專利名稱：胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表面差異膜蛋白的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種干細(xì)胞差異膜蛋白的檢測方法，特別涉及胎盤和臍帶來源的間充 質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCSs)表面差異膜蛋白的檢測方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，在一定條件下， 它可以分化成多種功能細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCSs)是干細(xì)胞家族的重要成員，最早來源 于骨髓，因其具有強大的增殖能力和多向分化潛能、造血支持和促進(jìn)干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控 等特點使其在組織工程、細(xì)胞治療和基因治療等方面具有廣泛的臨床應(yīng)用前景。近年來，隨 著人們對間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及功能的深入研究，已成功地從骨髓、外周血、肌肉、脂 肪、臍血、臍帶及胎盤等組織中分離并鑒定出MSCSs。其中，胎盤來源MSC^s易分離培養(yǎng)，增 殖迅速，可以分化為3個胚層來源的細(xì)胞系，并有向傷處遷移的能力；同時胎盤在臨床上為 廢棄物，取材幾乎不受限制，且不涉及倫理問題；因此是很好的實驗材料和細(xì)胞治療載體。 而臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞，迄今的研究表明，它不但能夠成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想 替代物，而且具有更大的應(yīng)用潛能，它表達(dá)多種胚胎干細(xì)胞的特有分子標(biāo)志，具有分化潛力 大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制、易于工業(yè)化制備等特征， 因此也極具具臨床應(yīng)用前景。因此，本發(fā)明選擇這兩種細(xì)胞作為被檢測對象。骨髓來源的MSCS 能夠表達(dá) CD^、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166、基質(zhì)細(xì)胞 抗原1 (Stro. 1)、干細(xì)胞抗原1 1)、CXC類趨化因子受體4 (CXCR-4)和CXCR. 6等表面 標(biāo)志,但是不表達(dá)造血細(xì)胞表面標(biāo)志⑶1 lb、CD14、CD31、CD33、CD34、CD133和CD45。胎 盤來源的MSCS表達(dá)⑶四、CD44和CD105，不表達(dá)CD;34、CD45、CD19。臍帶來源的MSCS表達(dá) CD13、CD29、CD44、CD105,不表達(dá) CD34、CDlla、CD14、CD31、CD45。但胎盤和臍帶 MSCS 表面 標(biāo)志，不同文獻(xiàn)報到不盡相同。換而言之，骨髓、胎盤和臍帶MSCS都沒有明確的細(xì)胞表面標(biāo) 志。臍帶作為連接胎兒和胎盤的管狀結(jié)構(gòu)，其分離出的MSCS和胎盤MSCS表面表達(dá)的差異 有何不同，目前還沒有資料標(biāo)明，但這種差異在發(fā)育生物學(xué)上有著重要意義，本專利就是采 用一種新的技術(shù)手段，來揭示胎盤和臍帶中分離出的MSCS表面蛋白表達(dá)差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種間充質(zhì)干細(xì)胞表面差 異膜蛋白的檢測方法，該方法可用于檢測胎盤、臍帶兩種不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表面的 特殊的膜蛋白標(biāo)志。雙向凝膠電泳是蛋白質(zhì)組研究中的主流技術(shù)，但該技術(shù)的重復(fù)性和敏感 性不佳，且缺乏對蛋白質(zhì)點的精確定量，近年來出現(xiàn)的雙向熒光差異顯示凝膠技術(shù) (two-dimensional difference gel electrophoresis, 2D-DIGE)克月艮了傳統(tǒng)的雙向 疑膠 電泳技術(shù)的上述缺點，2D-DIGE在傳統(tǒng)雙向凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合多重?zé)晒夥治龅姆?法，在同一塊膠上分離多個由不同熒光標(biāo)記的樣品，并第一次引入了內(nèi)標(biāo)的概念，軟件自動根據(jù)每個蛋白點的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的，極 大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性，可靠性和重復(fù)性，避免了使用不同凝膠時在操作上的偶然性和 不平行性。因此我們我們通過雙向熒光差異凝膠電泳對不同來源的膜蛋白進(jìn)行分析，來研究 胎盤和臍帶MSCS表面差異蛋白，在此基礎(chǔ)上一方面可制備單抗，進(jìn)行MSCS的鑒定，另一方 面，揭示兩者在發(fā)育生物學(xué)上的關(guān)系。為解決技術(shù)問題，本發(fā)明是通過如下的技術(shù)方案實現(xiàn)的
