專利名稱：建立胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞庫的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從胎盤中分離間充質(zhì)干細(xì)胞從而建立胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞庫的方法。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell, MSC)例如人類的間充質(zhì)干細(xì)胞最早是從骨髓中分離出來的，來源于中胚層的一類具有多向分化潛能和自我更新能力的組織干細(xì)胞，在體內(nèi)和體外特定條件下具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、肝細(xì)胞等多種成體細(xì)胞分化的能力(Caplan Al. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 1991,9 :641-650. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 1999 ;284 :143-147)。最新的研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)和造血支持作用，而且易于外源基因?qū)氡磉_(dá)。 因此間充質(zhì)干細(xì)胞不但是組織工程化骨、軟骨和心肌構(gòu)建中的種子細(xì)胞，基因治療中重要的載體細(xì)胞，而且由于間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)造血重建和抑制移植物抗宿主反應(yīng)功能，在造血干細(xì)胞移植和器官移植中具有廣泛的應(yīng)用前景。間充質(zhì)干細(xì)胞具有體外貼壁生長的特性， 利用這種特性，人們已經(jīng)成功從肝臟、腎臟、胰腺、肌肉、軟骨、皮膚、外周血等多種組織中分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞。目前所報(bào)道的間充質(zhì)干細(xì)胞主要來源于骨髓，采用密度梯度離心法獲得。雖然分離方法簡便，但供者取髓需要經(jīng)歷一個(gè)比較痛苦的手術(shù)，并在取材過程中及取材后會(huì)有很高的感染機(jī)會(huì)；由于人體骨髓中MSC的含量極其稀少，每IO5 IO6個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中大約只有I個(gè)，而且隨著年齡的增加，骨髓中間充質(zhì)干細(xì)胞的數(shù)量、增殖和分化能力均顯著下降， 使其在研究和應(yīng)用尤其是臨床應(yīng)用中受到限制。起源于胚胎發(fā)育期胚外中胚層的胎盤是由間質(zhì)、血管及滋養(yǎng)細(xì)胞組成，含有大量的間充質(zhì)成分。最新的研究表明胎盤中含有豐富的干細(xì)胞，從胎盤中分離培養(yǎng)出這些多能干細(xì)胞將為實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用開辟一個(gè)嶄新而豐富的來源。現(xiàn)有的從胎盤中分離干細(xì)胞從而建立胎盤干細(xì)胞庫的方法尚有諸多缺點(diǎn)，例如純度不足、和/或數(shù)量不高，進(jìn)而顯示出這些方法尚不能滿足人們的期待。例如CN 101270349A(中國專利申請(qǐng)?zhí)?00810061267. 6，
公開日2008年9月24日)公開的題為 “胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞分離和體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法”的發(fā)明；CN 101693884A(中國專利申請(qǐng)?zhí)?200910117522. 9，
公開日2010年4月14日)公開的題為“一種從胎盤、臍帶或脂肪組織中分離提取干細(xì)胞的方法”的發(fā)明；CN 102146359A(中國專利申請(qǐng)?zhí)?01110005964. 1，
公開日2011年8月10日)公開的題為“從胎盤中提取原始間充質(zhì)干細(xì)胞及無血清擴(kuò)增的方法” 的發(fā)明。這些方法在提取物的純度和/或回收率方面是有待進(jìn)一步改善的。本領(lǐng)域仍然需要有新的從胎盤中分離干細(xì)胞從而建立胎盤干細(xì)胞庫的方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有獲取胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞方法的缺陷，提供一種實(shí)用簡單的從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細(xì)胞從而建立胎盤干細(xì)胞庫的方法。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)采用特別的操作方法，所獲得的細(xì)胞純度高和/或細(xì)胞回收率高。本發(fā)明基于此發(fā)現(xiàn)而得以完成。因此，本發(fā)明第一方面提供一種建立胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞庫的方法，該方法包括以下步驟(a)取胎盤小葉，用PBS緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的PBS緩沖液，再在37°C孵育消化；(C)將組織塊用銅網(wǎng)過濾，必要時(shí)研磨以促使過濾；(d)將收集的過濾液離心，分離單個(gè)核細(xì)胞，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞， 然后在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(e)待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；(f)針對(duì)步驟(e)所得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)細(xì)胞活性、 細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；(g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存；(h)建立包含以上信息的胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(g)的凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(a)是在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(a)是在產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10%體積胎牛血清(FBS)的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，其中所述步驟(b)中的組織消化酶是選自下列的一種或多種dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶I (DNase I)、膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟(b)中的組織消化酶包括dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶I (DNase I)、膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(b)中，所述PBS緩沖液中包含約 O. lmg/mLdispase、約 O. 25mg/mL 膜酶、約 O. 25mg/mL DNase I、約 lmg/mL 膠原酶 IV、和約 lmg/mL透明質(zhì)酸酶。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(b)中，在37°C孵育10 30分鐘，優(yōu)選10 20分鐘，例如10分鐘、15分鐘或20分鐘。