專利名稱：便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)技術(shù)，尤其是涉及乳與乳制品中病原微生物的現(xiàn)場(chǎng)定性檢測(cè)技術(shù)，具體為一種乳制品病原體檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
民以食為天，食以安為先。充足、營(yíng)養(yǎng)和安全的食品是人類生存的基本需要。盡管科技進(jìn)步顯著降低了疾病對(duì)人類的危害，但食源性疾病仍是人類健康和生命的主要威脅之一。近年來(lái)瘋牛病、禽流感、李斯特桿菌、豬鏈球菌等重大食品危害事件的頻頻爆發(fā)，也促使全球?qū)κ称钒踩膯?wèn)題越來(lái)越重視。在美國(guó)，由于食品病原問(wèn)題每年導(dǎo)致7，600萬(wàn)人生病，32萬(wàn)人住院，5，000人由于食品衛(wèi)生而死亡，并為此每年支出65億美元。而國(guó)內(nèi)，我國(guó)發(fā)生的幾起重大食物中毒事件都與微生物致病污染有關(guān)。如河南鄭州市某高校發(fā)生雞腸球菌污染食品引起367人集體食物中毒；山東省夏津縣一起鼠傷寒沙門菌污染食物引起153人食物中毒事件；2005年四川的豬鏈球菌事件更是造成38人死亡，近200人中毒。諸多案例表明食源性病原菌常造成群發(fā)性的傷害，給人們的身體健康及生命財(cái)產(chǎn)造成相當(dāng)?shù)奈：Α?008年的‘奶粉事件’，乳制品中的三聚氰胺超標(biāo)，更是將食品安全檢測(cè)推向了高潮，由此引發(fā)了食品檢測(cè)的革命風(fēng)暴。中國(guó)食品業(yè)在經(jīng)歷了 2008年的牛奶之觴后，度過(guò)了較為平靜的一年，但年終歲尾的“問(wèn)題奶粉”又死灰復(fù)燃，可口可樂(lè)“雪碧含汞”，“主食轉(zhuǎn)基因”安全問(wèn)題引起全民激辯，春節(jié)期間，海南毒豇豆席卷全國(guó)……種種食品安全問(wèn)題，使得人人自危。食品安全問(wèn)題再次敲響了警鐘！ 2010年2月9日，食品安全委員會(huì)成立，三位副總理攜15部長(zhǎng)共保食品安全。中共中央政治局常委、國(guó)務(wù)院總理溫家寶27日下午3時(shí)接受中國(guó)政府網(wǎng)、新華網(wǎng)聯(lián)合專訪，與廣大網(wǎng)友在線交流。在回答網(wǎng)友提出的“毒奶粉”等假冒偽劣產(chǎn)品時(shí)，溫家寶說(shuō)，對(duì)于整個(gè)社會(huì)來(lái)講，道德問(wèn)題十分重要，“我以為誠(chéng)信和道德是現(xiàn)代社會(huì)應(yīng)該解決的緊迫問(wèn)題"，然而光有道德約束遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，我們不僅要制訂詳細(xì)的法律來(lái)約束不法商家的違法行為，更要有快捷、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)方法，用于隨時(shí)隨地檢測(cè)各種問(wèn)題食品。目前用于檢測(cè)乳制品中的病原體檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有平板法、免疫法、real timePCR法，然而隨著人們生活水平的提高，對(duì)乳制品的檢測(cè)要求也不斷的提高。傳統(tǒng)的一些檢測(cè)方法，雖然一直作為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，但其缺陷也日益顯現(xiàn)。首先，平板法需要很長(zhǎng)時(shí)間，一般為六七天，而一些急于出售的乳制品，無(wú)法等待如此長(zhǎng)的時(shí)間，待檢測(cè)完畢，拿到檢測(cè)報(bào)告后，該批次的乳制品就會(huì)由于旋轉(zhuǎn)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而過(guò)保質(zhì)期；對(duì)一些表型特征變異的菌株，用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)經(jīng)驗(yàn)很難辨別，受主觀的經(jīng)驗(yàn)影響較大。其次，目前一些養(yǎng)殖場(chǎng)為了逃避病原體檢測(cè)，往往會(huì)給奶牛喂養(yǎng)一些含抗生素的飼料，導(dǎo)致在原奶中有較高的抗生素含量，從而平板法就會(huì)由于有抗生素的干擾，從而不能順利檢測(cè)到病原體的存在。再次，一個(gè)平板只能檢測(cè)一個(gè)樣本的一種病原體，一旦待測(cè)樣本數(shù)很多，平板法則根本沒(méi)辦法滿足，只能進(jìn)行抽檢，這樣就會(huì)導(dǎo)致漏檢率大大升高。
