專利名稱：擬南芥熱激蛋白基因hsp101在種子萌發(fā)和保藏中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于種子生理和植物基因工程領(lǐng)域。具體地，涉及擬南芥基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hot I在改變種子保藏、種子萌發(fā)特性中的應(yīng)用，同時(shí)還涉及該基因T-DNA插入突變株hotl在改變種子萌發(fā)和保藏方面的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，以及在培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長(zhǎng) 素(IAA)的種子中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
種子的保藏是植物種質(zhì)資源保存的重要手段，其對(duì)生物多樣性的保護(hù)、對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上已收集的植物種質(zhì)資源有610萬(wàn)份，其中90%是以種子形式保存在低溫種質(zhì)庫(kù)中的，我國(guó)長(zhǎng)期貯存的種質(zhì)數(shù)量已達(dá)34萬(wàn)份，居世界首位。但是種質(zhì)低溫保存也存在很多問(wèn)題，其中對(duì)種質(zhì)遺傳完整性影響最大的就是種子老化問(wèn)題，表現(xiàn)為發(fā)芽率降低。種子在自然儲(chǔ)藏中發(fā)芽力也會(huì)逐漸喪失，這就是自然老化(Machado Neto,Custodio et al.2001)。自然老化歷時(shí)較長(zhǎng)，在品種改良中進(jìn)行種質(zhì)篩選時(shí)難以應(yīng)用；人工老化則可克服常溫下自然老化所需時(shí)間較長(zhǎng)的不足，而被廣泛應(yīng)用于種子耐貯性的研究，人工老化常采用高溫高濕的方法。種子老化的過(guò)程中會(huì)發(fā)生一系列的生理生化及遺傳變化，包括質(zhì)膜傷害、物質(zhì)能量代謝的變化、有機(jī)物質(zhì)含量及種類的變化和遺傳結(jié)構(gòu)的變化(Galleschi,Capocchi et al. 2002 ；Andreev,Spiridonova et al. 2004 ；Freitas,Dias etal. 2006)。因此，進(jìn)行種子老化的相關(guān)研究，揭示種子老化機(jī)理并進(jìn)一步找出相關(guān)應(yīng)對(duì)策略，對(duì)于種質(zhì)資源保存具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。種子是農(nóng)林、園藝生產(chǎn)中的重要生產(chǎn)資料，其萌發(fā)直接影響農(nóng)林園藝的生產(chǎn)。人們?yōu)椴シN獲得齊苗狀苗而設(shè)法使種胚打破休眠迅速整齊恢復(fù)生長(zhǎng)，為豐產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。種子的萌發(fā)受環(huán)境因素(如光、溫度和濕度等)和內(nèi)部因素(如基因、激素、糖、含氮化合物、種皮的顏色和結(jié)構(gòu)等)的協(xié)同調(diào)控(Bewley 1997)。激素調(diào)控方面，赤霉素(GA3)、生長(zhǎng)素(IAA)和脫落酸(ABA)是調(diào)控種子休眠和萌發(fā)的主要植物激素。ABA抑制萌發(fā)，誘導(dǎo)休眠，赤霉素和生長(zhǎng)素促進(jìn)萌發(fā)，是拮抗ABA的主要因子，為種子萌發(fā)所必需(Flores，Jurado etal. 2006 ；Rizza, Boccaccini et al. 2010)。目前，由休眠到萌發(fā)的“開(kāi)關(guān)”機(jī)制尚未明確，尤其是對(duì)種子萌發(fā)調(diào)控相關(guān)基因的研究方面。熱激蛋白質(zhì)Heat Shock Protein(HSP)廣泛存在于植物細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、葉綠體、線粒體等組織中(Zhang, Wang et al. 2007),是一組結(jié)構(gòu)保守的蛋白質(zhì),依其分子量大小與序列的同源性，可分為 small HSPs (sHSPs)、HSP60、HSP70、HSP90 與 HSPlOO 等五類(Papp，Nardai et al. 2003)。