專利名稱：哈茨木霉擴(kuò)張蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種哈茨木霉擴(kuò)張蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
二十一世紀(jì)人類面臨著資源匱乏的最大挑戰(zhàn)，利用現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)生物質(zhì)資源是解決資源問(wèn)題的重要出路。存在于細(xì)胞壁中的纖維素是自然界分布最廣、含量最多的一種多糖，是植物細(xì)胞壁的主要成分，也是地球上最大量的可再生碳源物質(zhì)，它的降解是自然界碳素循環(huán)的中心環(huán)節(jié)。據(jù)推算，每年地球上由綠色植物光合作用生產(chǎn)的纖維素可達(dá)1011 噸之多，而目前全球糧食產(chǎn)量只有2. 2 X IO9噸,如何把纖維素轉(zhuǎn)化成為人類可利用的食物或者有效能源，是人們長(zhǎng)期渴望解決的重大課題。然而，纖維素的應(yīng)用研究一直進(jìn)展緩慢， 纖維素酶作用天然底物的低效率和實(shí)際應(yīng)用中的高成本是生物質(zhì)轉(zhuǎn)化和有效利用的限制性瓶頸。隨著分子生物學(xué)和現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，已基本弄清纖維素酶催化水解纖維素的“酸/堿催化”雙置換作用機(jī)制，但仍然未能解決高效降解天然結(jié)晶纖維素的問(wèn)題， 其中主要是忽略了纖維素分子的超分子結(jié)構(gòu)即聚集態(tài)結(jié)構(gòu)對(duì)其降解的影響。事實(shí)上，無(wú)定形纖維素和可溶性的纖維寡糖很容易被纖維素外切酶酶解，纖維素與淀粉的結(jié)構(gòu)差異才是纖維素酶解與淀粉酶解速度不同的主要原因。在自然界對(duì)纖維素的生物降解過(guò)程中，除了酶解機(jī)制以外可能還有其它因子和非酶組分破壞天然纖維的結(jié)晶結(jié)構(gòu)來(lái)起始和協(xié)同酶解作用，比如文獻(xiàn)報(bào)道的一些低分子量組分、短纖維生成因子、羥基自由基等等，其中就有近年來(lái)剛剛發(fā)現(xiàn)但研究和應(yīng)用發(fā)展迅速的擴(kuò)張蛋白。擴(kuò)張蛋白最初在植物中發(fā)現(xiàn)，研究表明其可以破壞纖維素的微纖維之間或纖維素和其它細(xì)胞壁多糖之間的氫鍵，但是不具有纖維素酶活性，導(dǎo)致其難以檢測(cè)活性和進(jìn)行純化來(lái)研究其作用機(jī)制。近來(lái)發(fā)現(xiàn)絲狀真菌(木霉、曲霉等)中也含有具有植物擴(kuò)張蛋白類似序列的蛋白組分，可以破壞纖維素材料同時(shí)不產(chǎn)生還原糖，能夠使濾紙、結(jié)晶纖維素、半纖維素等天然底物的纖維結(jié)構(gòu)擴(kuò)張疏松，并且協(xié)同作用顯著提高纖維素酶對(duì)微晶纖維素的水解程度達(dá)數(shù)十倍以上。相對(duì)于植物擴(kuò)張蛋白，木霉等低等真菌的擴(kuò)張蛋白具有可以在微生物宿主中異源表達(dá)和分子改造的天然優(yōu)勢(shì)，對(duì)進(jìn)一步研究和闡明其擴(kuò)張機(jī)理和在纖維素酶酶解天然結(jié)晶纖維素過(guò)程中各組分的協(xié)同作用機(jī)制，并進(jìn)行分子改造和體內(nèi)、體外的進(jìn)化改良及異源表達(dá)的基因工程研究，最終實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)化應(yīng)用都有著重大的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種哈茨木霉擴(kuò)張蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種哈茨木霉擴(kuò)張蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。一種編碼哈茨木霉擴(kuò)張蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示?！N插入上述SEQ ID No. 2所不核苷酸序列的表達(dá)載體。
3
一種重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞插入了 SEQ ID No. 2所示核苷酸序列，或者，該重組細(xì)胞含有SEQ ID No. 2所示核苷酸序列的表達(dá)載體。上述哈茨木霉擴(kuò)張蛋白、編碼哈茨木霉擴(kuò)張蛋白的基因、表達(dá)載體、重組細(xì)胞在降解木質(zhì)纖維素中的應(yīng)用。本發(fā)明首先根據(jù)同源保守區(qū)域的部分序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR的方法從哈茨木霉的總RNA中擴(kuò)增出擴(kuò)張蛋白基因的部分cDNA序列；通過(guò)對(duì)擴(kuò)增出的保守域序列進(jìn)行分析設(shè)計(jì)引物，利用SMART-RACE技術(shù)設(shè)計(jì)錨定引物，克隆擴(kuò)張蛋白基因cDNA的5’和3’端， 經(jīng)過(guò)一系列的巢式PCR擴(kuò)增、篩選和鑒定得到兩端的序列；根據(jù)得到的擴(kuò)張蛋白cDNA兩端序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR的方法從哈茨木霉的總RNA中擴(kuò)增出擴(kuò)張蛋白基因的全長(zhǎng)cDNA 序列。