免疫法依賴抗原抗體的特異性反應(yīng)來(lái)檢測(cè)目的樣本中的病原體，因此，實(shí)驗(yàn)的靈敏度很大程度上依賴于抗體的好壞一方面，制作抗體是一個(gè)耗時(shí)耗力的工作，而且即使抗體制作的再好，也會(huì)由于抗原表面決定簇類似的原因，使結(jié)果出現(xiàn)交叉反應(yīng)；另一方面，有些病原變異極快，如病毒，或者一些菌屬，存在很多的亞型，并且經(jīng)常變異，從而使抗體失效，不能檢測(cè)新的抗原。有些乳制品中加了一些色素，因此，由于免疫法是利用酶標(biāo)儀的光吸收來(lái)判定結(jié)果的，因此，本底色過(guò)高，就很容易造成假陽(yáng)性結(jié)果。Real time PCR是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)上唯一的一個(gè)基于核酸擴(kuò)增的方法，不會(huì)受本底色和 抗生素的干擾，結(jié)果也較為可靠，然而最大的缺點(diǎn)就是通量較低，一個(gè)反應(yīng)只能檢測(cè)一種病原，一旦要檢測(cè)多個(gè)病原，就需要多臺(tái)PCR來(lái)完成，一旦有大量樣本，就不能及時(shí)完成所有檢測(cè)工作。同時(shí)該方法還需要昂貴的定量PCR儀，只能限定于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，不能走入尋常百姓家。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法，采用該方法無(wú)需復(fù)雜的儀器，并且用肉眼即可辨識(shí)檢測(cè)結(jié)果，從而準(zhǔn)確判斷是否被病原體污染。為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法，包括以下步驟I)、設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)大腸菌群、乳酸菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、霉菌的對(duì)應(yīng)引物組各一套；每套引物組中含有4條引物；2)、待測(cè)液態(tài)乳制品的前處理，依次進(jìn)行以下步驟①、將待測(cè)液態(tài)乳制品于3 5°C下1000-2000rpm離心15 25min，棄上層懸浮物；②、在上述步驟的所得物中加入PBS，輕輕震蕩從而使沉淀重新懸浮，于3 5°C下1000 2000rpm離心15 25min,棄上層懸浮物；所述PBS與步驟I)中的待測(cè)液態(tài)乳制品的體積比為8 12 50 ；③、重復(fù)步驟②2次(目的是為了除去乳脂和乳蛋白)；4000 6000g離心8 12min,棄上清；得沉淀；④、按照TEN IN的NaOH溶液為22 2. 8 3. 2的體積比，在步驟③所得的沉淀中加入TEN和IN的NaOH溶液，直至沉淀完全懸?。虎?、先將步驟④的所得物于90 100°C加熱7 9min，然后冷卻至彡室溫(放入冰盒中冷卻至不高于室溫)；⑥、將部分的步驟⑤所得物進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)，其余的步驟⑤所得物于_20°C保存?zhèn)溆?，作為DNA模板；3)、核酸的恒溫?cái)U(kuò)增利用步驟I)所得的每套引物組分別進(jìn)行以下操作①、步驟I)所得的每套引物組中的引物用DEPC處理水進(jìn)行溶解稀釋②、設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)體系2X 反應(yīng)液(RM) *12. 5 μ I,Bst DNA 聚合酶 I μ I,4種引物各I μ 1，
DNA 模板 2 μ I，熒光染料I μ I，DEPC處理水4. 5 μ I ;總反應(yīng)體系為25 μ I ;③、設(shè)置陰性對(duì)照以同體積量的DEPC處理水代替步驟②擴(kuò)增反應(yīng)體系中的DNA模板，作為陰性對(duì)昭.④、設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照以同體積量的所述引物組所對(duì)應(yīng)菌的標(biāo)準(zhǔn)DNA代替步驟②擴(kuò)增反應(yīng)體系中的DNA模板，作為陽(yáng)性對(duì)照；⑤、上述擴(kuò)增反應(yīng)體系、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別進(jìn)行以下操作先于60 65°C反應(yīng)30 