專利名稱：脂肪酶smg1在單脂肪酸甘油酯制備中的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及脂肪酶SMGl在單脂肪酸甘油酯制備中的應用。
背景技術(shù)：
單脂肪酸甘油酯(簡稱單甘酯)，英文名monoglyceride，是一類重要的非離子型表面活性劑，一個親油的長鏈烷基和兩個親水的羥基使單甘酯具有良好的表面活性。單甘酯被作為乳化劑廣泛應用于食品和乳制品工 業(yè)中，作為組織改良劑應用于化妝品、牙膏和護發(fā)素等日用化學品中，還可作為防凍劑用于面包制作中。近年發(fā)現(xiàn)，單不飽和脂肪酸甘油酯可望進人化學保鮮劑行列。此外，單甘酯在醫(yī)藥、化妝品、塑料、紡織和高分子加工等行業(yè)中也有著重要的應用，如含有多不飽和脂肪酸(CLA、EPA、DHA)的單甘醋對心血管疾病具有預防作用。目前，單甘酯的合成方法有很多，在工業(yè)上應用最廣泛的方法是化學催化法合成單甘脂，主要采用甘油醇解法和直接酯化法，目前已經(jīng)廣泛用于飽和脂肪酸單甘脂的生產(chǎn)。生物酶法合成單甘脂是一種新的工藝方法，其具有催化條件溫和、綠色無污染的特點。專利CN200710055632. 8公開了一種固定化脂肪酸催化合成a -亞麻酸單甘酯的方法，該方法采用經(jīng)特定工藝固定化的假絲酵母脂肪酶和銅綠假單胞菌脂肪酸為催化劑。脂肪酶均具有合成單甘酯的能力，常見的商品化的脂肪酶通常包括來源于根酶屬、曲霉屬、毛酶屬、細菌和酵母菌來源的微生物脂肪酶、胰脂肪酶或酯酶。但是絕大多數(shù)脂肪酶催化合成不飽和脂肪酸單甘酯的過程中都伴隨有大量的甘油二酯和甘油三酯的產(chǎn)生，影響產(chǎn)品的分離和純度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種脂肪酶SMGl在單脂肪酸甘油酯制備中的應用，生成更高純度的單甘脂。本發(fā)明方法采用對單甘酯和甘油二酯具有很強水解活性，但是對甘油三酯不具有水解活性的脂肪酶為催化劑，催化脂肪酸和甘油酯化，可以生成更高純度的單甘脂。本發(fā)明者進行了深入研究,意外地發(fā)現(xiàn),來源于ifeJaMezia WoAiasa的SMGl (對應的DNA序列見GenBank登陸號DD210404)是一種選擇性水解偏甘油酯的脂肪酶，即對單甘酯和甘油二酯具有很強水解活性，但是對甘油三酯不具有水解活性。利用該脂肪酶的特殊性質(zhì)，可以催化脂肪酸和甘油合成高純度的單甘脂。本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)。脂肪酶SMGl在單脂肪酸甘油酯制備中的應用，編碼所述脂肪酶SMGl的DNA序列的 GenBank 登陸號為 DD210404。具有所述脂肪酶SMGl活性的蛋白質(zhì),其氣基酸序列如SEQ ID N0:19所不。所述單脂肪酸甘油酯制備，具體包括以下步驟(1)在無溶劑體系中，將甘油、月旨肪酸供體和脂肪酶SMGl混合均勻，反應溫度為5 50°C，反應2 48h ;每克反應底物的脂肪酶SMGl的加入量是50U/g 500U/g ；(2)反應產(chǎn)物經(jīng)蒸餾獲得單脂肪酸甘油脂。所述反應底物中的含水量是i°/rio%。所述反應溫度為24 15°C。所述甘油與脂肪酸供體的摩爾比為1:廣1:5。所述脂肪酸供體選自碳原子數(shù)為C2 C22的脂肪酸中的一種或兩種以上的混合物。所述脂肪酶SMGl是通過克隆來源于JfeJa1S1Sezia的基因序列，并在畢赤酵母X33中的表達得到的，所述基因序列的Gen Bank登陸號為DD210404。所述蒸餾采用3段蒸餾，第一級溫度為8(TlO(rC ;第二級溫度為150 180°C ;第三級溫度為190 220°C。所述脂肪酶SMGl的活力是橄欖油水解活力；
