專利名稱：監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法。
背景技術(shù)：
在再生醫(yī)療領(lǐng)域中，期待通過使用了干細(xì)胞的細(xì)胞移植、臟器再生來治療疑難病癥。雖然提前實(shí)行了心臟疾病等的臨床應(yīng)用，但是關(guān)于實(shí)際上所移植的干細(xì)胞如何發(fā)揮功能，不清楚的地方還很多。為了進(jìn)行安全的移植，必須解明干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)(向具有某種特定功能的細(xì)胞誘導(dǎo))的機(jī)理和確定控制細(xì)胞內(nèi)動態(tài)及功能的因子。迄今為止，已知干細(xì)胞以分子水平表達(dá)了與未分化細(xì)胞高度特異的若干轉(zhuǎn)錄因子。它們包括Oct-4、Sox、Nanog、白血病抑制因子受體(LIF-R)。0ct_4在原腸未形成胚、 早期卵裂胚、盤狀囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞和胚性癌(EC)細(xì)胞中表達(dá)。成體動物中，僅在生殖細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Oct-4。在ES細(xì)胞、iPS細(xì)胞等干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過與飼養(yǎng)細(xì)胞的共培養(yǎng)、LIF添加而維持了多能性，但是由于環(huán)境或細(xì)胞的狀態(tài)會失去多潛能，有時容易分化。在謀求分化誘導(dǎo)過程的理解方面，正確地獲知未分化狀態(tài)(具有多能性的狀態(tài))、分化狀態(tài)很重要，但是難以僅通過ES細(xì)胞的形態(tài)來判斷分化狀態(tài)。作為判斷多能性的指標(biāo)，進(jìn)行了堿性磷酸酶染色、使用了針對分化標(biāo)記物的特異抗體的免疫染色，但兩種方法均固定了細(xì)胞，因而無法持續(xù)調(diào)查細(xì)胞的狀態(tài)。干細(xì)胞研究還被期待應(yīng)用于移植治療等再生醫(yī)療領(lǐng)域，希望以使干細(xì)胞存活的狀態(tài)進(jìn)行經(jīng)時狀態(tài)變化的觀察。若以使細(xì)胞存活的狀態(tài)進(jìn)行觀察，還能夠?qū)⒆鳛閷?shí)驗(yàn)?zāi)康牡母杉?xì)胞或經(jīng)分化誘導(dǎo)的細(xì)胞分離出。從基礎(chǔ)研究的觀點(diǎn)來看，關(guān)于干細(xì)胞的未分化狀態(tài)維持機(jī)理或伴隨分化的標(biāo)記基因表達(dá)量變化，也有許多不清楚的地方，為了解明分化誘導(dǎo)機(jī)理，也需要以存活的干細(xì)胞為對象進(jìn)行研究。為了以使細(xì)胞存活的狀態(tài)調(diào)查分化誘導(dǎo)狀態(tài)，通過進(jìn)行以GFP為指標(biāo)的報道基因檢測來進(jìn)行分化標(biāo)記物的表達(dá)量的觀察(專利文獻(xiàn)I)?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開2008-118991號公報專利文獻(xiàn)2 :日本特表2009-523025號公報

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明人著眼干在一定期間對干細(xì)胞的分化狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)控時，若利用專利文獻(xiàn)1(日本特開2008-118991號公報)的方法，則存在以下所說明的問題。S卩，如專利文獻(xiàn)I那樣將GFP等熒光蛋白基因作為報道基因時，由于激發(fā)光照射所產(chǎn)生的噪音多，因而有時難以對基因表達(dá)量進(jìn)行定量。因此，以GFP為指標(biāo)的熒光觀察多被用作確定基因有無表達(dá)的方法。此外，在將GFP作為指標(biāo)時，由于在觀察時照射激發(fā)光，因而對于幾天 幾周的長期觀察，也考慮存在對細(xì)胞產(chǎn)生損傷的影響。此外，專利文獻(xiàn)I中，為了干細(xì)胞分離而使用了流式細(xì)胞儀，但關(guān)于干細(xì)胞中的基因表達(dá)水平，認(rèn)為表達(dá)在細(xì)胞周期的階段發(fā)生變化，因而在將干細(xì)胞(或來自干細(xì)胞的集落)単一化后進(jìn)行檢測的流式細(xì)胞儀檢測的情況下，也有可能無法選擇目標(biāo)干細(xì)胞。這樣，由于照射激發(fā)光，利用以GFP為指標(biāo)的報道基因檢測來調(diào)查細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法在定量性和長期觀察方面存在問題。另ー方面，作為不照射激發(fā)光而檢測細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)量的方法，進(jìn)行了以熒光素酶基因等發(fā)光蛋白基因作為報道基因的檢測。熒光素酶利用與熒光素的酶-底物反應(yīng)而發(fā)光，因此不需要導(dǎo)入激發(fā)光，能夠長時間觀察。但是，如專利文獻(xiàn)2 (日本特表2009-523025號公報)所述，使用熒光素酶檢測基因表達(dá)變化時通常使用基于光度計的光子計數(shù)檢測來進(jìn)行，該檢測中，為了檢測整個培養(yǎng)皿的細(xì)胞群的總和，在以生物體內(nèi)被認(rèn)為是異源細(xì)胞群的干細(xì)胞(或來自干細(xì)胞的集落)為對象的情況下，無法檢測各個干細(xì)胞的基因表達(dá)的變 化。另外，來自干細(xì)胞的集落是多樣的細(xì)胞的三維集合體，以該三維的集合體的狀態(tài)難以把握細(xì)胞的基因表達(dá)量。另外，來自干細(xì)胞的集落中，各干細(xì)胞、每個集落的特性不同，在以往進(jìn)行的以培養(yǎng)皿的細(xì)胞群整體為對象進(jìn)行觀察的方法中，具有難以正確分析各干細(xì)胞、每個集落的問題。著眼于上述問題，本發(fā)明的目的在于提供ー種不對細(xì)胞造成損傷、而針對各細(xì)胞或各集落監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法。用于解決課題的方案本發(fā)明人通過在干細(xì)胞中導(dǎo)入分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與發(fā)光蛋白基因(熒光素酶基因)的融合基因，并在一定期間對干細(xì)胞中發(fā)光蛋白基因(熒光素酶基因)的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝，從而達(dá)到了上述目的，完成了本發(fā)明。即，本發(fā)明提供下述技術(shù)方案。[I] 一種監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法，其特征在于，其包括以下エ序(A-I)對導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與發(fā)光蛋白基因的融合基因的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；(A-2)對于所述(A-I)的エ序后的干細(xì)胞，在誘導(dǎo)分化的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；和(A-3)在所述(A-I) (A-2)的エ序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由發(fā)光蛋白基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的エ序。[2] 一種監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法，其特征在于，其包括以下エ序(B-I)對導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與發(fā)光蛋白基因的融合基因的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；(B-2)進(jìn)ー步對干細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)的エ序；(B-3)對于所述(B-2)的エ序后的干細(xì)胞，在誘導(dǎo)分化的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；和(B-4)在所述(B-I) (B-3)的エ序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由發(fā)光蛋白基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的エ序。
[3] 一種監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法，其特征在于，其包括以下エ序(C-I)對導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與發(fā)光蛋白基因的融合基因的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；(C-2)進(jìn)ー步對干細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)的エ序；和(C-3)在所述(C-I) (C-2)的エ序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由發(fā)光蛋白基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的エ序。[4]如上述[I] [3]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述拍攝エ序是通過發(fā)光成像系統(tǒng)持續(xù)拍攝兩個以上的發(fā)光圖像的エ序。[5]如上述[4]所述的方法，其特征在于，其還包括以下エ序