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(b)中，將胎盤小葉剪成約Icm3大小的組織塊。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(C)中，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器研磨。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(c)中，將組織塊和細(xì)胞懸液一起用160 240目(優(yōu)選 200目)銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(d)中，所述MSC培養(yǎng)基是含10% FBS的PBS 緩沖液。在本發(fā)明的任一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述MSC培養(yǎng)基是含10% FBS的PBS緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(d)中，將收集的過濾液用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，然后在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(d)中，將收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中，IOOOrpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10% FBS的PBS緩沖液重懸細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(e)中，待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞60 90%融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(e)中，當(dāng)散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用0.05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化，傳代培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述細(xì)胞活性檢測(cè)是利用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)凍存前后活細(xì)胞的數(shù)目。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述細(xì)胞污染檢測(cè)利用少量細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞是否受到真菌和細(xì)菌的污染。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞污染檢測(cè)是利用病原學(xué)方法，檢測(cè)細(xì)胞是否受到選自下列的一項(xiàng)或多項(xiàng)的感染乙肝兩對(duì)半、丙肝、艾滋病毒、 巨細(xì)胞病毒、EB 病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA、TRUST。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述遺傳病檢測(cè)是利用分子遺傳學(xué)的方法，檢測(cè)凍存細(xì)胞是否存在遺傳病。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(f)中，所述HLA-ABC/DR配型是檢測(cè)細(xì)胞 HLA-ABC/DR 表型。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(g)中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞是經(jīng)程序降溫過程凍存于液氮中。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(g)中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞存在于細(xì)胞凍存液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞凍存液包含50%低糖DMEM培養(yǎng)液、40% FBS、10%二甲基亞諷。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，在步驟(h)中，所述數(shù)據(jù)庫中包括與所保存的細(xì)胞所有相關(guān)的數(shù)據(jù)，包括但不限于細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測(cè)結(jié)果、多向分化潛能鑒定結(jié)果、細(xì)胞分子遺傳學(xué)診斷結(jié)果、胎兒及其父母的詳細(xì)資料。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法包括以下步驟在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。再將胎盤小葉剪成Icm3大小的組織塊，加入含有多種組織消化酶的的PBS緩沖液在37°C孵育15分鐘，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器研磨。收集過濾后的液體用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌后用 MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞放到37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待散在細(xì)胞形成克隆后，將各克隆細(xì)胞挑出用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，細(xì)胞80 90 %融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。將傳代后的細(xì)胞于液氮中凍存并記錄相關(guān)胎兒信息，并進(jìn)行細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能鑒定，以及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分子遺傳學(xué)診斷，保存細(xì)胞的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，建立胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明第一方面的方法，該方法包括以下步驟產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10%體積FBS的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。先將胎盤小葉剪成Icm3大小的組織塊,加入到含有0. lmg/mL dispase、0. 25mg/ mL胰酶、0. 25mg/mL DNase I、lmg/mL膠原酶IV、lmg/mL透明質(zhì)酸酶的PBS緩沖液中37°C消化15分鐘，加入適量FBS終止消化。再將組織塊和細(xì)胞懸液一起用200目銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊，收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中IOOOrpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10% FBS的PBS緩沖液重懸細(xì)胞。