它們的主要功能有(I)防止受熱變性的蛋白質(zhì)聚集；(2)將已聚集的變性蛋白質(zhì)分開(kāi)；(3)輔助變性的蛋白質(zhì)折疊回其原有的構(gòu)形；(4)協(xié)助分解已變形的蛋白質(zhì)(Suk-Whan and Elizabeth 2001)。大部分的熱激蛋白質(zhì)在演化上是高度保守的。以反義抑制方式，阻止擬南芥HSP101的表達(dá)，會(huì)使突變株喪失獲得性耐熱性，突變株在經(jīng)38°C，90分鐘的前處理下仍然無(wú)法在45°C的環(huán)境生存(Gurley 2000 ;Suk-Whan and Elizabeth2001)。熱激蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子除了在熱激下起作用外，還和其它多種非生物脅迫有關(guān)，如干旱，高鹽和低溫脅 迫 等(Kotak, Larkindale et al. 2007)。番爺sHSP可被低溫誘導(dǎo)，HSP21被發(fā)現(xiàn)包含在抗氧化途徑中，At HSP17.6則可被滲透壓所誘導(dǎo)。在種子萌發(fā)，特別是早期，基因轉(zhuǎn)錄活躍，蛋白質(zhì)大量合成，細(xì)胞的增殖和分化非常劇烈，細(xì)胞的環(huán)境在不斷變化，細(xì)胞對(duì)外界刺激十分敏感。這個(gè)時(shí)期的HSPs變化和作用表現(xiàn)得非常突出(Hsu，Laiet al.2010)。目前，現(xiàn)有技術(shù)中未見(jiàn)擬南芥基因HSPlOl缺失及該基因的T-DNA插入突變株hotl能夠改變種子保藏、種子萌發(fā)特性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hotl在種子萌發(fā)、保藏和農(nóng)作物生產(chǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的目的還在于提供一種擬南芥基因HSPlOl及其T-DNA插入突變株hotl在培育具有提高種子萌發(fā)和保藏方面的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，以及培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長(zhǎng)素(IAA)的種子中的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子萌發(fā)中的應(yīng)用。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子儲(chǔ)藏中的應(yīng)用。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長(zhǎng)素IAA的種子中的應(yīng)用。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子具有更高的萌發(fā)勢(shì)。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子對(duì)人工老化敏感，在自然保存過(guò)程中不耐儲(chǔ)藏。擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子中內(nèi)源激素脫落酸ABA降低，赤霉素GA3升高，生長(zhǎng)素IAA升高，有利于萌發(fā)。擬南芥基因HSPlOl的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥基因HSP101的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子儲(chǔ)藏的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。擬南芥HSP101的T-DNA插入突變株hotl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長(zhǎng)素IAA的種子中的應(yīng)用。本發(fā)明所述的基因HSPIOI在GenBank中的編號(hào)是AT 1G74310，該基因的CDS長(zhǎng)2736bp，編碼911個(gè)氨基酸，其核苷酸序列和氨基酸序列如表I所示。