在通過所述拍攝エ序得到的發(fā)光圖像的特定細(xì)胞區(qū)域，作為分化狀態(tài)的指標(biāo)，測定發(fā)光量，分析發(fā)光量的經(jīng)時變化。[6]如上述[I] [5]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，其還包括以下エ序進(jìn)行干細(xì)胞的明視野觀察，在與發(fā)光圖像相同的區(qū)域獲得明視野圖像。[7]如上述[I] [6]中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于，分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因是細(xì)胞在未分化的狀態(tài)下特異表達(dá)的未分化標(biāo)記基因和/或細(xì)胞在特定的分化過程中特異表達(dá)的分化標(biāo)記基因。[8]如上述[I] [7]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，干細(xì)胞是導(dǎo)入了兩種以上的融合基因的干細(xì)胞，融合基因分別包含不同種類的分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域，分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域分別與編碼具有不同的發(fā)光波長的發(fā)光蛋白的基因融合，使得其與其他分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域相區(qū)別地被檢測出。[9]如上述[8]所述的方法，其特征在干，干細(xì)胞是導(dǎo)入了兩種融合基因的干細(xì)胞，ー種融合基因是未分化標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與第一發(fā)光蛋白基因的融合基因，另ー種融合基因是在特定的分化過程中特異表達(dá)的分化標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與第二種發(fā)光蛋白基因的融合基因，所述第二種發(fā)光蛋白基因的表達(dá)與所述第一發(fā)光蛋白基因的表達(dá)相區(qū)別地被檢測出。[10] 一種確定干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法，其特征在于，其包括以下エ序基于利用上述[I] [9]中任一項(xiàng)所述的方法得到的發(fā)光圖像和/或發(fā)光量數(shù)據(jù)和/或明視野圖像，確定干細(xì)胞的分化狀態(tài)。[11] ー種獲得顯示所期望的分化狀態(tài)的干細(xì)胞的方法，其特征在于，其包括以下
ェ序基于利用上述[6]所述的方法得到的發(fā)光圖像和/或發(fā)光量數(shù)據(jù)和/或明視野圖像，由多個干細(xì)胞中獲得顯示所期望的分化狀態(tài)的干細(xì)胞。[12]如上述[I] [11]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述發(fā)光圖像表示集落內(nèi)的各個干細(xì)胞的基因表達(dá)量。[13]如上述[12]所述的方法，其中，所述集落形成了擬胚體。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明的方法，通過在干細(xì)胞中導(dǎo)入分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與發(fā)光蛋白基因(熒光素酶基因)的融合基因，并在一定期間對干細(xì)胞中的發(fā)光蛋白基因(熒光素酶基因)的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝，從而能夠在不對細(xì)胞造成損傷的情況下對各細(xì)胞或各集落監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)。


圖I是示出本發(fā)明的方法的一例的說明圖。圖2是懸滴法的示意圖。圖3是示出發(fā)光成像系統(tǒng)的一例的圖。圖4是示出本發(fā)明的實(shí)施例1-1 (剛觀察后)的結(jié)果的顯微鏡照片。圖5是示出本發(fā)明的實(shí)施例1-1 (觀察21小時后)的結(jié)果的顯微鏡照片。圖6是示出本發(fā)明的實(shí)施例1-1的結(jié)果的曲線圖。圖7是示出本發(fā)明的實(shí)施例1_2(添加LIF)的結(jié)果的顯微鏡照片。圖8是示出本發(fā)明的實(shí)施例1_2(添加LIF)中的細(xì)胞選擇區(qū)域的顯微鏡照片。圖9是示出本發(fā)明的實(shí)施例1_2(添加LIF)的結(jié)果的曲線圖。圖10是示出本發(fā)明的實(shí)施例1-2 (未添加LIF)中的細(xì)胞選擇區(qū)域的顯微鏡照片。圖11是示出本發(fā)明的實(shí)施例1_2(未添加LIF)的結(jié)果的曲線圖。圖12是示出本發(fā)明的實(shí)施例1-3中的細(xì)胞選擇區(qū)域的顯微鏡照片。圖13是示出本發(fā)明的實(shí)施例1-3的結(jié)果的曲線圖。圖14是示出本發(fā)明的實(shí)施例2-1的結(jié)果的顯微鏡照片。圖15是示意性示出擬胚體(EB)形成的狀況的圖。圖16是示出本發(fā)明的實(shí)施例2-2的結(jié)果的顯微鏡照片。
具體實(shí)施例方式下面詳細(xì)說明本發(fā)明，但下述說明的目的在于說明本發(fā)明，并不是要限定本發(fā)明。在ー個方式中，本發(fā)明的監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法包括以下エ序(A-I)對導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與熒光素酶基因的融合基因的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；(A-2)對于所述(A-I)的エ序后的干細(xì)胞，在誘導(dǎo)分化的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；(A-3)在所述(A-I) (A-2)的エ序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由熒光素酶基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的エ序。該方式中，能夠?qū)?jīng)分化誘導(dǎo)處理的干細(xì)胞的分化狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)控。在其他方式中，本發(fā)明的方法還包括以下エ序在上述(A-I)的培養(yǎng)エ序后，對干細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)。即，該方式中，本發(fā)明的監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法包括以下エ序(B-I)對導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與熒光素酶基因的融合基因的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；(B-2)進(jìn)ー步對干細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)的エ序；(B-3)對于所述(B-2)的エ序后的干細(xì)胞，在誘導(dǎo)分化的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；(B-4)在所述(B-I) (B-3)的エ序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由熒光素酶基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的エ序。
該方式中，能夠監(jiān)控繼代培養(yǎng)期間干細(xì)胞的分化狀態(tài)，以及能夠監(jiān)控經(jīng)分化誘導(dǎo)處理的干細(xì)胞的分化狀態(tài)。將該方式示意性地示于圖I。如圖I所示，若在抑制分化的條件下對用于分化狀態(tài)監(jiān)控而制成的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，則其大部分具有分化多能性，表達(dá)未分化標(biāo)記基因(Nanog基因)(參照圖I的分化誘導(dǎo)前的培養(yǎng)皿)。該干細(xì)胞通過進(jìn)行長時間的培養(yǎng)而有時與分化的干細(xì)胞混雜，由此，分化多能性產(chǎn)生偏差，出現(xiàn)未分化標(biāo)記基因(Nanog基因)的表達(dá)減少或消失的細(xì)胞(參照圖I的細(xì)胞繼代后的培養(yǎng)皿)。其后，若對干細(xì)胞實(shí)施分化誘導(dǎo)處理并進(jìn)行培養(yǎng)，則若干干細(xì)胞被分化誘導(dǎo)，表達(dá)特異的分化標(biāo)記基因(參照圖I的分化誘導(dǎo)后的培養(yǎng)皿)。這樣，本發(fā)明中，使用不同的熒光素酶檢測未分化標(biāo)記基因或分化標(biāo)記基因的表達(dá)，針對各細(xì)胞或各集落監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)。在另ー個方式中，本發(fā)明的方法還包括在上述(A-I)的培養(yǎng)エ序后對干細(xì)胞進(jìn)行 繼代培養(yǎng)的エ序，不包括(A-2)的誘導(dǎo)分化的エ序。