然后用密度梯度離心法分離收集單個(gè)核細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌單個(gè)核細(xì)胞后用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，接種單個(gè)核細(xì)胞的密度為每75cm2 (細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積)I X IO7單個(gè)核細(xì)胞共IOml MSC培養(yǎng)基。最后將培養(yǎng)瓶放到37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)后全量換液去除非貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中會(huì)有散在的梭型貼壁細(xì)胞，加入新鮮MSC培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。10天左右，散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用 O. 05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3000細(xì)胞/cm2進(jìn)行傳代培養(yǎng)；之后，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%左右融合時(shí)消化傳代培養(yǎng)，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。在本發(fā)明第一方面所述建立胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞庫的方法中，包涵了從胎盤中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。因此，本發(fā)明第二方面提供了從胎盤中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)取胎盤小葉，用PBS緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的PBS緩沖液，再在37°C孵育消化；(c)將組織塊用銅網(wǎng)過濾，必要時(shí)研磨以促使過濾；(d)將收集的過濾液離心，分離單個(gè)核細(xì)胞，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞， 然后在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(e)待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；以及任選的下列一個(gè)或多個(gè)步驟(f)針對(duì)步驟(e)所得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)細(xì)胞活性、 細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；(g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存；(h)建立包含以上信息的胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(g)的凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中所述步驟(a)是在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中所述步驟(a)是在產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10%體積胎牛血清(FBS)的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，其中所述步驟(b)中的組織消化酶是選自下列的一種或多種dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶I (DNase I)、膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述步驟(b)中的組織消化酶包括dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶I (DNase I)、膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(b)中，所述PBS緩沖液中包含約
O.lmg/mLdispase、約 O. 25mg/mL 膜酶、約 O. 25mg/mL DNase I、約 lmg/mL 膠原酶 IV、和約 lmg/mL透明質(zhì)酸酶。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(b)中，在37°C孵育10 30分鐘，優(yōu)選10 20分鐘，例如10分鐘、15分鐘或20分鐘。
根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(b)中，將胎盤小葉剪成約Icm3大小的組織塊。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(C)中，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器研磨。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(c)中，將組織塊和細(xì)胞懸液一起用160 240目(優(yōu)選 200目)銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(d)中，所述MSC培養(yǎng)基是含10% FBS的PBS 緩沖液。在本發(fā)明的任一方面的一個(gè)實(shí)施方案中，所述MSC培養(yǎng)基是含10% FBS的PBS緩沖液。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(d)中，將收集的過濾液用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，然后在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(d)中，將收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中，IOOOrpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10% FBS的PBS緩沖液重懸細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(e)中，待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞60 90%融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(e)中，當(dāng)散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用O. 05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化，傳代培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(f)中，所述細(xì)胞活性檢測(cè)是利用臺(tái)盼藍(lán)染色法計(jì)數(shù)凍存前后活細(xì)胞的數(shù)目。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(f)中，所述細(xì)胞污染檢測(cè)利用少量細(xì)胞培養(yǎng)，檢測(cè)細(xì)胞是否受到真菌和細(xì)菌的污染。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞污染檢測(cè)是利用病原學(xué)方法，檢測(cè)細(xì)胞是否受到選自下列的一項(xiàng)或多項(xiàng)的感染乙肝兩對(duì)半、丙肝、艾滋病毒、 巨細(xì)胞病毒、EB 病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA, TRUST0根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(f)中，所述遺傳病檢測(cè)是利用分子遺傳學(xué)的方法，檢測(cè)凍存細(xì)胞是否存在遺傳病。