60分鐘；然后使酶失活；4)、結(jié)果的判讀步驟3)所得的擴(kuò)增反應(yīng)體系、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各自所得反應(yīng)液分別按照以下任一方式進(jìn)行操作方式一、①、將步驟3)所得的擴(kuò)增反應(yīng)體系、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各自所得反應(yīng)液在可見(jiàn)光下直接用肉眼觀察，比較擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液、陰性對(duì)照反應(yīng)液和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液的混濁程度；當(dāng)同時(shí)滿足陰性對(duì)照反應(yīng)液為澄清透明、且陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液為白色混濁時(shí)，進(jìn)入步驟②，否則進(jìn)入步驟③；②、進(jìn)行樣品的判定當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液為澄清透明時(shí)，則待測(cè)液態(tài)乳制品的檢測(cè)結(jié)果為陰性；SP，待測(cè)液態(tài)乳制品中不含有所述引物組所對(duì)應(yīng)的菌；當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液為白色混濁時(shí)，則待測(cè)液態(tài)乳制品的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；SP，待測(cè)液態(tài)乳制品中含有所述引物組所對(duì)應(yīng)的菌；③、檢測(cè)失敗，需要重新進(jìn)行檢測(cè)；方式二、①、將步驟3)所得的擴(kuò)增反應(yīng)體系、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各自所得反應(yīng)液在紫外燈照射的狀態(tài)下用肉眼觀察，比較擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液、陰性對(duì)照反應(yīng)液和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液的混濁程度；當(dāng)同時(shí)滿足陰性對(duì)照反應(yīng)液為澄清透明、且陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液出現(xiàn)強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光時(shí)，進(jìn)入步驟②，否則進(jìn)入步驟③；②、進(jìn)行樣品的判定、
當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液為澄清透明時(shí)，則待測(cè)液態(tài)乳制品的檢測(cè)結(jié)果為陰性；SP，待測(cè)液態(tài)乳制品中不含有所述引物組所對(duì)應(yīng)的菌；當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液出現(xiàn)強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光時(shí)，則待測(cè)液態(tài)乳制品的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；即，待測(cè)液態(tài)乳制品中含有所述引物組所對(duì)應(yīng)的菌；③、檢測(cè)失敗，需要重新進(jìn)行檢測(cè)。作為本發(fā)明便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法的改進(jìn)
大腸菌群引物組中的4條引物為Coli-BIP AACAAATGCCCTGCTTCCAGGA-CGGTTTGGGGTACGATTTCGColi-FIP CTCGTCATCACACCTCAGCGTT-TTGTCCCGGTTTAAGCATGTColi-F3 CTATGTTAGCCGGGCGACColi-B3 TCTACCTGACCACCTGTGT ；乳酸菌引物組中的4條引物為L(zhǎng)ac-BIP CTGGGGAGTACGACCGCAAG-AAACCACATGCTCCACCGLac-FIP TGAAGGGCGGAAACCCTCCA-ATACCTGGTAGTCCATGCCGLac-F3 CATGGGTAGCGAACAGGATTLac-B3 TCTTCGCGTTGCTTCGAATT ；沙門氏菌引物組中的4條引物為Sal-BIP GCGGCCTGCGAAGCGATATC-TATCCACAGCGTGTCCCGSal-FIP GCGACATCACTTTCCTCCCGC-TCTCATGAGTCTGCCGTGGSal-F3 ATTGCTCAGAACGCACTACASal-B3 