利用從擬南芥生物資源中心 ABRC (Arabidopsis Biological Resource Center)獲得的 HSPlOl 基因 T-DNA 插入的擬南芥突變體hotl作為研究對(duì)象，突變體株系的種子編號(hào)為SALK_066374，突變體hotl源于載體PR0K2上的一段T-DNA插入基因HSP101的外顯子中，導(dǎo)致基因突變，插入位點(diǎn)處的側(cè)翼序列如表2所示。本發(fā)明在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白基因HSP101功能與種子的萌發(fā)和老化有關(guān)，該基因缺失可使得擬南芥種子具有更高的萌發(fā)勢(shì)，但對(duì)人工老化敏感，在自然保存過(guò)程中不耐儲(chǔ)藏，同時(shí)內(nèi)源激素脫落酸(ABA)降低，赤霉素(GA3)升高，生長(zhǎng)素(IAA)升高，有利于萌發(fā)。因此本發(fā)明發(fā)現(xiàn)操作基因HSP101能夠改變種子保藏和萌發(fā)特性，在種質(zhì)資源保存和農(nóng)作物生產(chǎn)中有很好的應(yīng)用前景。


圖I 為 Western Blot 鑒定；圖2為PCR試驗(yàn)，圖2A為PCR引物設(shè)計(jì)示意圖；圖2B為電泳結(jié)果理論預(yù)期示意圖； 圖3為PCR鑒定電泳結(jié)果；圖4為擬南芥種子萌發(fā)勢(shì)；圖5為擬南芥種子自然老化，圖5A為擬南芥種子自然老化兩年；圖5B為擬南芥種子自然老化兩年萌發(fā)率；圖6為擬南芥種子人工老化；圖7為擬南芥種子內(nèi)源激素含量；圖7A為種子內(nèi)源GA3含量；圖7B為種子內(nèi)源IAA含量；圖7C為種子內(nèi)源ABA含量。實(shí)施例I :突變株的獲得本發(fā)明所述擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在GenBank中的編號(hào)是AT1G74310，該基因的CDS長(zhǎng)2736bp，核苷酸序列如序列表所示(表I)，編碼911個(gè)氨基酸，氨基酸序列如序列表所示(表I)。從美國(guó)擬南芥生物資源中心Arabidopsis Biological ResourceCenter (ABRC)購(gòu)買(mǎi)了此基因的T-DNA插入株系種子(SALK_066374)，突變株名稱為hotl，其插入位點(diǎn)側(cè)翼序列如表2。表1HSP101的⑶S序列和氨基酸序列I ATGAATCCAGAGAAATTCACACACAAGACAAACGAGACAATTGCTACAGCTCATGAGCTAI METAsnProGluLysPheThrHisLysThrAsnGluThrIIeAlaThrAlaHisGluLeu61 GCTGTGAATGCAGGACATGCTCAATTCACTCCTTTGCATTTAGCTGGTGCTTTGATCTCT21 AlaValAsnAlaGlyHisAlaGlnPheThrProLeuHisLeuAlaGlyAlaLeuIIeSer121GATCCCACCGGTATATTTCCTCAAGCAATCTCTAGTGCCGGTGGCGAGAACGCAGCTCAA41 AspProThrGlyIIePheProGlnAlaIIeSerSerAlaGlyGlyGluAsnAlaAlaGln181TCTGCTGAAAGAGTGATCAATCAAGCCTTGAAGAAGCTTCCTTCACAATCTCCTCCACCT61 SerAlaGluArgValIleAsnGlnAlaLeuLysLysLeuProSerGlnSerProProPro241GATGATATTCCAGCGAGTTCTAGTCTTATTAAGGTCATTCGTCGTGCTCAAGCTGCTCAG81 AspAspIleProAlaSerSerSerLeuIIeLysValIIeArgArgAlaGlnAlaAlaGln301AAGTCACGAGGTGATACTCATTTGGCTGTTGACCAGTTGATTATGGGTCTTCTTGAAGAT10ILysSerArgGlyAspThrHisLeuAlaValAspGlnLeuIIeMETGlyLeuLeuGluAsp
、