該序列含有1467bp開放閱讀框，編碼489個(gè)氨基酸，分子量大小為51KD，等電點(diǎn)pi 為 4. 71。有益效果I、本發(fā)明制得的擴(kuò)張蛋白對(duì)纖維素酶降解不溶纖維素底物時(shí)有比較明顯的協(xié)同作用，協(xié)同指數(shù)最高達(dá)到2. 63，能夠有效的提高纖維素酶的降解效率。2、本發(fā)明通過(guò)哈茨木霉擴(kuò)張蛋白基因的克隆和異源表達(dá)，為進(jìn)一步功能機(jī)制研究、分子改造等提供了新的研究材料。3、本發(fā)明通過(guò)研究異源重組表達(dá)宿主的各種細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育的活性以及在降解木質(zhì)纖維素過(guò)程中的協(xié)同作用對(duì)自身生長(zhǎng)的影響，為哈茨木霉擴(kuò)張蛋白基因規(guī)模化的工業(yè)應(yīng)用開發(fā)打下基礎(chǔ)。


圖I為哈茨木霉擴(kuò)張蛋白基因保守區(qū)域序列擴(kuò)增結(jié)果示意圖；圖2為哈茨木霉擴(kuò)張蛋白基因5’ RACE擴(kuò)增結(jié)果示意圖；圖3為哈茨木霉擴(kuò)張蛋白基因3’ RACE擴(kuò)增結(jié)果示意圖；圖4為哈茨木霉擴(kuò)張蛋白基因全長(zhǎng)cDNA擴(kuò)增結(jié)果不意圖；圖5為哈茨木霉擴(kuò)張蛋白基因重組蛋白純化電泳不意圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的是提供一種哈茨木霉擴(kuò)張蛋白及其編碼基因與應(yīng)用，哈茨木霉擴(kuò)張蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，編碼哈茨木霉擴(kuò)張蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 2所示。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例材料準(zhǔn)備實(shí)施例中所述的哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum),菌種編號(hào)為CGMCC No. 3. 5364,購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。I.菌絲制備將哈茨木霉孢子懸液(I. 00 ±O. 05) X IO7個(gè)/ml接種涂布纖維平板，培養(yǎng)36h收集菌絲于若干I. 5ml離心管，液氮速凍保存。纖維平板組分如下55wt%料粉(粉料中的麩皮草粉質(zhì)量比為I : I)、瓊脂I.5wt%、水余量。2.總RNA的提取及mRNA的分離純化稱取O. 2g菌絲于預(yù)冷的研缽中，用液氮研磨至粉末狀。RNA提取方法及mRNA的分離純化方法參照Qiagen公司產(chǎn)品說(shuō)明書中關(guān)于RNeasy Mini Kit和Oligotex mRNA Mini Kit的相應(yīng)說(shuō)明進(jìn)行操作，懸浮并分裝于DEPC處理的無(wú)菌三蒸水中，獲得懸濁液，貯于-80 0C ο取一份懸濁液，并在230nm、260nm和280nm的條件下檢測(cè)OD值，計(jì)算RNA濃度，同時(shí)，通過(guò)O. 8%瓊脂糖凝膠電泳(90V，40min)檢測(cè)RNA完整性、含量和純度。根據(jù)OD值計(jì)算 RNA 濃度為 I. 25 μ g/μ I、Α260/Α280 = 2. 06、A260/A230 = 2. 31，表明提取的總 RNA 是完整而且蛋白等雜質(zhì)去除完全，材料在保存和提取過(guò)程中沒有發(fā)生降解，具體計(jì)算過(guò)程可參見《分子克隆試驗(yàn)指南》第三版，本操作中所有器具均用O. 1% DEPC水處理并烘干，所有試劑均用DEPC處理水配制。 3. RT-PCR擴(kuò)增擴(kuò)張蛋白cDNA部分片段3. I引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù)對(duì)GeneBank中公布的不同物種擴(kuò)張蛋白和擴(kuò)張蛋白序列，利用 DNAStar (Lasergene5. 01)軟件進(jìn)行同源功能保守區(qū)域序列的分析和比對(duì),發(fā)現(xiàn)上游包含一個(gè)非常保守的真菌型纖維素結(jié)合域(CBD區(qū))并與纖維素酶的CBD序列高度同源，與木霉的纖維素酶CBH、EG進(jìn)行CBD序列的比對(duì)，其中有兩部分區(qū)域高度保守(可能對(duì)結(jié)合纖維素的功能起重要作用)；同時(shí)序列下游具有同擴(kuò)張蛋白和相似的催化域(CD區(qū))序列，得到兩個(gè)較保守的區(qū)域(可能與擴(kuò)張功能有關(guān))。根據(jù)推測(cè)出的保守區(qū)域的序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)出上游引物序列5，-TTATATCTGGCTCCTCATG-3，，(SEQ ID NO. 3)及下游引物序列5，-CTCGCAATATCGGAGAGGTC-3，。(SEQ ID NO. 4)所用引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。3. 2RT 反應(yīng)以提取的哈茨木霉的總RNA為模板，進(jìn)行RT反應(yīng)，RT反應(yīng)體系如下