即，該方式中，本發(fā)明的監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法包括以下エ序(C-I)對導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與熒光素酶基因的融合基因的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；(C-2)進(jìn)ー步對干細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)的エ序；(C-3)在所述(C-I) (C-2)的エ序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由熒光素酶基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的エ序。該方式中，能夠?qū)^代培養(yǎng)期間干細(xì)胞的分化狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)控。本發(fā)明中，“干細(xì)胞”是來自哺乳類(例如人、小鼠等)的任意的干細(xì)胞，例如為胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、組織性干細(xì)胞、人工多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)等。干細(xì)胞可以使用市售的細(xì)胞，也可以根據(jù)公知的方法制備。本發(fā)明中，“對分化狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)控”是指對干細(xì)胞為未分化的狀態(tài)、還是分化了何種程度的狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)控的意思。本發(fā)明中，“分化狀態(tài)”包括未分化的細(xì)胞的狀態(tài)也分化后的細(xì)胞的狀態(tài)。本發(fā)明中，“分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因”包括細(xì)胞在未分化的狀態(tài)下特異表達(dá)的“未分化標(biāo)記基因”和細(xì)胞在特定的分化過程中特異表達(dá)的“分化標(biāo)記基因”。本發(fā)明的方法中，作為“分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因”，可以使用未分化標(biāo)記基因或分化標(biāo)記基因中的任意一者，也可以使用兩者。另外，“分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因”可以使用ー種，也可以使用兩種以上(例如2種 5種)。例如，本發(fā)明中，可以使用兩種以上(例如2種或3種)的未分化標(biāo)記基因，也可以使用I種未分化標(biāo)記基因和I種分化標(biāo)記基因，還可以使用I種未分化標(biāo)記基因和兩種以上(例如2種或3種)的分化標(biāo)記基因?！拔捶只瘶?biāo)記基因”是細(xì)胞在未分化的狀態(tài)下特異表達(dá)的任意的基因，可以舉出例如NanOg、0ct、SOX等。另外，“分化標(biāo)記基因”是細(xì)胞在特定的分化過程中特異表達(dá)的任意的基因，例如作為神經(jīng)分化標(biāo)記基因，可以舉出Nestin、MashI，作為心肌分化標(biāo)記基因，可以舉出 GATA4、Nkx2. 5。下面，對本發(fā)明的方法的各エ序進(jìn)行說明。在以下的說明中，“分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因”也簡稱為“標(biāo)記基因”。
I.監(jiān)控用干細(xì)胞的制備本發(fā)明中，根據(jù)公知技木，將標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與熒光素酶基因(報道基因)融合，在干細(xì)胞中導(dǎo)入該融合基因，從而制備出監(jiān)控用干細(xì)胞?！皹?biāo)記基因的啟動子區(qū)域”可以使用公知的啟動子區(qū)域，也可以基于公知的標(biāo)記基因的堿基序列進(jìn)行克隆。例如，Nanog的啟動子區(qū)域記載于T Kuroda etal. , Molecular and Cellular Biology (2005 vol. 25, No. 6 p2475_2485) ; Oct 的啟動子區(qū)域記載于 SOkumura-Nakanishi et al. , The journal of Biological Chemistry (2005vol. 280，No7p5307_5317) ;Nestin 的啟動子區(qū)域記載于 L Cheng et al. , FEBS Letters2004 565ρ195-202。“熒光素酶基因”可以使用市售的基因，可以使用例如Eluc熒光素酶(綠)XRB熒光素酶(紅)、海腎熒光素酶(藍(lán))。若使用預(yù)先插入于載體內(nèi)的形態(tài)的熒光素酶基因，則從制備融合基因的方面來看是方便的。例如，作為預(yù)先含有熒光素酶基因的市售的載體，可以舉出 Eluc 載體(東洋紡)、CRB 載體(Promega)、Renilla 載體(Promega)。 此處，列舉使用熒光素酶基因作為報道基因時的例子對本發(fā)明進(jìn)行說明，但本發(fā)明不限定于此，可以使用該技術(shù)領(lǐng)域中公知的任意的“發(fā)光蛋白基因(luminescentprotein-coding gene) ”作為報道基因。本說明書中，“發(fā)光蛋白基因”與綠色熒光蛋白(GFP)基因等熒光蛋白基因?qū)Ρ仁褂茫绕涫蔷幋a生物發(fā)光蛋白的基因，例如該技術(shù)領(lǐng)域中公知的各種熒光素酶基因。在使用兩種以上標(biāo)記基因的情況下，使用兩種以上的熒光素酶基因，各標(biāo)記基因分別與不同的熒光素酶基因融合從而被識別檢測出。即，標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域分別與具有不同的發(fā)光波長的熒光素酶融合，使得其與其他標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域相區(qū)別地被檢測出。例如，對使用兩種“未分化標(biāo)記基因” Oct-4基因和Nanog基因作為標(biāo)記基因的情況進(jìn)行說明。首先，使用已經(jīng)在論文中公開的基因序列，對這些未分化標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域進(jìn)行克隆。S卩，關(guān)于 Oct-4 基因，以 “S Okumura-Nakanishi et al. , The journalof Biological Chemistry 2005 vol. 280, No7 p5307_5317” 為參考來獲得啟動子特異性序列；關(guān)于 Nanog 基因，以 “T Kuroda et al. , Molecular and Cellular Biology 2005vol. 25，No. 6p2475-2485”為參考來獲得啟動子特異性序列。將所獲得的Nanog、0ct-4基因啟動子序列分別插入ELuc載體(東洋紡)、CBR載體(Promega)。Eluc載體是含有Eluc突光素酶(緑)的載體，CBR載體是含有CRB熒光素酶(紅)的載體。由此，通過向這些載體插入Nanog、0ct-4基因啟動子序列,制作未分化標(biāo)記物表達(dá)特異性發(fā)光載體pNanog-Eluc、p0ct4_CBR。將含有融合基因的載體向干細(xì)胞中導(dǎo)入時可以根據(jù)公知的方法進(jìn)行，例如，可以通過磷酸鈣法、脂質(zhì)體法、電穿孔法進(jìn)行。這些方法可以根據(jù)目的和細(xì)胞的種類而分別使用。2.培養(yǎng)エ序本發(fā)明中，對根據(jù)上述方法制備的監(jiān)控用干細(xì)胞、即“導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與熒光素酶基因的融合基因的干細(xì)胞”進(jìn)行培養(yǎng)?？梢岳霉姆椒?，根據(jù)干細(xì)胞的種類將所需要的分化抑制因子添加到培養(yǎng)基中，在飼養(yǎng)細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)。優(yōu)選在抑制分化的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞。例如小鼠ES細(xì)胞的培養(yǎng)可以如下進(jìn)行利用直徑35_的細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)皿，在含有分化抑制因子LIF (白血病抑制因子)的DMEM培養(yǎng)基中，在作為飼養(yǎng)細(xì)胞的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)。干細(xì)胞例如在37. (TC培養(yǎng)I天 3天。上述培養(yǎng)后的干細(xì)胞可以繼續(xù)進(jìn)行繼代培養(yǎng)，也可以轉(zhuǎn)移到分化誘導(dǎo)エ序。繼代培養(yǎng)可以在與上述培養(yǎng)相同的條件下進(jìn)行。通常，干細(xì)胞容易自發(fā)性分化，因而在進(jìn)行繼代培養(yǎng)時，需要注意培養(yǎng)條件。例如，可以在含有分化抑制因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，觀察未分化標(biāo)記物的表達(dá)的變化，確定未分化細(xì)胞；或者，也可以在不含有分化抑制因子的培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，觀察未分化標(biāo)記物和/或分化標(biāo)記物的表達(dá)的變化，確定未分化細(xì)胞和/或分化細(xì)胞。3.分化誘導(dǎo)エ序干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)可以如下進(jìn)行利用公知的方法，根據(jù)干細(xì)胞的種類、分化的方向性，在誘導(dǎo)分化的條件下培養(yǎng)干細(xì)胞，從而進(jìn)行干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。 