361TCTCAAATCAGGGATTTGTTGAACGAAGTCGGTGTAGCGACGGCGAGGGTAAAGTCTGAG12ISerGlnIIeArgAspLeuLeuAsnGluValGlyValAlaThrAlaArgValLysSerGlu421 GTTGAGAAGCTTCGTGGGAAAGAAGGGAAGAAAGTTGAGAGTGCTTCAGGGGACACAAAT141 ValGluLysLeuArgGlyLysGluGlyLysLysValGluSerAlaSerGlyAspThrAsn481 TTTCAAGCTTTAAAGACTTATGGAAGAGATTTGGTTGAGCAAGCAGGGAAGCTTGATCCT161 PheGlnAlaLeuLysThrTyrGlyArgAspLeuValGluGlnAlaGlyLysLeuAspPro
54I GTGATTGGTCGTGATGAGGAGATTAGAAGAGTCGTGAGGATTCTTTCGAGGAGAACGAAG181 ValIIeGlyArgAspGluGluIIeArgArgValValArgIIeLeuSerArgArgThrLys60I AACAATCCTGTGCTATTGGAGAGCCAGGAGTTGGTAAAACAGCTGTGGTTGAAGGTTTA201 AsnAsnProValLeuIleGlyGluProGlyValGlyLysThrAlaValValGluGlyLeu66I GCACAAAGGATTGTGAAAGGAGATGTGCCCAACAGTCTTACTGATGTGAGATTAATTTCG221 AlaGlnArgIleValLysGlyAspValProAsnSerLeuThrAspValArgLeuIIeSer721 TTGGACATGGGTGCGTTAGTTGCTGGTGCTAAATACCGAGGAGAGTTTGAAGAAAGGTTG241 LeuAspMETGlyAlaLeuValAlaGlyAlaLysTyrArgGlyGluPheGluGluArgLeu 78I AAATCTGTTTTGAAAGAAGTTGAGGACGCTGAAGGCAAAGTGATTCTCTTTATTGATGAG261 LysSerValLeuLysGluValGluAspAlaGluGlyLysValIIeLeuPheIIeAspGlu84I ATTCATTTGGTTCTTGGTGCTGGCAAAACTGAAGGGTCGATGGATGCAGCTAATCTGTTC281 IleHisLeuValLeuGlyAlaGlyLysThrGluGlySerMETAspAlaAlaAsnLeuPhe90I AAGCCCATGTTAGCTAGAGGGCAGCTTCGATGCATTGGTGCTACAACGCTTGAAGAATAC301 LysProMETLeuAlaArgGlyGlnLeuArgCysIIeGlyAlaThrThrLeuGluGluTyr96I AGGAAATATGTTGAGAAAGATGCTGCCTTTGAGAGGAGGTTCCAACAAGTCTATGTTGCG321 ArgLysTyrValGluLysAspAlaAlaPheGluArgArgPheGlnGlnValTyrValAla1021GAGCCAAGTGTGCCTGACACCATTAGTATCCTTAGAGGACTCAAGGAGAAGTATGAGGGA341 GluProSerValProAspThrIIeSerIIeLeuArgGlyLeuLysGluLysTyrGluGly1081CATCATGGTGTGCGAATCCAAGACAGAGCTCTTATAAATGCTGCTCAGCTGTCTGCTCGT361 HisHisGlyValArgIIeGlnAspArgAlaLeuIIeAsnAlaAlaGlnLeuSerAlaArg1141TACATAACTGGTCGGCATTTACCGGATAAAGCAATTGATTTGGTTGATGAGGCTTGTGCG381 TyrlleThrGlyArgHisLeuProAspLysAlalleAspLeuValAspGluAlaCysAlaI201AATGTGAGAGTCCAGCTTGATAGTCAACCTGAAGAGATTGATAACCTTGAAAGGAAGAGG401 AsnValArgValGlnLeuAspSerGlnProGluGluIIeAspAsnLeuGluArgLysArg126IATGCAGCTGGAAATTGAACTTCACGCCTTGGAAAGGGAGAAGGATAAAGCCAGCAAAGCT421 METGlnLeuGlulleGluLeuHisAlaLeuGluArgGluLysAspLysAlaSerLysAla1321CGACTTATAGAGGTGCGGAAAGAGCTTGATGACCTGAGAGACAAGCTTCAGCCTCTCACG441 