GGGTGAAGCGGTAAAACAGA志賀氏菌引物組中的4條引物為Shi-BIP CTGGGACATATCCCTCCGGCA-CAGGTTGCCAGATCATCGTShi-FIP CGTGGTGTGCCCATAGACTCCT-TATGGAGGGCCCATAGACAAShi-F3 GACCCCATAAAGCTGGACAGShi-B3 GCCCCGAGTTTCCTAGAGAA ；金黃色葡萄球菌引物組中的4條引物為SA-BIP AACGCATTAAGCACTCCGCCT-GGGTCCCCGTCAATTCCTSA-FIP CACTAAGGGGCGGAAACCCC-CTGGTAGTCCACGCCGTASA-F3 CGTGGGGATCAAACAGGATTSA-B3 CATGCTCCACCGCTTGTG霉菌引物組中的4條引物為mold-BIP ACTGATACGGGGCTCTTTTGGG-GCCCTCCAATTGTTCCTCGmoId-FIP ACCTCCCCGTATCGGGATTGG-TGAGAAACGGCTACCACATCmold-F3 AGGGTTCGATTCCGGAGAGmold-B3 GAATTACCGCGGCTGCTG。作為本發(fā)明便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟2)中TEN為每IOOml 的 TEN 中含有 O. 9 I. Iml 的 pH 7. 2 的濃度 IM 的 Tris,O. 18 O. 22mL的pH 8. O的濃度(λ 5M的EDTA，O. 58 O. 60g的NaCl ;其余為水。作為本發(fā)明便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟3)的步驟①中以BIP為后綴的引物和以FIP為后綴的引物稀釋成18 22pmole/ μ I,以F3為后綴的引物和以Β3為后綴的引物稀釋成4. 5 5. 5pmole/ μ I。作為本發(fā)明便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)步驟3)的步驟④的陽(yáng) 性對(duì)照中引物組所對(duì)應(yīng)菌的標(biāo)準(zhǔn)DNA的濃度為O. 8 I. 2ng/y I。鑒于目前食品安全領(lǐng)域?qū)κ称钒踩珯z測(cè)技術(shù)和產(chǎn)品的迫切需求，本發(fā)明人基于核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，開發(fā)了一款可用于乳制品中病原體的快速、便捷的檢測(cè)方法，屬于基于核酸的食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，不同于傳統(tǒng)的平板法，不會(huì)受抗生素干擾，并且具有無(wú)須復(fù)雜儀器，肉眼即可辨識(shí)結(jié)果，可以適合在普通家庭就能使用的優(yōu)點(diǎn)；該方法還具有很強(qiáng)的前瞻性，可以方便的增加所需要檢測(cè)的病原體。在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)大腸菌群、乳酸菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、霉菌的對(duì)應(yīng)引物組可依照如下方法進(jìn)行先從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得待測(cè)菌的特異區(qū)核酸序列，網(wǎng)址如下http://www. ncbi.nlm. nih. gov/genomes/MICROBES/microbial taxtree. html ;然后利用軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增弓I物，軟件地址為http: //primerexplorer. jp/elamp4. O. O/index, html。所有序歹丨J可委托英俊 公司制備，HPLC純化。本發(fā)明的步驟3)的步驟⑤中，反應(yīng)可在PCR儀中進(jìn)行，也可以直接在水浴鍋，甚至是保溫效果較好的保溫杯中進(jìn)行，因此適合普通消費(fèi)者家用。本發(fā)明的步驟3)的步驟②的設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)體系中2X反應(yīng)液(RM)*、Bst DNA聚合酶、熒光染料均可通過(guò)市購(gòu)的方式獲得，例如可從北京藍(lán)譜生物科技有限公司購(gòu)得，貨號(hào)LMP221 (包括了 2 X反應(yīng)液(RM)*和Bst DNA聚合酶)與LMP204(熒光染料)。