胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細(xì)胞的制備，特別涉及一種胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是來(lái)源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的一類多能干細(xì)胞，最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有以下特點(diǎn):1)造血支持作用。作為造血微環(huán)境主要細(xì)胞成分一一基質(zhì)細(xì)胞系的干/祖細(xì)胞，MSCs與造血干細(xì)胞共同移植可促進(jìn)造血干祖細(xì)胞的植入；2)免疫調(diào)控。MSCs不表達(dá)⑶34，⑶45，HLA-DR等協(xié)同刺激分子，體外可抑制混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)，對(duì)于預(yù)防和治療異基因造血細(xì)胞移植后引起的移植物抗宿主病，治療自身免疫系統(tǒng)疾病有重要意義；3)基因治療，由于MSCs體外擴(kuò)增、增殖能力強(qiáng)，可以作為基因操作的干細(xì)胞平臺(tái)，加之MSC具有對(duì)腫瘤的靶向性，在腫瘤的基因治療中有著十分誘人的前景；4)多向分化潛能。在體外特定的誘導(dǎo)條件下可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于組織工程。
[0003]目前，從胎盤、臍帶獲得間充質(zhì)干細(xì)胞常用酶消化法，通常是采用膠原酶消化2?3小時(shí)后加入胰酶，這種酶消化方法會(huì)因?yàn)橄煌耆珜?dǎo)致獲得間充質(zhì)干細(xì)胞量少，沒(méi)有分離出的細(xì)胞被浪費(fèi)，增大了細(xì)胞擴(kuò)增的難度，延長(zhǎng)了細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，能夠在很大程度上消化胎盤底蛻膜組織塊，進(jìn)而能夠獲得大量間充質(zhì)干細(xì)胞，增大底蛻膜組織塊利用率，縮短細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟:將I型膠原酶加入底蛻膜組織塊中消化18?20h后加入胰酶繼續(xù)消化，然后進(jìn)行過(guò)濾和離心，獲得胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞；將獲得的胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。由此，I型膠原酶消化底蛻膜組織塊時(shí)間較長(zhǎng)，能夠獲取大量間充質(zhì)干細(xì)胞，增大底蛻膜組織塊利用率，縮短細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)周期，避免了細(xì)胞因多次復(fù)制引起的細(xì)胞質(zhì)量下降以及功能形態(tài)變化，為臨床使用胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞提供了良好的保障。
[0006]在一些實(shí)施方式中，I型膠原酶的加入量是底蛻膜組織塊體積的2倍。由此，I型膠原酶在此用量范圍內(nèi)，能夠滿足較長(zhǎng)的消化時(shí)間。
[0007]在一些實(shí)施方式中，胰酶的加入量是底蛻膜組織塊經(jīng)I型膠原酶消化后總體積的0.2?0.3倍。由此，胰酶在此用量范圍內(nèi)，能夠得到較好的消化效果。
[0008]在一些實(shí)施方式中，胰酶在37°C下消化20?40min。由此，在此時(shí)間范圍內(nèi)胰酶對(duì)底蛻膜組織塊有較好的消化效果。
[0009]在一些實(shí)施方式中，底蛻膜組織塊經(jīng)胰酶消化后加入總體積三倍量生理鹽水，然后經(jīng)過(guò)200目篩網(wǎng)過(guò)濾，ISOOrpm離心lOmin，獲得沉淀細(xì)胞?？色@得含雜質(zhì)較少的細(xì)胞。
[0010]在一些實(shí)施方式中，將生理鹽水加入所述沉淀細(xì)胞，1500rpm離心lOmin，獲得胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞。進(jìn)一步清洗提純獲得基本不含雜質(zhì)的胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0011]在一些實(shí)施方式中，將獲得的胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞以2 X 14個(gè)/cm2密度接種于培養(yǎng)瓶中，進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行第一次增殖培養(yǎng)，以上述密度接種，能夠具有較好的增殖效果。
[0012]在一些實(shí)施方式中，將所述培養(yǎng)瓶置于37°C、飽和濕度、5%的0)2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。在此環(huán)境下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使細(xì)胞具有良好的增殖速度。
[0013]在一些實(shí)施方式中，原代細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞培養(yǎng)到80?90%融合時(shí)，用含重量0.25% EDTA的胰酶消化，將原培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基與細(xì)胞的混合物按1:2?1:5體積比接種到新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細(xì)胞再次培養(yǎng)到80?90%融合時(shí)，收集細(xì)胞。由此，依照上述步驟轉(zhuǎn)移至新培養(yǎng)瓶中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，能夠使細(xì)胞具有良好的增殖速度。
[0014]在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)擴(kuò)增得到的胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞用于項(xiàng)目檢測(cè)或凍存。