IOxRT緩沖液I μ
MgCl22 μ
dNTP 混合液(各 10 mM)I μ
RNase 抑制劑0.25 μ OligodT-Adaptor 引物0.5 μ
哈茨木霉總RNAI μg
AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μ
RNase Free ddH2Q_3.75 μ
總體積10 μ RT 反應(yīng)參數(shù)為55°C，30min ;99°C，5min ;4°C，5min。3. 3PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系如下5xPCR緩沖液10 μ
上游引物0.5 μ
下游引物0.5 μ _ π
樣口η I10 μ
Taq 酶0.25 μ
ddH2028.75 μ 總體積5ΜPCR 反應(yīng)參數(shù)94°C，2min 熱啟動(dòng) PCR后；94°C變性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸2min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。反應(yīng)結(jié)束后，取3μ I反應(yīng)液在I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到900bp左右清晰的特異性條帶，見圖l’M為DNA Marker。3. 4cDNA片段的電泳回收將cDNA產(chǎn)物經(jīng)電泳(120V，30min)分離后，切膠，根據(jù)OMEGA公司產(chǎn)品說(shuō)明書中 Gel Extraction Kit部分的描述進(jìn)行操作，回收核酸片段,I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。3. 5 連接 T-Vector在一個(gè)O. 5ml的離心管中按Takara試劑盒操作說(shuō)明依次加入各組分，混勻后離心，將管壁上的液滴收集到管底，16°C連接。3.6大腸桿菌0冊(cè)(！感受態(tài)細(xì)胞的制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化按《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中的操作方法，培養(yǎng)大腸桿菌DH5CI，用氯化鈣制備感受態(tài)細(xì)胞，取連接產(chǎn)物5. O μ I用熱激的方法轉(zhuǎn)化至制備好的大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中。以已知抗性的質(zhì)粒和不加質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化做陽(yáng)性和陰性對(duì)照。3. 7重組質(zhì)粒的篩選與鑒定克隆載體PMD18-T帶有LazZ，在含有IPTG+X-gal的平板上根據(jù)菌落的顏色進(jìn)行篩選，白色菌落初步判斷為有外源片斷插入的重組子。3. 8菌落PCR檢測(cè)用牙簽從白色菌落挑取少量菌體，轉(zhuǎn)移至裝有50 μ I無(wú)菌水的Eppendorf管中，煮沸5 10分鐘,離心后取上清液為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系如下
5xPCR緩沖液10 μ
上游引物0.5 μ
下游引物0.5 μ 樣品 I10 μ
Taq 酶0.25 μ
ddH2Q_28.75 μ
總體積50 μ PCR 反應(yīng)參數(shù)94°C，2min 熱啟動(dòng) PCR后；94°C變性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸2min，重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin。反應(yīng)結(jié)束后，取3μ I反應(yīng)液在I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。3. 9擴(kuò)增擴(kuò)張蛋白cDNA的部分片段的序列測(cè)定將有擴(kuò)增條帶鑒定為陽(yáng)性克隆的轉(zhuǎn)化子由生工生物工程(上海)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，得到哈茨木霉擴(kuò)張蛋白cDNA的部分片段序列。4. RACE法擴(kuò)增哈茨木霉擴(kuò)張蛋白cDNA的5’和3’端序列及全長(zhǎng)cDNA的克隆4. 15’ 和 3’ RACE-Ready cDNA 的制備以提取的哈茨木霉總RNA純化后的mRNA為模板進(jìn)行RT反應(yīng),分別向兩個(gè)離心管中依次加入下列試劑5，RACE-Ready cDNA 3，RACE-Ready cDNA I 3 μ I RNA 樣品I 3 μ I RNA 樣品I μ I5’ CDS 引物 Ιμ 3’ CDS 引物I μ ISMARTIIAoligo加無(wú)菌水至終體積5 μ 1，混勻后瞬時(shí)離心，70°C水浴中放2min，冰上放置2min， 瞬時(shí)離心，再依次加入下列樣品2 μ I 5XFirst-strand buffer ；I μ I DTT (20mM) ；1 μ I dNTP Mix (IOmM) ；I μ I PowerScript Reverse Transcriptase,共 10 μ I,用吸頭混勻，瞬時(shí)離心，42°C保溫放置I. 