提供一種胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表面差異膜蛋白的檢測方法，包括以下步驟
(1)間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
如間充質(zhì)干細(xì)胞為胎盤來源，則取新鮮胎盤組織剪碎，膠原酶消化，收集消化得到的 細(xì)胞懸液，使用Ficoll分離液進(jìn)行密度梯度離心，收集白膜層，洗兩遍，收集細(xì)胞，常規(guī)培 養(yǎng)；
如間充質(zhì)干細(xì)胞為臍帶來源，則取新鮮臍帶組織，剝離血管，剪碎，膠原酶消化，收集 消化得到的細(xì)胞懸液，離心，收集細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)；
所有間充質(zhì)干細(xì)胞均培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用于移植；
(2)間充質(zhì)干細(xì)胞膜蛋白的提取
反復(fù)凍融法使得細(xì)胞破碎，然后通過梯度離心得到含有膜蛋白的組分；
(3)雙向熒光差異凝膠電泳法獲取膜蛋白凝膠圖譜
通過雙向熒光差異凝膠電泳法(2D-DIGE)，得到Cy2、Cy3及Cy5熒光素標(biāo)記的不同種類 的膜蛋白凝膠圖譜，采用DeCyder 2D圖像分析軟件進(jìn)行分析，識別兩組間差異表達(dá)的蛋白 質(zhì)點；
(4)質(zhì)譜分析及驗證
選取差異蛋白質(zhì)點，膠內(nèi)酶解后進(jìn)行質(zhì)譜分析，并對網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫查詢，鑒定差異蛋白 質(zhì)，尋找不同來源干細(xì)胞的特殊表面標(biāo)志，然后采用Western-Blot驗證。本發(fā)明的有益效果在于
本發(fā)明首次將2D-DIGE用來對干細(xì)胞膜表面特殊差異表面標(biāo)志的檢測，可以在同一塊 凝膠上對不同樣品中蛋白質(zhì)進(jìn)行定量比較分析，在每塊凝膠中加入了內(nèi)標(biāo)，DIA和BVA軟件 可以自動地根據(jù)每個蛋白質(zhì)點的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，最大程度上降低了不同批次膠 與膠之間的誤差，反應(yīng)了蛋白質(zhì)的真實改變程度，降低了假陽性率及假陰性率。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例子，對本發(fā)明的技術(shù)方案詳細(xì)描述。(一)間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞的分離培養(yǎng) 胎盤MSCSs的分離培養(yǎng)
無菌條件下將胎盤用預(yù)熱的PBS充分洗滌去血漬后，剪碎，剪成盡可能小的組織塊，置 于0. 1%四型膠原酶中消化，37°C消化，30min,過濾，用PBS沖洗，收集消化液和沖洗液，1200 rpm離心10 min，收集細(xì)胞沉淀，用5mlPBS重懸，加至5ml含有Ficoll-I^aqueTM PLUS人淋 巴細(xì)胞分離液(其相對密度為1.077g/L)上，進(jìn)行梯度離心(20°C，2000rpm，25min)。離心 后，吸取管中白膜層，PBS洗滌兩次，收集細(xì)胞。MSCS專用培養(yǎng)基重懸，接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37°C、5%0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中，行常規(guī)培養(yǎng)及傳代。臍帶MSCSs的分離培養(yǎng)
無菌條件下將臍帶用預(yù)熱的PBS充分洗滌去血漬后，剝離臍動靜脈血管，剪成Icm3見 方的小塊，置于0. 1%四型膠原酶中消化，37°C消化，lh，過濾，用PBS沖洗，收集消化液和沖 洗液，1200 rpm，離心10 min，棄上清，PBS洗滌細(xì)胞沉淀。MSCS專用培養(yǎng)基重懸，接種于6 孔培養(yǎng)板中，置于37°C、5%0)2飽和濕度培養(yǎng)箱中，行常規(guī)培養(yǎng)及傳代。(二)分離細(xì)胞膜蛋白的方法
1、冰上刮下細(xì)胞后將細(xì)胞溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液A (ImMkcl, 5mMNacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, ImM DTT, 0. 5 μ g/ml Leup印tin, 20 μ M pmsf (PH=7. 4))中，于室溫與液 氮罐中反復(fù)凍融2次。2、5000轉(zhuǎn)4度離心，驅(qū)除核及未裂解的細(xì)胞。3、取上清12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液 B (ImMkcl, 5mMNacl, 3mM Mgcl2, 50mM Hepes, ImM DTT,0.5 μ g/ml Leupeptin,20 μ M PMSF (ΡΗ=7· 4))中。4、12000轉(zhuǎn)4度離心10分鐘取沉淀溶于有蛋白酶抑制劑的緩沖液C (0.5 μ g/ml Leupeptin, 20 μ M PMSF, 50mMTris-cl (ΡΗ=7. 0))中提取后測蛋白濃度，SDS-PAGE 電泳，分裝 后-20度保存?zhèn)溆谩?三)膜蛋白濃度測定