在本發(fā)明的步驟4)的方式一中當(dāng)陰性對(duì)照反應(yīng)液不是澄清透明(即陰性對(duì)照有擴(kuò)增產(chǎn)物)，或者陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液不是白色混濁(即，陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物)時(shí)，說(shuō)明檢測(cè)失敗，需要重新進(jìn)行檢測(cè)。在本發(fā)明的步驟4)的方式二中當(dāng)陰性對(duì)照反應(yīng)液不是澄清透明(即陰性對(duì)照有擴(kuò)增產(chǎn)物)，或者陽(yáng)性對(duì)照的反應(yīng)液沒(méi)有出現(xiàn)強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光(即，陽(yáng)性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物)時(shí)，說(shuō)明檢測(cè)失敗，需要重新進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的方法是一種基于核酸恒溫?cái)U(kuò)增的病原體檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法具有步驟簡(jiǎn)潔、無(wú)須復(fù)雜的儀器、易于操作、可利用肉眼辨識(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的優(yōu)點(diǎn)，非常具有開發(fā)成普通產(chǎn)品的潛力，能讓普通消費(fèi)者定性檢測(cè)乳制品中是否含病原體。即，利用本發(fā)明的方法，普通家庭可以用來(lái)判斷家中乳制品，如純奶，是否被病原體污染。綜上所述，本發(fā)明具有以下的優(yōu)點(diǎn)I、檢測(cè)時(shí)間短，包括樣品前處理，1-2小時(shí)即可完成。2、可適合普通消費(fèi)者在家庭中使用，無(wú)須復(fù)雜的儀器，只要一個(gè)恒溫的水杯，用肉眼即可辨識(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。


下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。圖I是利用本方法檢測(cè)12種不同的牛奶中大腸桿菌，用肉眼直接觀察的示意圖；圖2是利用本方法檢測(cè)12種不同的牛奶中大腸桿菌，在紫外燈照射下再用肉眼觀察的示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例中所用到的12份樣品，預(yù)先按照傳統(tǒng)的平板法進(jìn)行檢測(cè)，具體檢測(cè)結(jié)果如表I所示。
表I、平板法檢測(cè)結(jié)果
權(quán)利要求
1.便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法，其特征是包括以下步驟 1)、設(shè)計(jì)引物 設(shè)計(jì)大腸菌群、乳酸菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、霉菌的對(duì)應(yīng)引物組各一套；每套引物組中含有4條引物； 2)、待測(cè)液態(tài)乳制品的前處理，依次進(jìn)行以下步驟 ①、將待測(cè)液態(tài)乳制品于3 5°C下1000-2000rpm離心15 25min，棄上層懸浮物； ②、在上述步驟的所得物中加入PBS，輕輕震蕩從而使沉淀重新懸浮，于3 5°C下1000 2000rpm離心15 25min,棄上層懸浮物； 所述PBS與步驟I)中的待測(cè)液態(tài)乳制品的體積比為8 12 50 ； ③、重復(fù)步驟②2次；4000 6000g離心8 12min,棄上清；得沉淀； ④、按照TEN: IN的NaOH溶液為22 2. 8 3. 2的體積比，在步驟③所得的沉淀中加A TEN和IN的NaOH溶液，直至沉淀完全懸??； ⑤、先將步驟④的所得物于90 100°C加熱7 9min，然后冷卻至<室溫； ⑥、將部分的步驟⑤所得物進(jìn)行DNA濃度檢測(cè)，其余的步驟⑤所得物于-20°C保存?zhèn)溆?，作為DNA模板； 3)、核酸的恒溫?cái)U(kuò)增 利用步驟I)所得的每套引物組分別進(jìn)行以下操作 ①、步驟I)所得的每套引物組中的引物用DEPC處理水進(jìn)行溶解稀釋； ②、設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)體系2X 反應(yīng)液(RM) *12. 5 u I,Bst DNA 聚合酶 Iii 1， 4種引物各I Ul，DNA 模板 2 u I, 熒光染料I U 1，DEPC處理水4. 