.2熒光PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的建立以1. OX IO5拷貝/ μ L的重組質(zhì)粒為模板，加入擴(kuò)增反應(yīng)所需的試劑組成表1所示的反應(yīng)體系，反應(yīng)同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照(以無(wú)菌水代替DNA模板進(jìn)行)，反應(yīng)體系見(jiàn)表1。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)裂谷熱病毒S片段的引物和探針，其特征在于，上游引物 RVFVUl :5’ -GGATTACTTTCCTGTGATATCTGTTG-3，，下游引物 RVFVLl :5，-GTATCCTGGGAGGRCCATCWC-3，，其中 R 為 A 或 G，W 為 T 或 A。
2.用于檢測(cè)裂谷熱病毒S片段的探針，其特征在于，探針為5’-Fl-ACTCCACTGACACAAC ACGACGACCACT-Q1-3'，其中Fl為報(bào)告熒光基團(tuán)，Ql為淬滅熒光基團(tuán)。
3.檢測(cè)裂谷熱病毒的熒光RT-PCR法，其特征在于，以裂谷熱病毒的RNA為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求2所述的探針進(jìn)行熒光RT-PCR反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，25μL的反應(yīng)體系含有成分如下10XPCR 緩沖液(Mg2+)2. 5μ L ;2. 5mM MgCL2 5. 0 μ L ；2. 5mM dNTP 2. 5 μ L ；反轉(zhuǎn)錄酶 AMV 2. 5U ； Rnase 抑制劑 20U ； IOyMRVFVUl 0. 5μ L ;10μΜ RVFVLl 0. 5 μ L, 10 μ M RVFVPl 0. 5 μ L, rTaq聚合酶2. 5U ；RNA模板1. 6 X 1(Γ6 1· 6 X KT1Iig,余量為雙蒸水；反應(yīng)程序?yàn)?0°C反轉(zhuǎn)錄30min ；95°C預(yù)變性5min ；95°C變性10s，47°C退火20s，45個(gè)循環(huán)。
5.用于檢測(cè)裂谷熱病毒S片段的試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的引物和權(quán)利要求2 所述的探針。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測(cè)裂谷熱病毒S片段的引物和探針，其中上游引物5’-GGATTACTTTCCTGTGATATCTGTTG-3’，下游引物5’-GTATCCTGGGAGGRCCATCWC-3’(R為A或G，W為T或A)，探針5’-F1-ACTCCACTGACACAACACGACGACCACT-Q1-3′，F(xiàn)1為報(bào)告熒光基團(tuán)，Q1為淬滅熒光基團(tuán)。本發(fā)明還提供了裂谷熱病毒S片段的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)方法，該方法以裂谷熱病毒假病毒顆粒為模板，用上述引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)結(jié)果判定是否為裂谷熱病毒。本發(fā)明探針靈敏度高，特異性好，與非洲豬瘟、虹彩病毒、羊痘病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102433392SQ20111041560
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者吳紹強(qiáng), 林祥梅, 王彩霞, 鄧俊花 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院