誘導(dǎo)分化的條件下可以為積極地誘導(dǎo)干細(xì)胞的分化的條件下，也可以為抑制干細(xì)胞的自發(fā)性分化的條件下(不存在分化抑制因子的條件下)。干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)法可以舉出利用物理刺激的方法、利用藥物刺激的方法、利用分化誘導(dǎo)因子的導(dǎo)入的方法等。作為利用物理刺激的方法，可以舉出例如懸滴法、振蕩培養(yǎng)。另外，作為利用藥物刺激的方法，例如為了分化誘導(dǎo)為神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞，可以舉出向培養(yǎng)基中添加視黃酸(Retinoic acid)的方法；為了分化誘導(dǎo)為心肌細(xì)胞，可以舉出添加擬胚體形成后的BMP-2和Wnt-Il的方法。S卩，關(guān)于干細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，可以使用懸滴法等，從干細(xì)胞經(jīng)過擬胚體創(chuàng)造出分化細(xì)胞；或者，也可以從干細(xì)胞直接創(chuàng)造出分化細(xì)胞而不經(jīng)過擬胚體。將懸滴法的示意圖示于圖2。懸滴法中，如圖2所示，在以水滴狀滴落到塑料培養(yǎng)皿蓋等基板上的培養(yǎng)液(液滴)中培養(yǎng)干細(xì)胞。即，將導(dǎo)入有對象標(biāo)記基因的啟動子的發(fā)光載體導(dǎo)入細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)用的塑料培養(yǎng)皿蓋，形成液滴。在進(jìn)行了液滴形成后，根據(jù)本發(fā)明，使用發(fā)光顯微鏡進(jìn)行2天的連續(xù)觀察?？梢岳冒l(fā)光顯微鏡經(jīng)時地觀察単一的干細(xì)胞凝聚并形成擬胚體的過程。另外，根據(jù)需要，若在導(dǎo)入有標(biāo)記基因的啟動子的發(fā)光載體中預(yù)先導(dǎo)入抗生物質(zhì)的耐性基因，則能夠在回收必要的擬胚體后通過進(jìn)ー步進(jìn)行藥物選擇來得到目標(biāo)細(xì)胞。已知ES細(xì)胞的分化不僅與細(xì)胞特性有關(guān)，還與細(xì)胞間的相互關(guān)系有夫。還認(rèn)為各種細(xì)胞的分化效率被擬胚體的性質(zhì)所影響。由于擬胚體的性質(zhì)因液滴的大小、所接種的細(xì)胞數(shù)而改變，因而觀察擬胚體的形成過程很重要，但現(xiàn)狀是未進(jìn)行擬胚體形成過程的成像檢測。已知在擬胚體形成中有在滲透干細(xì)胞的狀態(tài)下進(jìn)行培養(yǎng)的方法。4.拍攝エ序?qū)υ谂囵B(yǎng)容器中所培養(yǎng)的干細(xì)胞的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝時，在含有干細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加作為底物的熒光素，開始發(fā)光觀察。熒光素的添加也可以伴隨ATP、鎂等的添加。本發(fā)明中，在上述培養(yǎng)エ序和分化誘導(dǎo)エ序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由熒光素酶基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝。該拍攝エ序可以通過發(fā)光成像進(jìn)行。優(yōu)選通過發(fā)光成像持續(xù)拍攝發(fā)光圖像。發(fā)光成像可以使用市售的發(fā)光成像系統(tǒng)、例如奧林巴斯制造的發(fā)光成像系統(tǒng)LV200來進(jìn)行。
參照圖3，對發(fā)光成像系統(tǒng)的一例進(jìn)行說明。在圖3所示的發(fā)光成像系統(tǒng)100中，含有干細(xì)胞的標(biāo)本110配置于載物臺104上的培養(yǎng)器103內(nèi)。標(biāo)本110通常放入培養(yǎng)皿中，載物臺104和培養(yǎng)器103開有觀察用的孔(未圖示)。在發(fā)光觀察的情況下，標(biāo)本110發(fā)出的光在物鏡光學(xué)系統(tǒng)105中前迸，不需要的光被分光濾波器106所截斷，在CCD照相機(jī)107中被檢測出。在CCD照相機(jī)107中被檢測出的光被送至控制器PClll而圖像化。需要說明的是，在単色的發(fā)光觀察的情況下，也可以不配置分光濾波器106。光源109照射用于明視野觀察的照明光。分光濾波器108在僅透過特定波長的光時(熒光觀察)使用，在明視野觀察時不使用?？刂破鱌Clll是一般的PC等計算機(jī)，其對CXD照相機(jī)107的攝影條件進(jìn)行控制；進(jìn)行所獲圖像的圖像化和顯示以及光源109的光量的控制等。并且，控制器PClll進(jìn)行圖像處理和圖像分析，還能夠與觀察條件一起預(yù)先保持圖像分析數(shù)據(jù)。 將這些裝置的一部分或全部配置于遮斷來自外部的光的腔等遮光裝置內(nèi)，從而能夠以良好的精度穩(wěn)定地檢測微弱光而不受外部的光的影響。例如，如圖3所示，可以以標(biāo)本110被暗箱102和蓋101遮光的狀態(tài)來放置。發(fā)光成像系統(tǒng)的光學(xué)系統(tǒng)可以參照國際公開W02006-106882。本發(fā)明中，持續(xù)拍攝發(fā)光圖像可以是連續(xù)拍攝發(fā)光圖像，也可以是以預(yù)定的間隔(例如，5分鐘 I小時的間隔)拍攝發(fā)光圖像。利用兩種以上熒光素酶基因識別標(biāo)記兩種以上標(biāo)記基因的情況下，如后述的實(shí)施例2所述，使用分光濾波器(參照圖3的濾波器106)，以特異的各波長對各熒光素酶進(jìn)行拍攝。發(fā)光圖像的觀察可以與明視野圖像的觀察組合進(jìn)行(參照圖4和圖5)。S卩，通過在與獲得發(fā)光圖像的區(qū)域相同的區(qū)域獲得明視野圖像，從而能夠觀察標(biāo)記基因的表達(dá)狀況和細(xì)胞分化所引起的細(xì)胞的形態(tài)變化(例如通過向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的分化所引起的細(xì)胞的形態(tài)變化)的狀況。此外，在通過拍攝エ序得到的發(fā)光圖像的特定細(xì)胞區(qū)域中，作為分化狀態(tài)的指標(biāo)，可以測定發(fā)光量，分析發(fā)光量的經(jīng)時變化(參照圖6)。基于所得到的發(fā)光圖像和/或發(fā)光量數(shù)據(jù)和/或明視野圖像，能夠確定干細(xì)胞的分化狀態(tài)。優(yōu)選能夠基于發(fā)光圖像的經(jīng)時變化和/或發(fā)光量的經(jīng)時變化來確定干細(xì)胞的分化狀態(tài)?；蛘邇?yōu)選能夠基于與發(fā)光量的經(jīng)時變化有關(guān)的數(shù)據(jù)來確定干細(xì)胞的分化狀態(tài)。另外，基于所得到的發(fā)光圖像和/或發(fā)光量數(shù)據(jù)和/或明視野圖像，能夠由多個干細(xì)胞中獲得顯示所期望的分化狀態(tài)的干細(xì)胞。優(yōu)選能夠基于發(fā)光圖像的經(jīng)時變化和/或發(fā)光量的經(jīng)時變化來獲得顯示所期望的分化狀態(tài)的干細(xì)胞?；蛘邇?yōu)選能夠基于與發(fā)光量的經(jīng)時變化有關(guān)的數(shù)據(jù)來獲得顯示所期望的分化狀態(tài)的干細(xì)胞。例如，根據(jù)發(fā)光圖像和/或發(fā)光量數(shù)據(jù)，在含有測定對象細(xì)胞的感興趣區(qū)域(R0I Region Of Interest)中，未分化標(biāo)記物的表達(dá)量維持恒定的情況下,可知測定對象的細(xì)胞以未分化的狀態(tài)維持。另ー方面，根據(jù)發(fā)光圖像和/或發(fā)光量數(shù)據(jù)，在觀察到未分化標(biāo)記物的表達(dá)量降低的情況下，可知測定對象的細(xì)胞由未分化的狀態(tài)發(fā)生了變化。該情況下，通過合用未分化標(biāo)記物和分化標(biāo)記物，對未分化標(biāo)記物的表達(dá)量降低和分化標(biāo)記物的表達(dá)量增大這兩者進(jìn)行觀察，即使在細(xì)胞未出現(xiàn)形態(tài)變化的階段，也可知曉測定對象的細(xì)胞朝向分化的方向。關(guān)于用于獲得所期望的干細(xì)胞的拾取操作，可以在獲得發(fā)光圖像的發(fā)光顯微鏡下進(jìn)行，也可以將樣品移動至正置顯微鏡而進(jìn)行。另外，本發(fā)明中可以進(jìn)行各種變更而不限定于上述例子。例如，在上述說明中對拾取操作進(jìn)行了說明，但本發(fā)明中也可以應(yīng)用包括在容器等中分離所期望的細(xì)胞或細(xì)胞內(nèi)部位等其他操作的各種細(xì)胞操作。并且，在上述說明中，為了將作為生物體試樣而從個體提取等的細(xì)胞或組織等保持為存活的狀態(tài)，在預(yù)定的容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，從而具有還能夠適用于胚、微生物、細(xì)菌等微小生物的構(gòu)成，但在對實(shí)驗(yàn)用動物或植物等生物個體進(jìn)行顯微鏡性質(zhì)的拍攝時(所謂活體成像或內(nèi)窺鏡觀察等)，在使用了培養(yǎng)器等的容器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)時，進(jìn)行自然培養(yǎng)以使干細(xì)胞等在體內(nèi)保持為生存狀態(tài)，這樣的培養(yǎng)也包括在本發(fā)明中的培養(yǎng)エ序中。5.本發(fā)明的效果 如上所述，本發(fā)明中，利用以熒光素酶為指標(biāo)的發(fā)光成像，以圖像的形式檢測標(biāo)記基因表達(dá)量，從而能夠測定來自ー個細(xì)胞或者不同的集落的發(fā)光量，能夠確定各干細(xì)胞或各集落的分化狀態(tài)。通過進(jìn)行以熒光素酶為指標(biāo)的干細(xì)胞成像，能夠在使細(xì)胞存活的狀態(tài)下對標(biāo)記基因的表達(dá)進(jìn)行定量且經(jīng)時的觀察。