5 ill ; 總反應(yīng)體系為25ii I ; ③、設(shè)置陰性對(duì)照 以同體積量的DEPC處理水代替步驟②擴(kuò)增反應(yīng)體系中的DNA模板，作為陰性對(duì)照； ④、設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照 以同體積量的所述引物組所對(duì)應(yīng)菌的標(biāo)準(zhǔn)DNA代替步驟②擴(kuò)增反應(yīng)體系中的DNA模板，作為陽(yáng)性對(duì)照； ⑤、上述擴(kuò)增反應(yīng)體系、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別進(jìn)行以下操作 先于60 65°C反應(yīng)30 60分鐘；然后使酶失活； 4)、結(jié)果的判讀 步驟3)所得的擴(kuò)增反應(yīng)體系、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各自所得反應(yīng)液分別按照以下任一方式進(jìn)行操作 方式一、 ①、將步驟3)所得的擴(kuò)增反應(yīng)體系、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各自所得反應(yīng)液在可見(jiàn)光下直接用肉眼觀察，比較擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液、陰性對(duì)照反應(yīng)液和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液的混濁程度；當(dāng)同時(shí)滿足陰性對(duì)照反應(yīng)液為澄清透明、且陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液為白色混濁時(shí)，進(jìn)入步驟②，否則進(jìn)入步驟③； ②、進(jìn)行樣品的判定 當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液為澄清透明時(shí)，則待測(cè)液態(tài)乳制品的檢測(cè)結(jié)果為陰性；待測(cè)液態(tài)乳制品中不含有所述引物組所對(duì)應(yīng)的菌； 當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液為白色混濁時(shí)，則待測(cè)液態(tài)乳制品的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；待測(cè)液態(tài)乳制品中含有所述引物組所對(duì)應(yīng)的菌； ③、檢測(cè)失敗，需要重新進(jìn)行檢測(cè)； 方式二、 ①、將步驟3)所得的擴(kuò)增反應(yīng)體系、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各自所得反應(yīng)液在紫外燈照射的狀態(tài)下用肉眼觀察，比較擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液、陰性對(duì)照反應(yīng)液和陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液的混濁程度； 當(dāng)同時(shí)滿足陰性對(duì)照反應(yīng)液為澄清透明、且陽(yáng)性對(duì)照反應(yīng)液出現(xiàn)強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光時(shí)，進(jìn)入步驟②，否則進(jìn)入步驟③； ②、進(jìn)行樣品的判定 當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液為澄清透明時(shí)，則待測(cè)液態(tài)乳制品的檢測(cè)結(jié)果為陰性；待測(cè)液態(tài)乳制品中不含有所述引物組所對(duì)應(yīng)的菌； 當(dāng)擴(kuò)增反應(yīng)體系反應(yīng)液出現(xiàn)強(qiáng)烈的藍(lán)色熒光時(shí)，則待測(cè)液態(tài)乳制品的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性；待測(cè)液態(tài)乳制品中含有所述引物組所對(duì)應(yīng)的囷； ③、檢測(cè)失敗，需要重新進(jìn)行檢測(cè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法，其特征是 大腸菌群引物組中的4條引物為 Coli-BIP AACAAATGCCCTGCTTCCAGGA-CGGTTTGGGGTACGATTTCGColi-FIP CTCGTCATCACACCTCAGCGTT-TTGTCCCGGTTTAAGCATGTCoIi-F3 CTATGTTAGCCGGGCGACCoIi-B3 