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(f)中，所述HLA-ABC/DR配型是檢測(cè)細(xì)胞 HLA-ABC/DR 表型。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(g)中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞是經(jīng)程序降溫過程凍存于液氮中。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(g)中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞存在于細(xì)胞凍存液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，該細(xì)胞凍存液包含50%低糖DMEM培養(yǎng)液、40% FBS、10%二甲基亞諷。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，在步驟(h)中，所述數(shù)據(jù)庫中包括與所保存的細(xì)胞所有相關(guān)的數(shù)據(jù)，包括但不限于細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測(cè)結(jié)果、多向分化潛能鑒定結(jié)果、細(xì)胞分子遺傳學(xué)診斷結(jié)果、胎兒及其父母的詳細(xì)資料。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，該方法包括以下步驟在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。再將胎盤小葉剪成Icm3大小的組織塊，加入含有多種組織消化酶的的PBS緩沖液在37°C孵育15分鐘，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器研磨。收集過濾后的液體用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌后用 MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞放到37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待散在細(xì)胞形成克隆后，將各克隆細(xì)胞挑出用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，細(xì)胞80 90 %融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。將傳代后的細(xì)胞于液氮中凍存并記錄相關(guān)胎兒信息，并進(jìn)行細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能鑒定，以及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分子遺傳學(xué)診斷，保存細(xì)胞的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，建立胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明第二方面的方法，該方法包括以下步驟產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10%體積FBS的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。先將胎盤小葉剪成Icm3大小的組織塊,加入到含有0. lmg/mL dispase、0. 25mg/ mL胰酶、0. 25mg/mL DNase I、lmg/mL膠原酶IV、lmg/mL透明質(zhì)酸酶的PBS緩沖液中37°C消化15分鐘，加入適量FBS終止消化。再將組織塊和細(xì)胞懸液一起用200目銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊，收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中IOOOrpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10% FBS的PBS緩沖液重懸細(xì)胞。然后用密度梯度離心法分離收集單個(gè)核細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌單個(gè)核細(xì)胞后用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，接種單個(gè)核細(xì)胞的密度為每75cm2 (細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積)I X IO7單個(gè)核細(xì)胞共IOml MSC培養(yǎng)基。最后將培養(yǎng)瓶放到37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)后全量換液去除非貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中會(huì)有散在的梭型貼壁細(xì)胞，加入新鮮MSC培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。10天左右，散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用 0. 05%胰蛋白酶/2mM EDTA消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3000細(xì)胞/cm2進(jìn)行傳代培養(yǎng)；之后，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%左右融合時(shí)消化傳代培養(yǎng)，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。此外，在本發(fā)明第一方面方法或者第二方面方法中，提供了一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。因此本發(fā)明第三方面提供了一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明第三方面的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，其是根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案所述方法或者根據(jù)本發(fā)明第一方面任一實(shí)施方案所述方法獲得的。根據(jù)本發(fā)明第三方面的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，其細(xì)胞純度大于95%。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)3代以上傳代后，細(xì)胞純度大于95%。下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。本發(fā)明所引用的文獻(xiàn)，以及該文獻(xiàn)中所引用的文獻(xiàn)，它們的全部內(nèi)容通過弓I用并入本文。在本發(fā)明中，本發(fā)明任一方面的任一技術(shù)方案中，其任一技術(shù)特征同樣適用于本發(fā)明的任一方面的任一實(shí)施方案，只要它們不會(huì)引起矛盾，并且這種相互適用在必要時(shí)可以作適當(dāng)?shù)男薷?。在本發(fā)明中，術(shù)語“胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞”是指來源于胎盤的間充質(zhì)干細(xì)胞。