另外，通過以熒光素酶為指標(biāo)進(jìn)行干細(xì)胞成像，能夠?qū)υ诩?xì)胞的形態(tài)變化中無法確定的細(xì)胞分化的程度進(jìn)行監(jiān)測，與迄今為止的方法相比能夠更精細(xì)地把握分化狀態(tài)。通過基于干細(xì)胞成像進(jìn)行圖像檢測，經(jīng)時地觀察各干細(xì)胞或集落，能夠進(jìn)行鑒于細(xì)胞周期的階段的更高精度的檢測。通過將多種而非ー種未分化標(biāo)記物和分化標(biāo)記物組合檢測，能夠更準(zhǔn)確地把握分化狀態(tài)的階段。另外，通過與定量性優(yōu)異的發(fā)光成像合用目的在于形態(tài)觀察的明視野觀察，還能夠在不對細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)光照射的情況下捕捉細(xì)胞的形態(tài)變化和標(biāo)記基因表達(dá)的狀況。關(guān)于干細(xì)胞的未分化維持機(jī)理，尚未明確，但利用發(fā)明的方法也能夠檢測在形態(tài)的變化中未知的各種未分化標(biāo)記物的基因表達(dá)變化。例如，可以通過針對各干細(xì)胞或集落將已經(jīng)確定的Oct-4和Nanog基因表達(dá)量可視化，來把握各未分化標(biāo)記物的表達(dá)平衡，調(diào)查以何種程度保持未分化狀態(tài)，在形態(tài)相同的細(xì)胞中，調(diào)查未分化標(biāo)記物表達(dá)量對分化的方向性所產(chǎn)生的影響。實(shí)施例實(shí)施例I :使用了未分化標(biāo)記物的例子實(shí)施例1-1 :暫時性表達(dá)細(xì)胞的觀察和分析(I)導(dǎo)入有未分化標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與熒光素酶基因的融合基因的ES細(xì)胞的制作關(guān)于Nanog基因啟動子區(qū)域的克隆，參考非專利文獻(xiàn)“T Kuroda etal. , Molecular and Cellular Biology 2005 vol. 25，No. 6，p2475_2485” 來獲得啟動子序列。以小鼠基因組DNA為模板來獲得Nanog基因啟動子區(qū)域序列。用于擴(kuò)增Nanog基因啟動子區(qū)域的引物使用下述引物。
正向引物CTACTCGAGATCGCCAGGGTCTGGA(序列編號I)反向引物CTACTCGAGCGCAGCCTTCCCACAGAAA(序列編號 2)。將所獲得的Nanog基因啟動子序列插入pGL4_basic載體(Promega),制作“Nanog基因表達(dá)特異性發(fā)光載體pNanog-GL4”。為了培養(yǎng)ES細(xì)胞，準(zhǔn)備了飼養(yǎng)細(xì)胞。具體地說，用O. 1%明膠涂覆直徑為35mm的塑料培養(yǎng)皿，用PBS清洗3次。在進(jìn)行了明膠涂覆的培養(yǎng)皿中撒上經(jīng)絲裂霉素C處理而停止了分裂的MEF細(xì)胞(mouse embryonic fibro-blast小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)，進(jìn)行了一晚培養(yǎng)。培養(yǎng)基使用DMEM(酚紅、加入10%FCS)。第二天，將小鼠ES細(xì)胞(BRC6株、理研BRC)撒在35mm培養(yǎng)皿內(nèi)的飼養(yǎng)細(xì)胞上。培養(yǎng)ー晚后，將上述“pNanog-GL4基因表達(dá)載體”轉(zhuǎn)染到小鼠ES細(xì)胞，作為培養(yǎng)基使用加入了 15%KSR (Knockout Serum(Gibco))、LIF(白血病抑制因子)的DMEM，將轉(zhuǎn)染后的ES細(xì)胞培養(yǎng)一晩?；虻霓D(zhuǎn)染使用基于Amaxa Nucleofector (和光純藥株式會社)的 核轉(zhuǎn)染法。第二天，將培養(yǎng)基置換為加入了 HEPES的DMEM(15%KSR、去除酚紅)。需要說明的是，本實(shí)驗(yàn)中，使用了暫時性表達(dá)細(xì)胞株，但也可以使用導(dǎo)入耐藥性基因而進(jìn)行藥物選擇的穩(wěn)定表達(dá)株細(xì)胞。(2) ES細(xì)胞的觀察和分析為了進(jìn)行發(fā)光觀察而加入D-突光素(Promega社制造最終濃度100 μ M),使用發(fā)光顯微鏡LV200(奧林巴斯株式會社制造)觀察了小鼠ES細(xì)胞。作為發(fā)光觀察條件，以45分鐘間隔對小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行15分鐘攝影，由此觀察Nanog基因表達(dá)量。物鏡為X20，像素組合為1X1，CCD照相機(jī)為ImagEM(Hamamatsu Photonics株式會社制造)。定時拍攝觀察后，保存所拍攝的觀察圖像，使用圖像分析系統(tǒng)“AQUAC0SM0S(Hamamatsu Photonics株式會社制造)”由該觀察圖像分析數(shù)值數(shù)據(jù)，同時將所分析的數(shù)值數(shù)據(jù)曲線圖化。將所獲得的發(fā)光圖像示于圖4和圖5。圖4的(A)表示利用LV200剛進(jìn)行發(fā)光觀察后的發(fā)光圖像，圖4的(B)表示利用LV200剛進(jìn)行發(fā)光觀察后的明視野圖像與發(fā)光圖像的疊加圖像。圖5是觀察21小時后的圖像。圖5的(A)表示發(fā)光圖像，圖5的⑶表示明視野圖像與發(fā)光圖像的疊加圖像。選擇3處ES細(xì)胞集落，在各區(qū)域進(jìn)行發(fā)光量的數(shù)值化，其結(jié)果示于圖6。所選擇的3處區(qū)域示于圖4和圖5，分別稱為ROI I 3。由圖4和圖5的圖像可知，在觀察21小時后，ROI 2的區(qū)域中發(fā)光強(qiáng)度降低，ROI 3的區(qū)域中發(fā)光強(qiáng)度増大。該結(jié)果與圖6的發(fā)光量的結(jié)果也一致。由圖4 6的結(jié)果觀察到從培養(yǎng)開始時起發(fā)光增加的集落(R0I 3)、變化少的集落(R0I I)、減少的集落(R0I 2)，可知根據(jù)各干細(xì)胞集落的不同，集落整體的Nanog基因表達(dá)的模式不同。基因表達(dá)的模式表示基因表達(dá)隨時間經(jīng)過而變動的狀況。已知ES細(xì)胞是具有不同性質(zhì)的異源的細(xì)胞群，與以往得到的見解一致。由本結(jié)果可知，能夠針對每ー個細(xì)胞或每ー個集落監(jiān)控ES細(xì)胞的分化狀態(tài)。由以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，將熒光素酶的發(fā)光量作為指標(biāo)，能夠連續(xù)地測定未分化標(biāo)記物Nanog的基因表達(dá)。本研究中為21小時左右的觀察，若在數(shù)天進(jìn)行長期觀察的情況下，也可以交換熒光素和添加了分化抑制因子LIF(白血病抑制因子)的ES細(xì)胞培養(yǎng)液，連續(xù)地進(jìn)行觀察。根據(jù)需要,也可以添加飼養(yǎng)細(xì)胞。實(shí)施例1-2 :穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的長期觀察和分析本實(shí)施例中，作為基因?qū)胼d體，使用含有耐藥性基因的載體，通過藥物選擇來選擇進(jìn)行了基因?qū)氲募?xì)胞(穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞)，進(jìn)行長期觀察和分析。以下說明本實(shí)施例的詳細(xì)內(nèi)容。(I)導(dǎo)入有未分化標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與熒光素酶基因的融合基因的ES細(xì)胞的制作關(guān)于Nanog基因啟動子區(qū)域的克隆，參考非專利文獻(xiàn)“T Kuroda etal. , Molecular and Cellular Biology 2005 vol. 25，No. 6，p2475_2485” 來獲得啟動子序列。 以小鼠基因組DNA為模板來獲得Nanog基因啟動子區(qū)域序列。用于擴(kuò)增Nanog基因啟動子區(qū)域的引物使用下述引物。正向引物CTACTCGAGATCGCCAGGGTCTGGA(序列編號 I)反向引物CTACTCGAGCGCAGCCTTCCCACAGAAA(序列編號 2)。關(guān)于基因?qū)胼d體，將新霉素耐性pGL4載體(Promega)的熒光素酶基因部分置換為Eluc熒光素酶基因進(jìn)行使用。將所獲得的Nanog基因啟動子序列導(dǎo)入上述載體，制作“ Nanog基因表達(dá)特異性發(fā)光載體pNanog-EIuc”，對小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行基因?qū)??；虻霓D(zhuǎn)染使用基于AmaxaNucleofector (和光純藥株式會社)的核轉(zhuǎn)染法。通過進(jìn)行G418添加，僅對進(jìn)行了基因?qū)氲募?xì)胞進(jìn)行藥物選擇，制作穩(wěn)定表達(dá)株細(xì)胞。為了培養(yǎng)ES細(xì)胞，準(zhǔn)備了飼養(yǎng)細(xì)胞。具體地說，用0. 1%明膠涂覆直徑為35mm的塑料培養(yǎng)皿，用PBS清洗3次。在進(jìn)行了明膠涂覆的培養(yǎng)皿中撒上經(jīng)絲裂霉素C處理而停止了分裂的MEF細(xì)胞(mouse embryonic fibro-blast小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)，進(jìn)行了一晚培養(yǎng)。培養(yǎng)基使用DMEM(酚紅、加入10%FCS)。第二天，將小鼠ES細(xì)胞(BRC6株、理研BRC)撒在35mm培養(yǎng)皿內(nèi)的飼養(yǎng)細(xì)胞上。培養(yǎng)ー晚后，作為培養(yǎng)基使用加入了 15%KSR (Knockout Serum(Gibco))、LIF (白血病抑制因子)的DMEM，將恒常表達(dá)Nanog-Eluc的小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)一晩。培養(yǎng)后，為了以“添加LIF”、“不添加LIF”的兩個條件進(jìn)行發(fā)光觀察，在轉(zhuǎn)染的第二天，分別置換為加入有LIF和HEPES的01^] (15%1 1 、去除酚紅)、加入有冊 ￡3的DMEM (15%KSR、去除酚紅、不添加LIF)培養(yǎng)基。關(guān)于LIF的添加，通過以規(guī)定濃度使用制品名LIF Human, recombinant, CultureSupernatant (和光純藥制造)來進(jìn)行。需要說明的是，本實(shí)驗(yàn)中，使用了導(dǎo)入耐藥性基因而進(jìn)行藥物選擇的穩(wěn)定表達(dá)株細(xì)胞，但也可以使用暫時性表達(dá)細(xì)胞株。(2) ES細(xì)胞的觀察和分析為了進(jìn)行發(fā)光觀察而加入D-突光素(Promega社制造最終濃度500 ii M),使用發(fā)光顯微鏡LV200(奧林巴斯株式會社制造)觀察了小鼠ES細(xì)胞。作為發(fā)光觀察條件，以15分鐘間隔對小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行12分鐘攝影，由此觀察Nanog基因表達(dá)量。物鏡為X20，像素組合為1X1, CCD照相機(jī)為ImagEM(Hamamatsu Photonics株式會社制造)。