采用GE公司專門針對蛋白質(zhì)組學(xué)研究設(shè)計的蛋白質(zhì)抽提2D Quant Kit定量試劑盒。 其基本原理是將蛋白質(zhì)沉淀后，去除裂解液，再用含銅離子的溶液重溶蛋白質(zhì)沉淀，未與蛋 白質(zhì)結(jié)合的銅離子可與顯色工作液反應(yīng)而顯色，顯色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成反比。(四)2D_DIGE
1、內(nèi)標(biāo)樣品制備2個樣品(N1、N2)各取50 μ g，體積10μ 1，加入到同一個印pendorf 管里，震蕩混勻，離心。然后50 μ g每管分裝成2管。2、儲存液的制備把染料從-20°C的冰箱中取出，輕旋，室溫靜置5min，吸5μ 1 DMF至染料管中，震蕩離心，配制成lnmol/μ 1儲存液。3、工作液的制備首先取1.8μ 1 DMF到印pendorf管，然后吸取1.2μ 1儲存液到 一個印pendorf管中，震蕩離心即配成400 pmol/μ 的工作液。避光保存。4、樣品標(biāo)記將每1 μ 1工作液和50 μ g蛋白的比例進(jìn)行熒光標(biāo)記。整個操作中避 光進(jìn)行。冰上避光放置30 min，每管蛋白中加入Ιμ 賴氨酸終止標(biāo)記反應(yīng)
5、樣品準(zhǔn)備將分別用Cy2、Cy3和Cy5標(biāo)記的樣品加入到同一印pendorf管中，震蕩混 勻，短暫離心。避光操作。每塊膠上加入等體積的2X上樣緩沖液(7mol/L尿素，2mmol/L 硫脲，4%CHAPS，65mmol/L DTT)冰上靜止10 min，準(zhǔn)備上樣。 表1標(biāo)記成分
權(quán)利要求
1.胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表面差異膜蛋白的檢測方法，包括以下步驟(1)間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)取新鮮胎盤組織剪碎，膠原酶消化，收集消化得到的細(xì)胞懸液，使用Ficoll分離液進(jìn) 行密度梯度離心，收集白膜層，洗兩遍，收集細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)；取新鮮臍帶組織，剝離血管，剪碎，膠原酶消化，收集消化得到的細(xì)胞懸液，離心，收集 細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)；所有間充質(zhì)干細(xì)胞均培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用于移植；(2)間充質(zhì)干細(xì)胞膜蛋白的提取反復(fù)凍融法使得細(xì)胞破碎，然后通過梯度離心得到含有膜蛋白的組分；(3)雙向熒光差異凝膠電泳法獲取膜蛋白凝膠圖譜通過雙向熒光差異凝膠電泳法，得到Cy2、Cy3及Cy5熒光素標(biāo)記的不同種類的膜蛋白 凝膠圖譜，采用DeCyder 2D圖像分析軟件進(jìn)行分析，識別組間差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點；(4)質(zhì)譜分析及驗證選取差異蛋白質(zhì)點，膠內(nèi)酶解后進(jìn)行質(zhì)譜分析，并對MareixScience公司的Mascot 網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫查詢，鑒定差異蛋白質(zhì)，尋找不同來源干細(xì)胞的特殊表面標(biāo)志，然后采用 Western-Blot 驗證。
全文摘要
本發(fā)明涉及干細(xì)胞差異膜蛋白的檢測方法，旨在提供一種胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞表面差異膜蛋白的檢測方法。該方法包括間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)、間充質(zhì)干細(xì)胞膜蛋白的提取、雙向熒光差異凝膠電泳法獲取膜蛋白凝膠圖譜、質(zhì)譜分析及驗證。本發(fā)明首次將2D-DIGE用來對干細(xì)胞膜表面特殊差異表面標(biāo)志的檢測，可以在同一塊凝膠上對不同樣品中蛋白質(zhì)進(jìn)行定量比較分析，在每塊凝膠中加入了內(nèi)標(biāo)，DIA和BVA軟件可以自動地根據(jù)每個蛋白質(zhì)點的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，最大程度上降低了不同批次膠與膠之間的誤差，反應(yīng)了蛋白質(zhì)的真實改變程度，降低了假陽性率及假陰性率。
文檔編號G01N27/64GK102095777SQ20111000189
公開日2011年6月15日 申請日期2011年1月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月6日
發(fā)明者俞炯, 曹紅翠, 李蘭娟 申請人:浙江大學(xué)