ArgLeuIIeGluValArgLysGluLeuAspAspLeuArgAspLysLeuGlnProLeuThr1381ATGAAATACAGAAAGGAGAAAGAGAGAATTGATGAGATTCGAAGGCTTAAACAGAAAAGA461 METLysTyrArgLysGluLysGluArglleAspGluIleArgArgLeuLysGlnLysArg1441GAAGAGCTCATGTTTTCTTTGCAGGAGGCAGAACGAAGATATGACCTTGCAAGAGCTGCT481 GluGluLeuMETPheSerLeuGlnGluAlaGluArgArgTyrAspLeuAlaArgAlaAlaI501GATCTAAGATATGGCGCAATTCAAGAAGTGGAATCTGCAATTGCCCAACTTGAAGGAACT501 AspLeuArgTyrGlyAlaIleGlnGluValGluSerAlalIeAlaGlnLeuGluGlyThr1561TCTTCTGAAGAGAATGTGATGCTCACAGAAAACGTTGGGCCTGAACACATTGCTGAGGTT521 SerSerGluGluAsnValMETLeuThrGluAsnValGlyProGluHisiIeAlaGluVal1621GTGAGCCGTTGGACAGGGATTCCAGTGACGAGACTTGGCCAAAATGAGAAGGAGAGGTTG541 ValSerArgTrpThrGlyIIeProValThrArgLeuGlyGlnAsnGluLysGluArgLeu1681ATTGGTCTTGCTGATAGGTTGCATAAGCGGGTTGTGGGACAGAATCAAGCGGTAAATGCA
561 IIeGlyLeuAlaAspArgLeuHisLysArgValValGlyGlnAsnGlnAlaValAsnAla1741GTTTCTGAGGCAATTCTAAGGTCAAGGGCAGGACTTGGAAGGCCACAACAGCCAACTGGA581 ValSerGluAlaIIeLeuArgSerArgAlaGlyLeuGlyArgProGlnGlnProThrGly1801TCATTCTTATTCCTTGGACCAACTGGTGTTGGCAAAACTGAGCTCGCCAAGGCTCTTGCT601 SerPheLeuPheLeuGlyProThrGlyValGlyLysThrGluLeuAlaLysAlaLeuAla
1861GAGCAGCTGTTTGATGATGAAAACCTCTTAGTTCGGATTGATATGTCGGAATATATGGAA621 GluGlnLeuPheAspAspGluAsnLeuLeuValArgIIeAspMETSerGluTyrMETGlu1921CAACACTCTGTCTCTCGCCTCATTGGGGCACCACCAGGGTATGTTGGTCACGAGGAAGGT641 GlnHisSerValSerArgLeuIIeGlyAlaProProGlyTyrValGlyHisGluGluGly1981GGACAACTAACTGAGGCTGTGAGGAGGCGACCTTATTGTGTCATACTCTTTGATGAAGTG661 GlyGlnLeuThrGluAlaValArgArgArgProTyrCysValIleLeuPheAspGluVal2041GAGAAGGCTCATGTTGCTGTCTTCAACACTCTGCTCCAAGTTTTGGATGATGGTCGATTG681 GluLysAlaHisValAlaValPheAsnThrLeuLeuGlnValLeuAspAspGlyArgLeu2101ACAGACGGGCAAGGCAGGACAGTCGATTTCAGGAACTCGGTGATAATCATGACATCAAAC701 ThrAspGlyGlnGlyArgThrValAspPheArgAsnSerValIIeIIeMETThrSerAsn2161CTTGGTGCTGAACACCTCCTTGCAGGGCTAACTGGGAAAGTAACAATGGAAGTGGCCCGG721 LeuGlyAlaGluHisLeuLeuAlaGlyLeuThrGlyLysValThrMETGluValAlaArg2221GACTGTGTGATGCGGGAGGTGAGGAAACACTTCAGACCAGAGCTCTTGAACAGGCTTGAC741 AspCysValMETArgGluValArgLysHisPheArgProGluLeuLeuAsnArgLeuAsp2281GAGATTGTGGTGTTCGACCCCCTTTCACATGACCAGTTGAGGAAAGTAGCTCGGCTTCAA761 