定時拍攝觀察后，保存所拍攝的觀察圖像，使用圖像分析系統(tǒng)“AQUAC0SM0S(Hamamatsu Photonics株式會社制造)”由該觀察圖像分析數(shù)值數(shù)據(jù)，同時將所分析的數(shù)值數(shù)據(jù)曲線圖化。進(jìn)行在培養(yǎng)基中加入LIF并進(jìn)行觀察的實(shí)驗(yàn)，將所獲得的發(fā)光圖像示于圖7。圖7的(A)是利用LV200剛進(jìn)行發(fā)光觀察后的發(fā)光圖像，圖7的(B)是利用LV200剛進(jìn)行發(fā)光觀察后的明視野圖像與發(fā)光圖像的疊加圖像。以模擬彩色黃色表示發(fā)光圖像。為了對Nanog表達(dá)量進(jìn)行定量，選擇多處ES細(xì)胞集落，進(jìn)行發(fā)光量的數(shù)值化。將細(xì)胞選擇區(qū)域示于圖8。在所選擇的區(qū)域中，關(guān)于ROI 1-10的10個集落，將發(fā)光量數(shù)值曲線圖化并示于圖9。分別稱為ROI I 10。圖9的(A)表示ROI I 5的結(jié)果，圖9的⑶表示ROI 6 10的結(jié)果。
由圖9的結(jié)果觀察到在許多集落中Nanog基因表達(dá)量發(fā)生變動?？雌饋砭哂?6-18 小時周期的振蕩。在 Chambers I, et al. , Nature, Vol. 450，1230-1234，2007 中，報道了干細(xì)胞中的振蕩現(xiàn)象，但迄今并沒有長時間對每ー個集落進(jìn)行Nanog表達(dá)分析的研究。接下來，以從培養(yǎng)基中除去了 LIF的條件進(jìn)行了發(fā)光和明視野觀察。為了對Nanog表達(dá)量進(jìn)行定量，選擇多處ES細(xì)胞集落，進(jìn)行發(fā)光量的數(shù)值化。利用基于明視野圖像的形態(tài)信息，分類成未分化狀態(tài)的集落和分化狀態(tài)略微擴(kuò)大的集落，進(jìn)行發(fā)光量的數(shù)值化。將細(xì)胞選擇區(qū)域示于圖10。未分化細(xì)胞選擇為ROI 6-10，分化細(xì)胞選擇為ROI 1-5。將所選擇的未分化細(xì)胞和分化細(xì)胞的發(fā)光量數(shù)值曲線圖化，示于圖U。圖11的(A)表示未分化細(xì)胞的結(jié)果，圖11的(B)表示分化細(xì)胞的結(jié)果。對基于形態(tài)分類的發(fā)光模式進(jìn)行比較時，在未分化狀態(tài)的集落中觀察到振蕩，但在進(jìn)行了分化的集落中觀察到振蕩消失的傾向。實(shí)施例1-3 :藥物刺激下的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞的長期觀察和分析使用實(shí)施例1-2中所用的恒常表達(dá)Nanog-Eluc的小鼠ES細(xì)胞，在利用FGF(成纖維細(xì)胞生長因子)分化誘導(dǎo)后，嘗試了使信號傳導(dǎo)抑制劑發(fā)揮作用的觀察。據(jù)報道FGF信號是誘導(dǎo)干細(xì)胞分化的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，通過使抑制劑發(fā)揮作用，從分化返回未分化狀態(tài)(TKunath et al.，Development 134，2895-2902，2007)。細(xì)胞的制備法與實(shí)施例 1-2 相同。(I)ES細(xì)胞的制備在培養(yǎng)皿接種并培養(yǎng)ー晚后，作為培養(yǎng)基使用加入有15%KSR (KnockoutSerum (Gibco)),LIF (白血病抑制因子)的DMEM，將恒常表達(dá)Nanog-Eluc的小鼠ES細(xì)胞培養(yǎng)一晩。培養(yǎng)后，置換為加入有JEPES的DMEM(15%KSR、去除酚紅、未添加LIF)。(2) ES細(xì)胞的觀察和分析為了進(jìn)行發(fā)光觀察而加入D-突光素(Promega社制造最終濃度500 U M),以終濃度為10ng/ml的方式添加FGF (FGF ^人，PeproTech制造)，使用發(fā)光顯微鏡LV200 (奧林巴斯株式會社制造)觀察了小鼠ES細(xì)胞。作為發(fā)光觀察條件，以I小時間隔對小鼠ES細(xì)胞進(jìn)行55分鐘攝影，由此觀察Nanog基因表達(dá)量。觀察40小時后，添加作為FGF信號的抑制劑的H)184352(和光純藥制造)和SU5402(和光純藥制造)，進(jìn)而進(jìn)行26小時觀察。PD184352為ERK路徑的抑制劑，SU5402為FGF-R酪氨酸激酶抑制劑，據(jù)報道通過同時使用這兩者，對于FGF信號的抑制效果増大。各抑制劑的終濃度分別為10mM、2mM。物鏡為X 20,像素組合為1X1, (XD照相機(jī)為ImagEM(HamamatsuPhotonics株式會社制造)。
定時拍攝觀察后，保存所拍攝的觀察圖像，使用圖像分析系統(tǒng)“AQUAC0SM0S(Hamamatsu Photonics株式會社制造)”由該觀察圖像分析數(shù)值數(shù)據(jù)，同時將所分析的數(shù)值數(shù)據(jù)曲線圖化。為了對Nanog表達(dá)量進(jìn)行定量，選擇多處ES細(xì)胞集落。將發(fā)光圖像的細(xì)胞選擇區(qū)域的一部分示于圖12。圖12的(A)是利用LV200進(jìn)行發(fā)光觀察開始時的發(fā)光圖像，圖12的(B)是利用LV200進(jìn)行發(fā)光觀察結(jié)束時的發(fā)光圖像。將所選擇的9個區(qū)域ROI 1-9的發(fā)光量數(shù)值曲線圖化，示于圖13。集落的Nanog表達(dá)量分成A-C的3種表達(dá)模式。將A-C的表達(dá)模式分別不于圖13的(A)-(C)。A的表達(dá)模式為在Nanog表達(dá)降低的40小時后通過添加抑制劑Nanog表達(dá)上升的集落。認(rèn)為是由于抑制了分化誘導(dǎo)而使作為未分化標(biāo)記物的Nanog表達(dá)上升。這與Nanog的表達(dá)為可逆的報道結(jié)果一致。關(guān)于B的表達(dá)模式，在添加抑制劑后也仍為Nanog表達(dá)降低的狀態(tài)，認(rèn)為是分化誘 導(dǎo)進(jìn)行而未觀察到抑制劑的效果。關(guān)于C的表達(dá)模式，其是在添加FGF時未觀察到Nanog表達(dá)、但通過添加抑制劑Nanog表達(dá)上升的集落。雖然生理學(xué)上的意義尚不明確，但如這些分類這樣，能夠觀察到在各集落中Nanog表達(dá)的模式不同。由這些結(jié)果可知，關(guān)于Nanog基因表達(dá)量和周期等，由于各干細(xì)胞集落的不同，Nanog基因表達(dá)的模式不同。已知ES細(xì)胞是具有不同性質(zhì)的異源的細(xì)胞群，與以往得到的見解一致。由本結(jié)果可知，對于每一個細(xì)胞或每ー個集落，能夠監(jiān)控ES細(xì)胞的分化狀態(tài)。這樣，不進(jìn)行流式細(xì)胞儀那樣的在終點(diǎn)進(jìn)行的多能性/分化標(biāo)記物的檢測、定量，而是對每ー個細(xì)胞進(jìn)行時間上連續(xù)的基因表達(dá)模式分析，從而能夠進(jìn)行精度更高的分析。對每ー個細(xì)胞或每ー個集落進(jìn)行了詳細(xì)的分析后，以表示基因表達(dá)量的發(fā)光量和表示基因表達(dá)模式的發(fā)光模式作為指標(biāo)，獲得目標(biāo)細(xì)胞，從而容易地實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞的純化。通過進(jìn)一歩對所獲得的干細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)，能夠明確每個集落的特性。由以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，將熒光素酶的發(fā)光量作為指標(biāo)，能夠連續(xù)地計測未分化標(biāo)記物Nanog的基因表達(dá)。實(shí)施例2 :使用了未分化標(biāo)記物和分化標(biāo)記物的例子實(shí)施例2-1 :分化誘導(dǎo)前的ES細(xì)胞的觀察本實(shí)施例中，以具有不同的波長特性的熒光素酶即綠(Eluc熒光素酶)和紅(CBR熒光素酶)作為指標(biāo)，對未分化標(biāo)記物Nanog基因、神經(jīng)分化標(biāo)記物Nestin基因進(jìn)行檢測。本實(shí)施例中，將干細(xì)胞分化誘導(dǎo)為神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞時，利用發(fā)光成像對與ES細(xì)胞的分化誘導(dǎo)相伴的各標(biāo)記基因的表達(dá)變化進(jìn)行檢測、定量化。