因此在本發(fā)明中，特別是涉及本發(fā)明的語境中，術(shù)語“胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞”可以與“胎盤干細(xì)胞”、 “干細(xì)胞”、“間充質(zhì)干細(xì)胞”互換使用，除非另有明確指明。在本發(fā)明中，術(shù)語“PBS緩沖液”或者“PBS”是指磷酸鹽緩沖液。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知在本發(fā)明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它們的一般性質(zhì)例如pH值或pH范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語“胎盤”是指新生兒胎盤，特別是指產(chǎn)后4小時(shí)之內(nèi)的胎盤。在本發(fā)明中，術(shù)語“MSC培養(yǎng)基”是指間充質(zhì)干細(xì)胞專用培養(yǎng)基。本發(fā)明的發(fā)明人曾利用灌流法從胎盤中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞，獲得了純度很高的間充質(zhì)干細(xì)胞。但是經(jīng)過灌流后仍然會(huì)有大量干細(xì)胞滯留在胎盤組織中，不能有效地被分離出來。因此可以認(rèn)為，采用灌流法不能最大限度的得到間充質(zhì)干細(xì)胞。
本發(fā)明公開了一種從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，并利用這種方法保存胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞并建立胎盤干細(xì)胞庫。本發(fā)明的發(fā)明人在總結(jié)以往分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用多種組織消化酶混合消化胎盤小葉組織塊，結(jié)合貼壁培養(yǎng)法，成功自胎盤中分離得到大量間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明方法得到的間充質(zhì)干細(xì)胞純度高、數(shù)量多，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相同的生物學(xué)特性，能向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等分化。由于胎盤中干細(xì)胞較成體干細(xì)胞幼稚，含量豐富，在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景，我們運(yùn)用常規(guī)的細(xì)胞凍存方法將間充質(zhì)干細(xì)胞像臍血一樣凍存起來，建立胎盤干細(xì)胞庫，為以后干細(xì)胞的深入研究和臨床治療奠定基礎(chǔ)。由于臍血中含有豐富的造血干細(xì)胞，人們建立臍血庫把臍血造血干細(xì)胞這一重要的生物資源儲(chǔ)存起來，為多種血液系統(tǒng)疾病和免疫系統(tǒng)疾病提供一種治療手段。同樣胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞作為一種更加重要的干細(xì)胞資源，我們運(yùn)用常規(guī)的細(xì)胞凍存方法將其冷凍在-196攝氏度的深低溫液氮中長期保存，建立胎盤干細(xì)胞庫，為日后的干細(xì)胞治療保存種子。本發(fā)明的目的是提供一種實(shí)用簡單的從胎盤中大量分離間充質(zhì)干細(xì)胞并建立胎盤干細(xì)胞庫的方法，包括如下步驟在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤中殘留的血液。再將胎盤小葉剪成Icm3大小的組織塊，加入含有多種組織消化酶的的PBS緩沖液在37°C孵育15分鐘，將組織塊用銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器研磨。收集過濾后的液體用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，洗滌后用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞放到37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待散在細(xì)胞形成克隆后，將各克隆細(xì)胞挑出用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，細(xì)胞80 90%融合后，用胰酶消化傳代，將傳代后的細(xì)胞于液氮中凍存并記錄相關(guān)胎兒信息，并進(jìn)行細(xì)胞的生物學(xué)特性及多向分化潛能鑒定，以及對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分子遺傳學(xué)診斷，保存細(xì)胞的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，建立胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫并與凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。根據(jù)本發(fā)明的方法，例如根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1、2的方法，一個(gè)重量為750克的胎盤可以分得8 X IO9單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)過貼壁培養(yǎng)平均I X IO6單個(gè)核細(xì)胞中可以獲得12個(gè)克隆， 鑒定后平均有3個(gè)克隆具有間充質(zhì)干細(xì)胞的特性，即750g胎盤中可分得24000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞。這些干細(xì)胞經(jīng)過體外短期培養(yǎng)可以很快達(dá)到細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以及臨床治療所需數(shù)量。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，按照CN1548529A中實(shí)施例一的方法，一個(gè)重量為750克的胎盤大約可分離得到3000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)3代傳代后，細(xì)胞純度大于約為95%。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(b)中所述PBS緩沖液中包含約O. lmg/mL dispase、約O. 25mg/mL胰酶、約O. 25mg/mL DNase I、約lmg/mL膠原酶IV、和約lmg/mL透明質(zhì)酸酶；本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該 PBS緩沖液中的5種酶，缺少任一種或多種時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞收率和細(xì)胞純度均遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到上述750g胎盤中可分得24000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞的結(jié)果；此外，5種酶的濃度作適當(dāng)變化，特別是在低于上述各自濃度的50%或者高于上述各自濃度的200%時(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞收率和細(xì)胞純度均明顯比上述750g胎盤中可分得24000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞的結(jié)果差；例如當(dāng)PBS緩沖液中的dispase濃度為O. 04mg/mL(低于本發(fā)明上述濃度的50% )或者為O. 25mg/mL(高于本發(fā)明上述濃度的200% )時(shí)，750g胎盤中約可分得8000個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞且細(xì)胞低度低于90%。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是在步驟(b)中，所述PBS緩沖液中包含O. 05