GluIleValValPheAspProLeuSerHisAspGlnLeuArgLysValAlaArgLeuGln2341ATGAAAGACGTTGCTGTCCGGCTTGCTGAAAGAGGAGTTGCTTTGGCAGTCACTGATGCT781 METLysAspValAlaValArgLeuAlaGluArgGlyValAlaLeuAlaValThrAspAla2401GCTTTGGACTATATCTTGGCAGAGAGTTATGACCCGGTGTATGGTGCTAGGCCTATAAGG801 AlaLeuAspTyrIleLeuAlaGluSerTyrAspProValTyrGlyAlaArgProIIeArg2461AGATGGATGGAGAAGAAGGTGGTGACAGAACTGTCAAAGATGGTTGTGCGTGAGGAAATC821 ArgTrpMETGluLysLysValValThrGluLeuSerLysMETValValArgGluGluIIe2521GATGAAAACTCCACTGTTTACATAGATGCAGGCGCTGGTGATCTTGTGTACCGGGTAGAA841 AspGluAsnSerThrValTyrIIeAspAlaGlyAlaGlyAspLeuValTyrArgValGlu2581AGTGGAGGTCTAGTGGACGCTTCAACAGGCAAGAAGTCAGATGTGCTGATTCATATTGCT861 SerGlyGlyLeuValAspAlaSerThrGlyLysLysSerAspValLeuIIeHisiIeAla264IAACGGGCCAAAGAGAAGTGATGCAGCTCAGGCGGTGAAGAAGATGAGGATCGAGGAAATA881 AsnGlyProLysArgSerAspAlaAlaGlnAlaValLysLysMETArgIIeGluGluIIe2701GAAGATGACGATAATGAGGAAATGATCGAGGATTAA901 GluAspAspAspAsnGluGluMETIleGluAsp * 女 *表2插入位點(diǎn)側(cè)翼序列IATCTC TGATC CCACC GGTAT ATTTC CTCAA GCAAT CTCTA GTGCC GGTGG5ICGAGA ACGCA GCTCA ATCTG CTGAA AGAGT GATCA ATCAA GCCTT GAAGA10IAGCT (Length :104)
實(shí)施例2
突變株的檢驗(yàn)和純合子鑒定Western Blot鑒定野生型Col和突變體hotl種子提取總蛋白，用Western Blot檢測(cè)蛋白HSPlOl的表達(dá)。結(jié)果如圖I所示，野生型種子中hsplOl基因正常表達(dá)，出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，能檢測(cè)到HSPlOl蛋白；而突變體hotl，出現(xiàn)陰性結(jié)果，不能檢測(cè)到HSPlOl蛋白，說(shuō)明突變體hotl中該基因確實(shí)被敲除了，不能表達(dá)。PCR鑒定純合子=T-DNA插入株系基因型的鑒定需要三條引物，分別是LP(5’_AATAAT GCG GCA AAA GAG GAG-3’)，位于基因組上T-DNA插入位點(diǎn)左臂端處；RP(5’ -CTG CTTGCT CAA AAT CTC-3 ’)，位于T-DNA插入位點(diǎn)右臂端處；T-DNA左臂端上引物BP :LBb3 :(5，-ATTTTGCCGATTTCGGAAC-3). PCR 引物設(shè)計(jì)參照 SIGNA(http://signal, salk. edu/tdnaprimers. 2. html)相關(guān)資料.PCR原理如圖2所不。研磨提取野生型Col和突變體hotl葉片基因組DNA做為模板進(jìn)行PCR。如圖3所示，當(dāng)用LP和RP這對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行電泳時(shí)，在野生型植株Col中產(chǎn)生一條PCR產(chǎn)物帶，分子量大約是IlOObp，而突變體hotl植株中沒(méi)有PCR產(chǎn)物形成；當(dāng)用RP和LBb3這對(duì)引物PCR擴(kuò)增時(shí)，在野生型植株中沒(méi)有PCR產(chǎn)物，而在突變體hotl植株中有一條PCR產(chǎn)物帶。因此鑒定突變體hotl植株為純合子homozygote (HM)。