[0015]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明的制備方法采用I型膠原酶消化底蛻膜組織塊18?20h后，在加入胰酶繼續(xù)消化。I型膠原酶消化底蛻膜組織塊時(shí)間較長(zhǎng)，能夠獲取大量間充質(zhì)干細(xì)胞，增大底蛻膜組織塊利用率，縮短細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)周期，避免了細(xì)胞因多次復(fù)制引起的細(xì)胞質(zhì)量下降以及功能形態(tài)變化，為臨床使用胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞提供了良好的保障。
【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為A組的組織貼壁法制備間充質(zhì)干細(xì)胞中細(xì)胞培養(yǎng)第9天間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0017]圖2為A組的組織貼壁法制備間充質(zhì)干細(xì)胞中細(xì)胞培養(yǎng)第15天間充質(zhì)干細(xì)胞融合80%?90%形態(tài)圖；
[0018]圖3為B組的胰酶消化法制備間充質(zhì)干細(xì)胞中細(xì)胞培養(yǎng)第20天間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0019]圖4為B組的胰酶消化法制備間充質(zhì)干細(xì)胞中細(xì)胞培養(yǎng)第28天間充質(zhì)干細(xì)胞融合80%?90%形態(tài)圖；
[0020]圖5為C組的胰酶加膠原酶直接消化法制備間充質(zhì)干細(xì)胞中細(xì)胞培養(yǎng)第10天間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0021]圖6為C組的胰酶加膠原酶直接消化法制備間充質(zhì)干細(xì)胞中細(xì)胞培養(yǎng)第22天間充質(zhì)干細(xì)胞融合80%?90%形態(tài)圖；
[0022]圖7為D組本發(fā)明的制備間充質(zhì)干細(xì)胞方法中細(xì)胞培養(yǎng)第3天間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖；
[0023]圖8為D組本發(fā)明的制備間充質(zhì)干細(xì)胞方法中細(xì)胞培養(yǎng)第7天間充質(zhì)干細(xì)胞融合80%?90%形態(tài)圖；
[0024]圖9為D組本發(fā)明的制備間充質(zhì)干細(xì)胞方法中細(xì)胞培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線及對(duì)應(yīng)的細(xì)胞活率圖；
[0025]圖10為D組本發(fā)明的制備間充質(zhì)干細(xì)胞方法中細(xì)胞培養(yǎng)P2代間充質(zhì)干細(xì)胞流式表型圖；
[0026]圖11為D組本發(fā)明的制備間充質(zhì)干細(xì)胞方法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)分化圖；
[0027]圖12為D組本發(fā)明的制備間充質(zhì)干細(xì)胞方法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的成軟骨誘導(dǎo)分化圖；
[0028]圖13為D組本發(fā)明的制備間充質(zhì)干細(xì)胞方法獲得間充質(zhì)干細(xì)胞的成脂肪誘導(dǎo)分化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]以下通過(guò)對(duì)比幾種胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，進(jìn)一步解釋本發(fā)明的有益效果。其中幾種胎盤底蛻膜間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法包括組織塊貼壁法、胰酶消化法、胰酶加膠原酶直接消化法和本發(fā)明的制備方法。其中，I型膠原酶、胰酶、DMEM-F12培養(yǎng)基均采購(gòu)自GIBCO公司。對(duì)比操作包括以下步驟:
[0030]S101、從新鮮足月胎盤組織中剝?nèi)〉淄懩?，用生理鹽水對(duì)底蛻膜組織進(jìn)行清洗。
[0031]S102、盡量瀝干底蛻膜組織表面的生理鹽水，在玻璃皿中剪碎為底蛻膜組織塊，組織塊的體積為Imm3左右，然后平均分成A、B、C、D4組。
[0032]S103、將A、B、C、D4組分別采用組織塊貼壁法、胰酶消化法、胰酶加膠原酶直接消化法和本發(fā)明的方法制備間充質(zhì)干細(xì)胞。制備過(guò)程如下。
[0033]1、A組采用組織塊貼壁法制備間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0034]將A組的底蛻膜組織塊均勻貼于10mm的培養(yǎng)皿中，組織塊之間的距離在I?2cm，晾干貼壁40min后，每個(gè)培養(yǎng)皿中加入1mlDMEM完全培養(yǎng)基，置于37 °C、飽和濕度、5 %的0)2培養(yǎng)箱中進(jìn)行原代細(xì)胞培養(yǎng)。
[0035]待細(xì)胞爬出后，剔除組織塊，繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，如圖1所示，為細(xì)胞培養(yǎng)第9天間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)圖。細(xì)胞培養(yǎng)到80?90%融合時(shí)，用含重量0.25% EDTA的胰酶消化，按
1:2?1:5接種到新培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
[0036]如圖2所示，細(xì)胞培養(yǎng)第15天細(xì)胞再次培養(yǎng)到80?90%融合。此時(shí)收集細(xì)胞，取
2X 15個(gè)用于流式檢測(cè)；取5X 10 3個(gè)/cm2接種于培養(yǎng)孔板中，進(jìn)行成骨、成脂肪、成軟骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)；剩余細(xì)胞按2X 16個(gè)/ml永久凍存于液氮中。
[0037]2、B組采用胰酶消化法制備間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0038]將B組的底蛻膜組織塊放入15ml離心管中，且加入組織塊體積1/4的