O.2mg/mL dispase、?！?125 O. 5mg/mL 膜酶、O. 125 O. 5mg/mL DNase I、O. 5 2mg/mL 膠原酶IV、和O. 5 2mg/mL透明質(zhì)酸酶。
本發(fā)明操作簡單，方便實(shí)用，能得到大量的間充質(zhì)干細(xì)胞，分化性能好，具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等細(xì)胞分化的能力。與現(xiàn)有方法的比較 目前MSC主要采用手術(shù)法抽取供者骨髓或灌流法分離胎盤，貼壁培養(yǎng)獲得。該法分得細(xì)胞數(shù)量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本發(fā)明成功自胎盤中分離獲得大量純度較高的間充質(zhì)干細(xì)胞，并運(yùn)用此法建立胎盤干細(xì)胞庫來儲(chǔ)備這種極具應(yīng)用前景的干細(xì)胞。該法簡便易行，且由于胎盤與臍血一樣，細(xì)胞成份較幼稚，來源廣泛，方便易得，因此本發(fā)明的方法在干細(xì)胞的臨床應(yīng)用上將具有廣泛的前景。


圖I為顯微鏡下對(duì)細(xì)胞生長的形態(tài)學(xué)觀察。其中A為培養(yǎng)3天后可見散在的貼壁細(xì)胞；B為7 10天形成克?。籆為經(jīng)篩選克隆形成致密貼壁細(xì)胞；D、E、F為瑞氏姬姆薩染色。圖2為流式細(xì)胞術(shù)鑒定MSC表面標(biāo)志結(jié)果。各圖中縱坐標(biāo)“counts”表示計(jì)數(shù)量。圖3為胎盤MSC細(xì)胞周期的分析結(jié)果。其中，P3為培養(yǎng)第三代細(xì)胞的DNA含量，分析細(xì)胞周期，可見大部分細(xì)胞處于靜止期(GcZG1期，96. 66%)，極少細(xì)胞處于增殖期(S期， 3. 25% )0 P6為培養(yǎng)第六代的細(xì)胞的DNA含量，分析細(xì)胞周期，可見大部分細(xì)胞處于靜止期 (GcZG1期，96. 35% )，極少細(xì)胞處于增殖期(S期，2. 54% )。各圖中縱坐標(biāo)“counts”表示計(jì)數(shù)量，橫坐標(biāo)標(biāo)“DNA Content”表示DNA含量。圖4為胎盤MSC細(xì)胞生長曲線圖。圖5為胎盤MSC多向分化潛能鑒定的成骨誘導(dǎo)細(xì)胞圖。圖6為胎盤MSC多向分化潛能鑒定的成脂肪誘導(dǎo)細(xì)胞圖。圖7為胎盤MSC多向分化潛能鑒定的成軟骨誘導(dǎo)細(xì)胞圖。圖8為RT-PCR檢測(cè)胎盤MSC多向分化潛能的電泳照片。
具體實(shí)施例方式通過下面的實(shí)施例可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的描述，然而，本發(fā)明的范圍并不限于下述實(shí)施例。本領(lǐng)域的專業(yè)人員能夠理解，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種變化和修飾。本發(fā)明對(duì)試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性和/或具體的描述。雖然為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡可能詳細(xì)的描述。實(shí)施例I、胎盤MSC的分離在產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10 %體積FBS的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。先將胎盤小葉剪成Icm3大小的組織塊， 加入到含有 0. lmg/mL dispase、0. 25mg/mL 膜酶、0. 25mg/mL DNase I、lmg/mL 膠原酶 IV、 lmg/mL透明質(zhì)酸酶的PBS緩沖液中37°C消化15分鐘，加入適量FBS終止消化。再將組織塊和細(xì)胞懸液一起用200目銅網(wǎng)過濾同時(shí)用注射器活塞研磨組織塊，收集過濾后的細(xì)胞懸液加入到離心管中IOOOrpm離心10分鐘，倒掉上清，用含10% FBS的PBS緩沖液重懸細(xì)胞。 然后用密度梯度離心法分離收集單個(gè)核細(xì)胞，PBS緩沖液洗滌單個(gè)核細(xì)胞后用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，接種單個(gè)核細(xì)胞的密度為每75cm2(細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)表面積)IX IO7單個(gè)核細(xì)胞共IOml MSC培養(yǎng)基。最后將培養(yǎng)瓶放到37°C 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。72小時(shí)后全量換液，去除非貼壁細(xì)胞，培養(yǎng)瓶中會(huì)有散在的梭型貼壁細(xì)胞，再加入新鮮MSC培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)施例2、胎盤MSC的傳代培養(yǎng)及其凍存在約10天后，待散在貼壁細(xì)胞形成克隆后，用O. 05%胰蛋白酶/2mMEDTA消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3000細(xì)胞/cm2進(jìn)行傳代培養(yǎng)。之后，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%左右融合時(shí)消化傳代培養(yǎng)。消化后取3 X IO6細(xì)胞加入到Iml細(xì)胞凍存液(含50%低糖DMEM培養(yǎng)液、40% FBS、 10%二甲基亞砜)中，經(jīng)過程序降溫最后進(jìn)入到液氮管中凍存。實(shí)施例3、胎盤MSC的生物學(xué)特性鑒定I、細(xì)胞生長及其形態(tài)學(xué)特點(diǎn)通過實(shí)施例I和實(shí)施例2的分離培養(yǎng)，胎盤單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)后在顯微鏡下可明顯見到梭形貼壁細(xì)胞(圖1A)，10天左右會(huì)形成渦輪狀細(xì)胞克隆(圖1B、圖1D)，消化傳代后會(huì)形成80%左右融合的貼壁層(圖1C、圖1E、圖1F)。培養(yǎng)過程中，發(fā)現(xiàn)這種細(xì)胞形態(tài)相對(duì)均一，增殖速度快，貼壁速度快，易被胰酶消化，傳代至15代以上，其形態(tài)及生長特點(diǎn)亦無明顯改變。2、流式細(xì)朐術(shù)鑒定MSC表面標(biāo)志分別取第3、6、9、12、15代細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志，動(dòng)態(tài)觀察培養(yǎng)過程中細(xì)胞表面標(biāo)志的變化。消化收集細(xì)胞，計(jì)數(shù)后取8X IO6個(gè)細(xì)胞，分裝16管；PBS洗一次，1500rpm離心IOmin ;棄上清，殘留100 200 μ 1，吹打混勻細(xì)胞；加入PE標(biāo)記的⑶14、 CD29、CD31、CD34、CD44、CD54、CD73、CD80、CD86、CD166 抗體以及 FITC 標(biāo)記的 CD45、CD105、 HLA-ABC, HLA-DR、UEA-I抗體各10 μ 1，并設(shè)一管為空白對(duì)照；在4°C下，避光反應(yīng)30min ； PBS洗一次，1500rpm離心IOmin ;直接標(biāo)記的細(xì)胞棄上清，加入200 μ I PBS吹打混勻細(xì)胞， 200 μ I的1%多聚甲醛固定，置4°C待測(cè)，3天內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的表面標(biāo)志，動(dòng)態(tài)觀察第3、6、9、12、15代的細(xì)胞，無明顯改變。