實(shí)施例3:擬南芥中hsplOl基因敲除后具有更高的萌發(fā)勢(shì)野生型Col和突變體hotl種子置于培養(yǎng)皿中25°C光照萌發(fā)，按標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)方法進(jìn)行，每個(gè)處理設(shè)四個(gè)重復(fù)，以胚根長(zhǎng)度與種子等長(zhǎng)，胚芽長(zhǎng)度達(dá)到種子一半時(shí)為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，6天計(jì)算萌發(fā)率。如圖4所示，野生型Col種子在24h、48h萌發(fā)率低于突變體hotl，突變體hotl種子具有更高的萌發(fā)勢(shì)。實(shí)施例4:擬南芥中hsplOl基因被敲除后自然儲(chǔ)藏中活力喪失更快種子在自然儲(chǔ)藏或種質(zhì)庫(kù)保存的條件下，其發(fā)芽力會(huì)逐漸喪失，發(fā)生自然老化。本實(shí)驗(yàn)取2009年8月收的野生型Col和突變體hotl種子貯存在室溫下，2011年9月取貯存了兩年的種子進(jìn)行萌發(fā)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)活力。置于培養(yǎng)皿中25°C光照發(fā)芽，培養(yǎng)皿中用濾紙保濕。按標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)方法進(jìn)行，15天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。如圖5所示，經(jīng)過(guò)兩年的自然老化野生型Col和突變體hotl種子萌發(fā)率都有不同程度的下降，野生型Col萌發(fā)率還能達(dá)到85%，而突變體hotl種子萌發(fā)率卻降到了 60%，擬南芥中hsplOl基因被敲除后自然老化過(guò)程中活力喪失更快，更不耐儲(chǔ)存。實(shí)施例5:擬南芥中hsplOl基因被敲除后在人工老化過(guò)程中更加敏感將野生型Col和突變體hotl種子放在溫度為45°C，相對(duì)濕度100%的環(huán)境中，處理時(shí)間0h、12h、24h、48h、72h。處理完畢取出種子，置于用濾紙保濕的培養(yǎng)皿中25°C光照發(fā)芽。按標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗(yàn)方法進(jìn)行，15天統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。如圖6所示，隨著高溫高濕老化處理時(shí)間的延長(zhǎng)，野生型Col和突變體hotl種子均呈下降趨勢(shì)；突變體hotl種子更加敏感，活力下降得更快，老化處理24h開(kāi)始，隨著老化時(shí)間的延長(zhǎng)而發(fā)芽勢(shì)迅速下降。48h時(shí)萌發(fā)率幾乎為0%。
實(shí)施例6 野生型Col和突變體hotl種子中內(nèi)源激素檢測(cè)一、樣品的提取稱取O. 2g野生型Col和突變體hotl種子加入2ml樣品提取液80%的甲醇，在冰浴中研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入IOml試管，再用2ml提取液分次將研缽沖洗干凈，一并轉(zhuǎn)入試管中，搖勻后放置在4°C冰箱中。4°C提取4h，3500轉(zhuǎn)/min離心8min，取上清液。沉淀中加入Iml提取液，攪勻，置4°C下再提取lh，離心，合并上清液并記錄體積，殘?jiān)Q干重。將上清液轉(zhuǎn)入15ml玻璃離心管中，用氮?dú)獯蹈?，除去提取液中的甲醇，用樣品液定容。二、樣品測(cè)定(酶聯(lián)免疫測(cè)定ELISA)(I)包被在IOml包被緩沖液中加入一定量的包被抗原混勻，在酶標(biāo)板每個(gè)孔中 加入lOOuL。然后將酶標(biāo)板用保鮮膜包扎好，于37°C下3h。(2)洗板將包被好的板去處，放在室溫下平衡。然后甩掉包被液。加入洗滌液，放置O. 5min再甩掉洗滌液。重復(fù)3此。(3)競(jìng)爭(zhēng)加入標(biāo)準(zhǔn)物、待測(cè)樣和抗體，37°C左右O. 5h。(4)洗板將反應(yīng)液甩干，加洗滌液洗板四次。(5)加二抗置 37°C溫育 O. 5h。(6)洗板將反應(yīng)液甩干，加洗滌液洗板四次。(7)加底物顯色液稱取10-20mg鄰苯二胺(OPD)溶于IOml底物緩沖液中，完全溶解后加入2-4ul30%雙氧水?；靹?，在每孔中加入lOOul，然后放入濕盒內(nèi)，當(dāng)顯色適當(dāng)后，每孔加入50ul 2mol/L硫酸終止反應(yīng)。(8)比色在酶聯(lián)免疫分光光度計(jì)上依次測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物各濃度和各樣品490nm處的OD值。計(jì)算結(jié)果比較，如圖7所示，擬南芥中hsplOl基因被敲除后種子中赤霉素(GA3)和生長(zhǎng)素(IAA)含量升高，而脫落酸(ABA)含量降低，有利于萌發(fā)。