TCTACCTGACCACCTGTGT ； 乳酸菌引物組中的4條引物為L(zhǎng)ac-BIP CTGGGGAGTACGACCGCAAG-AAACCACATGCTCCACCGLac-FIP TGAAGGGCGGAAACCCTCCA-ATACCTGGTAGTCCATGCCGLac-F3 CATGGGTAGCGAACAGGATTLac-B3 TCTTCGCGTTGCTTCGAATT ； 沙門氏菌引物組中的4條引物為Sal-BIP GCGGCCTGCGAAGCGATATC-TATCCACAGCGTGTCCCGSal-FIP GCGACATCACTTTCCTCCCGC-TCTCATGAGTCTGCCGTGGSal-F3 ATTGCTCAGAACGCACTACASal-B3 GGGTGAAGCGGTAAAACAGA志賀氏菌引物組中的4條引物為Shi-BIP CTGGGACATATCCCTCCGGCA-CAGGTTGCCAGATCATCGTShi-FIP CGTGGTGTGCCCATAGACTCCT-TATGGAGGGCCCATAGACAAShi-F3 GACCCCATAAAGCTGGACAG Shi-B3 GCCCCGAGTTTCCTAGAGAA ； 金黃色葡萄球菌引物組中的4條引物為SA-BIP AACGCATTAAGCACTCCGCCT-GGGTCCCCGTCAATTCCTSA-FIP CACTAAGGGGCGGAAACCCC-CTGGTAGTCCACGCCGTASA-F3 CGTGGGGATCAAACAGGATTSA-B3 CATGCTCCACCGCTTGTG霉菌引物組中的4條引物為mold-BIP ACTGATACGGGGCTCTTTTGGG-GCCCTCCAATTGTTCCTCGmoId-FIP ACCTCCCCGTATCGGGATTGG-TGAGAAACGGCTACCACATCmold-F3 AGGGTTCGATTCCGGAGAGmold-B3 GAATTACCGCGGCTGCTG。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法，其特征是所述步驟2)中TEN 為 每IOOml的TEN中含有0. 9 I. Iml的pH 7. 2的濃度IM的Tris、0. 18 0. 22mL的pH 8. 0的濃度0. 5M的EDTA, 0. 58 0. 60g的NaCl ;其余為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法，其特征是所述步驟3)的步驟①中以BIP為后綴的引物和以FIP為后綴的引物稀釋成18 22pmole/ y I,以F3為后綴的引物和以B3為后綴的引物稀釋成4. 5 5. 5pmole/u I0
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法，其特征是所述步驟3)的步驟④的陽(yáng)性對(duì)照中引物組所對(duì)應(yīng)菌的標(biāo)準(zhǔn)DNA的濃度為0. 8 I. 2ng/u I0
全文摘要
本發(fā)明公開了一種便捷的乳制品病原體檢測(cè)方法，包括以下步驟1)設(shè)計(jì)大腸菌群、乳酸菌、沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、霉菌的對(duì)應(yīng)引物組各一套；2)待測(cè)液態(tài)乳制品進(jìn)行前處理，作為DNA模板；3)核酸的恒溫?cái)U(kuò)增包括設(shè)置擴(kuò)增反應(yīng)體系、設(shè)置陰性對(duì)照、設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照；對(duì)上述擴(kuò)增反應(yīng)體系、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照分別進(jìn)行以下操作先于60～65℃反應(yīng)30～60分鐘；然后使酶失活；4)結(jié)果的判讀將步驟3)所得的擴(kuò)增反應(yīng)體系、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照各自所得反應(yīng)液在可見(jiàn)光下直接用肉眼觀察，或者在紫外燈照射的狀態(tài)下用肉眼觀察；從而判定待測(cè)液態(tài)乳制品的檢測(cè)結(jié)果為陰性還是陽(yáng)性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102634573SQ201210035928
公開日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2012年2月17日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月17日
發(fā)明者余文菁, 宓婭娜, 洪旭濤, 程小璇, 邵暉 申請(qǐng)人:杭州銳創(chuàng)生物技術(shù)有限公司