不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志即⑶14、⑶31、⑶34 (HSPC及內(nèi)皮細(xì)胞陽性)、⑶45 (白細(xì)胞陽性)、CD54 (ICAM-I)、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、HLA-DR(MHC-II 類分子)持續(xù)陰性，CD29 和 ⑶44 (纖維蛋白和透明脂酸鹽的受體，基質(zhì)細(xì)胞表達(dá))、⑶73 (即SH-3、4)、⑶105 (即SH-2)、 CD166 (間充質(zhì)細(xì)胞表達(dá))、HLA-ABC (MHC-I類分子)和UEA-I (內(nèi)皮細(xì)胞的表面標(biāo)志)持續(xù)為陽性。經(jīng)3代以上傳代后，細(xì)胞成分均一，純度在95%以上。(圖2)3、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胎盤MSC的細(xì)胞周期細(xì)胞長至80%左右融合時(shí)，消化收集細(xì)胞約I X IO6個(gè)，PBS洗一次，加入70%的乙醇固定，4°C待測(cè)。檢測(cè)時(shí)，先離心去乙醇，再用PBS洗一次，加入RNase I 500u，37°C反應(yīng) 30min，PBS洗一次，加入碘化丙啶(PI，終濃度50 μ g/ml) 1ml，室溫避光反應(yīng)20min，上機(jī)檢
測(cè)細(xì)胞DNA含量。經(jīng)測(cè)定第3代和第6代細(xì)胞的DNA含量，細(xì)胞周期分析，G0ZG1期、S期和G2M期所占比例分別為96. 35%,96. 66%, I. 11%>0. 09%，和2. 54%,3. 25%。結(jié)果表明體外培養(yǎng)的細(xì)胞具有典型的干細(xì)胞增殖特點(diǎn)，即只有少數(shù)細(xì)胞處于活躍的增殖期(I. 11%>0. 09% ), 大部分的細(xì)胞處于靜息期(96. 35%>96. 66% ) ο (圖3)4、胎盤MSC牛長曲線的繪制及對(duì)數(shù)牛長期倍增時(shí)間的測(cè)定
取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，消化計(jì)數(shù)，以10% FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液 (2 X 104/ml), 24孔板中每孔接種0. 5ml,37°C,5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)。每天取3復(fù)孔，臺(tái)盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)活細(xì)胞數(shù)，計(jì)算平均值，連續(xù)觀察7天。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸， 繪制細(xì)胞生長曲線。以Patterson公式計(jì)算細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長期的倍增時(shí)間，即Td = Tlg2/ Lg (Nt/No)，Td :倍增時(shí)間(h)，T :細(xì)胞由No增至Nt所用的時(shí)間(h)，N :細(xì)胞數(shù)。通過每天細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算倍增時(shí)間。由細(xì)胞生長曲線可以看出，細(xì)胞在第2-4天處于指數(shù)生長期。根據(jù)公式計(jì)算出第5代細(xì)胞在指數(shù)生長期的倍增時(shí)間分別為22. 6h。(圖4)5、胎盤MSC多向分化潛能的鑒定(I)成骨誘導(dǎo)3代以上MSC，按1父105/孔接種六孔板，放于371、5% CO2、飽和濕度下，MSC培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，換用含10%經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG并加入地塞米松0. I u M、抗壞血酸磷酸鹽50iiM、￠-磷酸甘油10mM，放于37°C、5% CO2、在飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液，共誘導(dǎo)2-4周。堿性磷酸酶染色鑒定成骨細(xì)胞形成，Von Kossa染色鑒定骨結(jié)節(jié)形成。在含10%經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG，加入地塞米松0. I u M、抗壞血酸磷酸鹽50 u M、 ^ -磷酸甘油IOmM培養(yǎng)I周，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，由紡錘形的成纖維細(xì)胞樣變?yōu)槎嘟切?，類似于神?jīng)元細(xì)胞樣，細(xì)胞周邊出現(xiàn)長絲狀突出，并可向周圍延伸。繼續(xù)培養(yǎng)2周以上后，細(xì)胞基質(zhì)中出現(xiàn)鈣化斑，礦化物逐漸出現(xiàn)，并且開始形成多層小結(jié)結(jié)構(gòu)，至培養(yǎng)4周后， 可見明顯鈣化結(jié)節(jié)。2周時(shí)堿性磷酸酶染色呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，達(dá)到95%以上，而未加以誘導(dǎo)的對(duì)照組則大部分為陰性，只有不到5%顯示為弱陽性，表明細(xì)胞已向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。von Kossa染色可將骨結(jié)節(jié)中沉積的鈣染成黑色，誘導(dǎo)組可見大量的黑色骨結(jié)節(jié)，有明顯的立體結(jié)構(gòu)，而對(duì)照組在任何時(shí)間都沒有陽性反應(yīng)。(圖5)(2)成脂肪誘導(dǎo)3代以上MSC，按1父105/孔接種于六孔板，放于371、5% CO2、飽和濕度下，在MSC 培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h后，換用含10%經(jīng)篩選FBS的高糖DMEM，并加入地塞米松I y M、消炎痛 60iiM、IBMX 0. 5mM、胰島素g/ml，放于37°C，5% CO2，飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液， 共誘導(dǎo)2周，油紅染色鑒定脂滴形成。在含10 %經(jīng)篩選FBS的DMEM-HG，加入地塞米松I U M、消炎痛200 y M、IBMX
0.5mM、胰島素10 u g/ml培養(yǎng)3天，細(xì)胞即發(fā)生形態(tài)改變，由紡錘形的成纖維細(xì)胞樣逐漸收縮變短，90%以上細(xì)胞成為立方形或多角形；連續(xù)培養(yǎng)7天，鏡下可見細(xì)胞內(nèi)有微小脂滴出現(xiàn)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，脂滴逐漸增大并融合，至培養(yǎng)2周時(shí)，可見融合成團(tuán)的脂滴充滿整個(gè)細(xì)胞。油紅0染色可見細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的脂肪被特異性染成紅色。(圖6)(3)成軟骨誘導(dǎo)3代以上細(xì)胞，按照每管2X IO5細(xì)胞分裝到15ml聚丙烯離心管，低速離心使細(xì)胞在試管中形成微團(tuán)，在含2. 5% FBS的DMEM-HG中加入胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉各
6.25 u g/ml, BSA I. 25 u g/ml,丙麗酸納 ImM/L,抗壞血酸憐酸 37. 5 u g/ml, TGF- P pOng/ ml，放于37°C、5% CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，每3天半量換液，連續(xù)培養(yǎng)2周。誘導(dǎo)2周后將細(xì)胞微團(tuán)打散涂片，阿辛藍(lán)(Alcian blue)染色可見II型膠原形成細(xì)胞外基質(zhì)呈藍(lán)色，對(duì)照組無藍(lán)染。(圖7)