權(quán)利要求
1.擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子萌發(fā)中的應(yīng)用。
2.擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在種子儲(chǔ)藏中的應(yīng)用。
3.擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長(zhǎng)素IAA的種子中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的應(yīng)用，其特征在于擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子具有更高的萌發(fā)勢(shì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的應(yīng)用，其特征在于擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子對(duì)人工老化敏感，在自然保存過(guò)程中不耐儲(chǔ)藏。
6.根據(jù)權(quán)利要求3的應(yīng)用，其特征在于擬南芥熱激蛋白基因HSPlOl缺失使擬南芥種子 中內(nèi)源激素脫落酸ABA降低，赤霉素GA3升高，生長(zhǎng)素IAA升高，有利于萌發(fā)。
7.擬南芥基因HSPlOl的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子萌發(fā)的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
8.擬南芥基因HSPlOl的T-DNA插入突變株hotl在培育改良種子儲(chǔ)藏的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。
9.擬南芥HSPlOl的T-DNA插入突變株hotl在培育具有低含量脫落酸ABA，高含量赤霉素GA3和生長(zhǎng)素IAA的種子中的應(yīng)用。
全文摘要
提供擬南芥基因HSP101及其T-DNA插入突變株hot1在改變種子萌發(fā)和保藏中的應(yīng)用，該基因T-DNA插入突變株hot1在改變種子萌發(fā)和保藏方面的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用，以及在培育具有低含量脫落酸(ABA)，高含量赤霉素(GA3)和生長(zhǎng)素(IAA)的種子中的應(yīng)用。本發(fā)明在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)熱激蛋白基因HSP101功能與種子萌發(fā)和老化有關(guān)，該基因缺失可使得擬南芥種子對(duì)人工老化敏感，在自然保存過(guò)程中不耐儲(chǔ)藏，同時(shí)內(nèi)源激素脫落酸(ABA)降低，赤霉素(GA3)升高，生長(zhǎng)素(IAA)升高，有利于萌發(fā)。因此本發(fā)明發(fā)現(xiàn)操作基因HSP101能夠改變種子保藏、種子萌發(fā)特性，在種質(zhì)資源保存和農(nóng)作物生產(chǎn)中有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102643855SQ20121001230
公開(kāi)日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2012年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月16日
發(fā)明者李唯奇, 禹曉梅, 郁步竹, 陶發(fā)清 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所