(I)導(dǎo)入有未分化標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與熒光素酶基因的融合基因、及分化標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與熒光素酶基因的融合基因這兩者的ES細(xì)胞的制作關(guān)于Nanog基因、Nestin基因的啟動子區(qū)域的克隆，使用已經(jīng)在論文中公開的基因序列。關(guān)于Nanog基因，參考非專利文獻(xiàn)“T Kuroda et al. , Molecular and CellularBiology 2005 vol. 25, No. 6，p2475_2485”來獲得啟動子序列，關(guān)于Nestin基因，參考非專利文獻(xiàn)“L Cheng et al. , FEBS Letters 2004 565 pl95_202”來獲得啟動子序列。以小鼠基因組DNA為模板來獲得Nanog基因啟動子區(qū)域序列。用于擴(kuò)增Nanog基因啟動子區(qū)域的引物使用下述引物。正向引物CTACTCGAGATCGCCAGGGTCTGGA(序列編號 I)反向引物CTACTCGAGCGCAGCCTTCCCACAGAAA(序列編號 2)。以小鼠基因組DNA為模板來獲得Nestin基因啟動子區(qū)域序列。用于擴(kuò)增Nestin基因啟動子區(qū)域的引物使用下述引物。正向引物GAGAACGCGTGGGCTGTGTGTTGCACT(序列編號 3)反向引物GAGACTCGAGGTGGAGCACTAGAGAAGGGAGT(序列編號 4)。將所獲得的Nanog、Nestin基因啟動子序列分別插入ELuc載體(東洋紡)、CBR載體(Promega)，制作出插入有不同熒光素酶的“未分化標(biāo)記物表達(dá)特異性發(fā)光載體 pNanog-Eluc”、“分化標(biāo)記物表達(dá)特異性發(fā)光載體pNestin_CBR”。為了培養(yǎng)進(jìn)行基因?qū)氲腅S細(xì)胞，準(zhǔn)備了飼養(yǎng)細(xì)胞。具體地說，用O. 1%明膠涂覆直徑為35mm的塑料培養(yǎng)皿，用PBS清洗3次。在進(jìn)行了明膠涂覆的培養(yǎng)皿中撒上經(jīng)絲裂霉素C處理而停止了分裂的MEF細(xì)胞(mouse embryonic fibro-blast小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)，進(jìn)行了ー晚培養(yǎng)。培養(yǎng)基使用DMEM(酚紅、加入10%FCS)。第二天，將小鼠ES細(xì)胞(BRC6株、理研BRC)撒在35mm培養(yǎng)皿內(nèi)的飼養(yǎng)細(xì)胞上。培養(yǎng)ー晚后，將pNanog-Eluc、pNestin-CBR兩載體轉(zhuǎn)染到小鼠ES細(xì)胞，作為培養(yǎng)基使用加入了 15%KSR (Knockout Serum(Gibco))、LIF(白血病抑制因子)的DMEM，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞培養(yǎng)一晩。基因的轉(zhuǎn)染使用基于Amaxa Nucleofector (和光純藥株式會社)的核轉(zhuǎn)染法。第二天，置換為加入了 HEPES的DMEM(15%KSR、去除酚紅)，為了進(jìn)行向神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，添加了 IuM的視黃酸(Sigma)。(2) ES細(xì)胞的觀察為了進(jìn)行發(fā)光觀察而加入D-突光素(Promega社制造最終濃度100 μ M),使用發(fā)光顯微鏡LV200(奧林巴斯株式會社制造)觀察了小鼠ES細(xì)胞。為了將具有不同的波長特性的2種熒光素酶分光，使用BP515-560 (Sigma)、6IOALP (Sigma)這兩種分光濾波器，對各波長進(jìn)行拍攝。轉(zhuǎn)染48小時后，使用LV200進(jìn)行觀察。緑色和紅色的多色檢測使用上述分光濾波器進(jìn)行。觀察條件如下所述。觀察裝置LV200(奧林巴斯)物鏡10倍(NA O. 45) CCD照相機(jī)ImagEM(Hamamatsu Photonicsノ露出時間濾波器515-5603分鐘濾波器610ALP 3分鐘EM gain :1200觀察用培養(yǎng)基小鼠ES細(xì)胞用培養(yǎng)基+25mM HEPES、500 μ M D-熒光素(Wako)將轉(zhuǎn)染48小時后的拍攝結(jié)果示于圖14。圖14的(A)表示明視野圖像，圖14的(B)表示使用了濾波器ΒΡ515-560的發(fā)光圖像I (Nanog表達(dá))，圖14的(C)表示使用了濾波器610ALP的發(fā)光圖像2 (Nestin表達(dá))，圖14的⑶表示發(fā)光圖像I與2的疊加圖像。各觀察中的露出時間為3分鐘，能夠進(jìn)行每ー個集落的發(fā)光檢測。由于加入LIF進(jìn)行培養(yǎng)，因而認(rèn)為能夠維持未分化狀態(tài)，但發(fā)現(xiàn)了略微的Nestin的表達(dá)。這樣，根據(jù)本實(shí)施例可知對于各個集落，能夠連續(xù)地對從未分化狀態(tài)至分化后的狀態(tài)進(jìn)行監(jiān)控。特別是，在ー個集落內(nèi)，能夠同時監(jiān)控混雜有未分化狀態(tài)和分化后的狀態(tài)兩者的集落內(nèi)各基因的表達(dá)。另外，對于多個集落，也能夠同時監(jiān)控未分化狀態(tài)的集落和分化后的集落。本發(fā)明的方法能夠同時監(jiān)控不同的狀態(tài)，該方法能夠在再生醫(yī)療的領(lǐng)域中提供ー種新型的應(yīng)用，該應(yīng)用克服了如熒光觀察那樣不同的激發(fā)光彼此所產(chǎn)生的串?dāng)_的問題。實(shí)施例2-2 :分化誘導(dǎo)后的ES細(xì)胞的觀察和分析在分化誘導(dǎo)ES細(xì)胞的情況下，通常在浮游培養(yǎng)系統(tǒng)中形成擬胚體(EmbryoidBody EB)。已知懸滴法等多種制作方法，本研究中，使用在培養(yǎng)面涂覆了特殊磷脂質(zhì)聚合物的EZBindShut (IffAKI)來形成擬胚體，對進(jìn)行了分化的擬胚體中Nestin基因表達(dá)如何變化進(jìn)行了檢測。擬胚體(EB)的制備如下進(jìn)行。(I)準(zhǔn)備直徑為35mm的一個培養(yǎng)皿量的鋪滿(confluent)狀態(tài)的小鼠ES細(xì)胞。(2)用PBS清洗I次后，進(jìn)行胰蛋白酶處理。
(3)調(diào)整細(xì)胞數(shù)，使其最終為200 u L/孔(1000細(xì)胞/孔)，通過核轉(zhuǎn)染進(jìn)行基因?qū)搿?4)將細(xì)胞接種到加入了 15%KSR(Knockout Serum(Gibco))的 DMEM 中，加入到低粘接性 U 底微孔板(EZ BindShut, AGC ASAHI TECHNO GLASS CORPORATION)。(5)在細(xì)胞用培養(yǎng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)開始日作為擬胚體(EB)形成第0天。將擬胚體(EB)形成的狀況示意性地示于圖15。(6)在進(jìn)行發(fā)光觀察時，使用微量移液管回收擬胚體，轉(zhuǎn)移到含有加入了 D-熒光素(Promega、最終濃度500iiM)的發(fā)光觀察用培養(yǎng)基的35mm培養(yǎng)皿中，所述培養(yǎng)基是加入了 HEPES 的 DMEM(15%KSR、去除酚紅)。(7)使用LUMIN0VIEW(LV200，奧林巴斯)進(jìn)行發(fā)光觀察。觀察條件如下所述。觀察裝置LV200(奧林巴斯)物鏡10X倍(NA 0. 45) CCD照相機(jī)ImagEM(Hamamatsu Photonics； EM gain :1200觀察用培養(yǎng)基小鼠EB細(xì)胞用培養(yǎng)基+25mM HEPES、500 u M D-熒光素(Promega)對在擬胚體(EB)形成后第2天和第12天拍攝的觀察圖像進(jìn)行保存，使用圖像分析系統(tǒng)“AQUAC0SM0S (Hamamatsu Photonics株式會社制造)”由該觀察圖像進(jìn)行數(shù)值數(shù)據(jù)分析。以每個分光濾波器得到的發(fā)光強(qiáng)度為基礎(chǔ)，利用在現(xiàn)有的熒光觀察中使用的計算方法計算出來自各熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度，調(diào)查各標(biāo)記物的基因表達(dá)強(qiáng)度、表達(dá)比。將擬胚體(EB)形成后第2天和第12天的觀察圖像示于圖16。圖16的上層為擬胚體(EB)形成后第2天的圖像，從左起依次表示明視野圖像、使用了濾波器BP515-560的發(fā)光圖像I (Nanog表達(dá))、使用了濾波器610ALP的發(fā)光圖像2 (Nestin表達(dá))和發(fā)光圖像I與2的疊加圖像。圖12的下層為擬胚體(EB)形成后第12天的圖像，從左起依次表示明視野圖像、使用了濾波器BP515-560的發(fā)光圖像3(Nanog表達(dá))、使用了濾波器610ALP的發(fā)光圖像4 (Nestin表達(dá))、發(fā)光圖像3與4的疊加圖像。以下示出分析結(jié)果。擬胚體中的發(fā)光強(qiáng)度(平均值信號-背景數(shù)值)EB 形成轉(zhuǎn)染第 2 天 Eluc :3394 CBR 1062 Eluc/CBR=3. 19EB 形成轉(zhuǎn)染第 12 天 Eluc :105 CBR :3726 Eluc/CBR=0. 03對EB形成后第2天和第12天的Nanog和Nestin表達(dá)量進(jìn)行了比較，結(jié)果在第2天ELuc表達(dá)高、Nanog表達(dá)具有優(yōu)勢(Eluc/CBR=3. 19)。在EB形成后第12天,Nanog表達(dá)變低，Nestin表達(dá)上升(Eluc/CBR=0. 03)?？芍S著時間經(jīng)過進(jìn)行分化誘導(dǎo)，Nanog表達(dá)減少，Nestin表達(dá)增加。本研究中比較了分化誘導(dǎo)后第2天和第12天的擬胚體觀察結(jié)果。只要是帶有細(xì)胞培養(yǎng)功能的顯微鏡，均能夠進(jìn)行顯微鏡下的連續(xù)觀察。若長時間的觀察困難，也可以分成連續(xù)觀察分化誘導(dǎo)的初期、中期、后期來進(jìn)行觀察。本研究中進(jìn)行了暫時性的基因表達(dá)，因而也可以使用基因?qū)牒蟮姆€(wěn)定株細(xì)胞來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中，不僅為發(fā)光，通過組合明視野觀察，從而能夠得到分化為神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞時的形態(tài)變化，得到無法觀察到標(biāo)記基因的表達(dá)的時刻的形態(tài)信息，能夠進(jìn)行更聞精度的實(shí)驗(yàn)。這些結(jié)果表明在進(jìn)行分化誘導(dǎo)的狀態(tài)下存在具有多種性質(zhì)的干細(xì)胞或來自干細(xì)胞的分化細(xì)胞，需要從其中選擇實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)集落。通過以發(fā)光為指標(biāo)進(jìn)行拍攝，以圖像信息的形式獲得基因表達(dá)量，從而能夠針對各干細(xì)胞對在細(xì)胞的形態(tài)變化中無法確定的細(xì)胞分化的程度進(jìn)行監(jiān)控。