6、RT-PCR檢測(cè)胎盤MSC多向分化潛能收集誘導(dǎo)后的細(xì)胞，應(yīng)用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，以之為模板進(jìn)行RT-PCR，反轉(zhuǎn)錄以及PCR操作按照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行，引物序列如表I所示。表I. RT-PCR引物序列及其特異性
權(quán)利要求
1.建立胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞庫的方法，該方法包括以下步驟(a)取胎盤小葉，用PBS緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的PBS緩沖液，再在37°C孵育消化；(c)將組織塊用銅網(wǎng)過濾，必要時(shí)研磨以促使過濾；(d)將收集的過濾液離心，分離單個(gè)核細(xì)胞，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，然后在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(e)待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后， 用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；(f)針對(duì)步驟(e)所得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)細(xì)胞活性、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；(g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存；(h)建立包含以上信息的胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(g)的凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述步驟(a)是在產(chǎn)后四小時(shí)之內(nèi)，在無菌條件下將胎盤小葉剪下，用含10%體積胎牛血清(FBS)的PBS緩沖液充分沖洗胎盤小葉去除胎盤小葉中殘留的血液。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述步驟(b)中的組織消化酶是選自下列的一種或多種dispase、胰酶、脫氧核糖核酸酶I (DNase I)、膠原酶IV、透明質(zhì)酸酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，在步驟(b)中，在37°C孵育10 30分鐘，優(yōu)選10 20分鐘，例如10分鐘、15分鐘或20分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，在步驟(d)中，所述MSC培養(yǎng)基是含10%FBS的PBS緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，在步驟(e)中，待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用 MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞60 90%融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，在步驟(f)中，所述細(xì)胞污染檢測(cè)是利用病原學(xué)方法，檢測(cè)細(xì)胞是否受到選自下列的一項(xiàng)或多項(xiàng)的感染乙肝兩對(duì)半、丙肝、艾滋病毒、巨細(xì)胞病毒、EB 病毒和梅毒、HbsAg, HbsAb, HBcAb, HbeAg, HbeAb, HCVAb, HIV_l/2Ab、CMV-IgM 和 EBV-IgA、 TRUST。
8.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，在步驟(h)中，所述數(shù)據(jù)庫中包括與所保存的細(xì)胞所有相關(guān)的數(shù)據(jù)，包括細(xì)胞的生物學(xué)特性檢測(cè)結(jié)果、多向分化潛能鑒定結(jié)果、細(xì)胞分子遺傳學(xué)診斷結(jié)果、胎兒及其父母的詳細(xì)資料。
9.從胎盤中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，該方法包括以下步驟(a)取胎盤小葉，用PBS緩沖液充分沖洗，以去除胎盤中殘留的血液；(b)將胎盤小葉剪成塊狀，加入含有組織消化酶的PBS緩沖液，再在37°C孵育消化；(c)將組織塊用銅網(wǎng)過濾，必要時(shí)研磨以促使過濾；(d)將收集的過濾液離心，分離單個(gè)核細(xì)胞，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，然后在37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(e)待散在細(xì)胞形成克隆后，挑取各克隆細(xì)胞，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)，待細(xì)胞融合后， 用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞；以及任選的下列一個(gè)或多個(gè)步驟(f)針對(duì)步驟(e)所得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)細(xì)胞活性、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型；(g)將步驟(e)所得傳代后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存；(h)建立包含以上信息的胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與步驟(g)的凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。
10.一種胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，其是根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的方法獲得的。
全文摘要
本發(fā)明涉及建立胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞庫的方法。所述方法包括將胎盤小葉用含有組織消化酶的PBS緩沖液消化，分離單個(gè)核細(xì)胞，再用MSC培養(yǎng)基懸浮所獲得的細(xì)胞，然后在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待散在細(xì)胞形成克隆后，用MSC培養(yǎng)基分別培養(yǎng)各克隆細(xì)胞，待細(xì)胞融合后，用胰酶消化傳代，即得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，再針對(duì)所得胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞，檢測(cè)以下項(xiàng)目的至少一項(xiàng)細(xì)胞活性、細(xì)胞污染、遺傳病、HLA-ABC/DR配型，另外將傳代后的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞于液氮中凍存，再建立包含以上信息的胎盤干細(xì)胞的數(shù)據(jù)庫，并使該數(shù)據(jù)庫與凍存細(xì)胞進(jìn)行關(guān)聯(lián)。本發(fā)明方法所涉及的胎盤間充質(zhì)干細(xì)胞純度高。
文檔編號(hào)C12N5/0735GK102586184SQ201210044638
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者張毅, 李詣書, 許曉椿, 陳俊峯, 霍思維 申請(qǐng)人:博雅干細(xì)胞科技有限公司