5h。用Tricine-EDTA buffer稀釋第一鏈反應(yīng)產(chǎn)物，72°C水浴7min ； 樣品存于-20°C。4. 2. 5’和3’端RACE的特異性擴(kuò)增弓I物的設(shè)計(jì)及合成根據(jù)分析擴(kuò)增的哈茨木霉擴(kuò)張蛋白保守區(qū)域的cDNA片段的測(cè)序結(jié)果，設(shè)計(jì)了用于5’端RACE (巢式PCR)的2條下游引物GSP (Rl) 5，-GAAGGCGGTGTGGTACAAGTGTCGCAGCCAG-3，； (SEQ ID NO. 5)GSP (R2) 5，-GTGATCCGCCAGAGCTACTCGCCGATGAGG-3，； (SEQ ID NO. 6)和用于3 ’端RACE的2條上游引物GSP (Fl) 5，-TAGTGCGTTCCAGGAACGCAA-3，； (SEQ ID NO. 7)GSP(F2)5，-CTGGTTGTGGTGCTTGGAC-3，。(SEQ ID NO. 8)各引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。4. 3 5，和 3，端 RACE在RACE反應(yīng)的PCR管中加入以下樣品
PCR-Grade Water17.25 μ
IOxAdvantage 2 PCR Buffer2.5 μ
dNTP Mix (IOmM)0.5 μ
50X Advantage 2 Polymerase Mix_0.5 μ
20.75 μ
5’ RACE 力卩模板和弓丨物5’ RACE-Ready cDNA I. 25 μ 1，UPM(IOX) 2. 5 μ 1， μΜ)0. 5μ I0 3’ RACE 加模板和引物3’ RACE-Ready cDNA I. 25 μ I, UPM(IOX) 2. 5 μ I，GSPl(10yM) O. 5 μ I。反應(yīng)總體積為 25 μ 1，5’和 3’RACE 各做遞減 PCR。遞減PCR反應(yīng)參數(shù)94°C變性30sec，72°C延伸3min，重復(fù)5個(gè)循環(huán)后進(jìn)行第二輪 PCR，反應(yīng)參數(shù)為94°C變性30sec，72°C退火30sec，72°C延伸3min，共5個(gè)循環(huán)；再進(jìn)行第三輪PCR，反應(yīng)條件為94°C變性30sec，68°C退火30sec，72°C延伸3min，共27個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取3μ I反應(yīng)液在I %瓊脂糖凝I父電泳檢測(cè)。4. 4巢式PCR擴(kuò)增各取上述PCR產(chǎn)物I μ I為模板,分別進(jìn)行巢式PCR,反應(yīng)體系為
GSPKlO
權(quán)利要求
1.一種哈茨木霉擴(kuò)張蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。
2.一種編碼權(quán)利要求I所述哈茨木霉擴(kuò)張蛋白的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No. 2 所示。
3.—種插入權(quán)利要求2所述基因的表達(dá)載體。
4.一種重組細(xì)胞，該重組細(xì)胞插入了權(quán)利要求2所述的基因，或者，該重組細(xì)胞含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體。
5.權(quán)利要求I所述哈茨木霉擴(kuò)張蛋白、權(quán)利要求2所述編碼哈茨木霉擴(kuò)張蛋白的基因、 權(quán)利要求3所述表達(dá)載體、權(quán)利要求4所述重組細(xì)胞在降解木質(zhì)纖維素中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種哈茨木霉擴(kuò)張蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供一種哈茨木霉擴(kuò)張蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，編碼該擴(kuò)張蛋白的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本發(fā)明制得的擴(kuò)張蛋白對(duì)纖維素酶降解不溶纖維素底物時(shí)有比較明顯的協(xié)同作用，協(xié)同指數(shù)最高達(dá)到2.63，能夠有效的提高纖維素酶的降解效率。
文檔編號(hào)C12N1/21GK102584964SQ20121003535
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月16日
發(fā)明者萬(wàn)魯長(zhǎng), 任海霞, 任鵬飛, 姚強(qiáng), 孫濤, 宮志遠(yuǎn), 李瑾, 王 琦, 韓建東 申請(qǐng)人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所