在上述說明中，為了作為圖像處理所需要的區(qū)域(ROI)選擇集落或干細(xì)胞，可以在PC附帯或另外的顯示器上顯示發(fā)光圖像和明視野圖像的疊加圖像，也可以僅顯示發(fā)光圖像。在作為各干細(xì)胞或干細(xì)胞所屬的各集落的形態(tài)信息的各輪廓信息、或者集落內(nèi)的干細(xì)胞的分布等位置信息為必要的情況下，明視野圖像優(yōu)選與發(fā)光圖像合用。若限定于得到輪廓和/或位置的信息的目的，可以將通過進(jìn)行熒光觀察所得到的熒光圖像來代替明視野圖像與發(fā)光圖像疊加，或者，也可以對疊加了明視野圖像與熒光圖像兩者的形態(tài)性的圖像進(jìn)ー步疊加表示基因表達(dá)量的發(fā)光圖像。
權(quán)利要求
1.一種監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法，其特征在于，其包括以下エ序 (A-I)對導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與發(fā)光蛋白基因的融合基因的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的エ序； (A-2)對于所述(A-I)的エ序后的干細(xì)胞，在誘導(dǎo)分化的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；和(A-3)在所述(A-I) (A-2)的エ序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由發(fā)光蛋白基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的エ序。
2.一種監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法，其特征在于，其包括以下エ序 (B-I)對導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與發(fā)光蛋白基因的融合基因的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的エ序； (B-2)進(jìn)ー步對干細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)的エ序； (B-3)對于所述(B-2)的エ序后的干細(xì)胞，在誘導(dǎo)分化的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的エ序；和(B-4)在所述(B-I) (B-3)的エ序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由發(fā)光蛋白基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的エ序。
3.—種監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法，其特征在于，其包括以下エ序 (C-I)對導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與發(fā)光蛋白基因的融合基因的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的エ序； (C-2)進(jìn)ー步對干細(xì)胞進(jìn)行繼代培養(yǎng)的エ序；和 (C-3)在所述(C-I) (C-2)的エ序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由發(fā)光蛋白基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的エ序。
4.如權(quán)利要求I 3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于， 所述拍攝エ序是通過發(fā)光成像系統(tǒng)持續(xù)拍攝兩個以上的發(fā)光圖像的エ序。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，其還包括以下エ序 在通過所述拍攝エ序得到的發(fā)光圖像的特定細(xì)胞區(qū)域，作為分化狀態(tài)的指標(biāo)，測定發(fā)光量，分析發(fā)光量的經(jīng)時變化。
6.如權(quán)利要求I 5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，其還包括以下エ序 為獲得干細(xì)胞或干細(xì)胞所屬的集落的輪廓和/或位置的信息進(jìn)行明視野觀察和/或熒光觀察，在與發(fā)光圖像相同的區(qū)域獲得明視野圖像和/或熒光圖像。
7.如權(quán)利要求I 6中任一項(xiàng)所述的方法,其特征在于， 分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因是細(xì)胞在未分化的狀態(tài)下特異表達(dá)的未分化標(biāo)記基因和/或細(xì)胞在特定的分化過程中特異表達(dá)的分化標(biāo)記基因。
8.如權(quán)利要求I 7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于， 干細(xì)胞是導(dǎo)入了兩種以上的融合基因的干細(xì)胞， 融合基因分別包含不同種類的分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域， 分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域分別與編碼具有不同的發(fā)光波長的發(fā)光蛋白的基因融合，使得其與其他分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域相區(qū)別地被檢測出。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在干， 干細(xì)胞是導(dǎo)入了兩種融合基因的干細(xì)胞， ー種融合基因是未分化標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與第一發(fā)光蛋白基因的融合基因， 另ー種融合基因是在特定的分化過程中特異表達(dá)的分化標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與第ニ種發(fā)光蛋白基因的融合基因，所述第二種發(fā)光蛋白基因的表達(dá)與所述第一發(fā)光蛋白基因的表達(dá)相區(qū)別地被檢測出。
10.一種確定干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法，其特征在于，其包括以下エ序 基于利用權(quán)利要求I 9中任一項(xiàng)所述的方法得到的發(fā)光圖像和/或發(fā)光量數(shù)據(jù)和/或明視野圖像，確定干細(xì)胞的分化狀態(tài)。
11.ー種獲得顯示所期望的分化狀態(tài)的干細(xì)胞的方法，其特征在于，其包括以下エ序 基于利用權(quán)利要求6所述的方法得到的發(fā)光圖像和/或發(fā)光量數(shù)據(jù)和/或明視野圖像，由多個干細(xì)胞中獲得顯示所期望的分化狀態(tài)的干細(xì)胞。
12.如權(quán)利要求I 11中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述發(fā)光圖像表示集落內(nèi)的各個干細(xì)胞的基因表達(dá)量。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述集落形成了擬胚體。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種監(jiān)控干細(xì)胞的分化狀態(tài)的方法，其特征在于，其包括以下工序(A-1)對導(dǎo)入有分化狀態(tài)檢測標(biāo)記基因的啟動子區(qū)域與發(fā)光蛋白基因的融合基因的干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)的工序；(A-2)對于所述(A-1)的工序后的干細(xì)胞，在誘導(dǎo)分化的條件下進(jìn)行培養(yǎng)的工序；(A-3)在所述(A-1)～(A-2)的工序的至少一定期間，對干細(xì)胞中由發(fā)光蛋白基因的表達(dá)所產(chǎn)生的發(fā)光圖像進(jìn)行拍攝的工序。
文檔編號C12Q1/66GK102822333SQ20118001498
公開日2012年12月12日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月23日
發(fā)明者大橋陽子 申請人:奧林巴斯株式會社