上述脂肪酶的活力測定采用堿滴定法。脂肪酶酶活力單位定義為每分鐘釋放出Iumol脂肪酸的酶量定義為I個脂肪酶活力單位(U)。具體方法為取三個100 mL錐形瓶，分別向空白瓶A和樣品瓶B、C中，各加入橄欖油乳化液4 mL和PH6. 0的磷酸緩沖溶液
5mL，再向A瓶中加入95 %乙醇15 mL，于恒溫槽中20°C水浴預熱5 min。將一定質(zhì)量的酶制劑溶解在緩沖液中配成酶液，分別向三個瓶中各加入待測酶液ImL (由于空白瓶中預先加入了乙醇，酶液加入后脂肪酶將立即失活)，立即混勻計時，在預熱溫度下反應10 min后，向樣品瓶中加入15mL 95%乙醇終止反應。向三個錐形瓶中各滴加3 5滴酚酞作為指示劑，用0. 05mol/L的NaOH標準溶液滴定水解產(chǎn)生的游離脂肪酸。上述脂肪酶催化反應中，脂肪酶SMGl可以是酶粉，也可以是固定化的。研究表明，無機類載體固定化ifeJaMezia globosa脂肪酶具有較好的表觀活性,在無溶劑體系中,催化甘油和脂肪酸供體反應后，單甘酯含量可達70%以上。固定化脂肪酶可重復使用多次，具有較好的穩(wěn)定性。一般情況下，優(yōu)選添加基于脂肪酸供體質(zhì)量240U/g 320U/g的脂肪酶，可以使得酯化反應可以在24h內(nèi)達到平衡，減少生產(chǎn)成本。上述脂肪酶催化反應中，更適合的溫度為5 15°C。在無溶劑反應體系中，通過控制反應體系在較低的溫度下，可以使得首先生成的單甘酯在低溫下凝固，從而很難參與甘油二酯的合成，這樣有利于單甘酯的積累。當溫度超過15°C時，生成的單甘酯逐漸會向甘油二酯轉(zhuǎn)化，影響產(chǎn)物的純度；當溫度超過35°C時，會導致該脂肪酶活性的減弱。上述脂肪酶催化反應中，更適合的甘油和脂肪酸供體的摩爾比是1: 3 1: 5。當甘油和脂肪酸供體的摩爾比小于1:5時，隨著甘油量的增加，反應的酯化速率也隨之增大，之后再增加甘油量對酯化率的貢獻不大。由于甘油量的增加會提高生產(chǎn)成本，故而需要根據(jù)實際的反應情況選擇甘油和脂肪酸供體的摩爾比。上述脂肪酶催化反應中，更適合的加水量是基于脂肪酸供體質(zhì)量19T5%的水分。因為微量的水分是保證脂肪酶活性所必需，但不宜超過5%，過量的水會導致酶中心內(nèi)部水簇的生成，改變酶的活性結(jié)構(gòu)，使酶活性降低。然而反應中會伴隨水的產(chǎn)生，水積累還會促使反應向生產(chǎn)甘油二酯的方向進行，不利于單甘酯的生成，所以要不斷除去反應過程中生成的水。脫水方式優(yōu)選采用真空脫水，脫水屬于常規(guī)的操作，具體操作條件不作限定，如，可以在反應流程中安裝薄膜蒸發(fā)器或噴霧蒸發(fā)器用于脫水。上述脂肪酶催化反應完成后，生成的產(chǎn)物包括甘油二酯、脂肪酸、單甘酯和少量甘油，需要經(jīng)過步驟(2)對步驟(I)中酯化產(chǎn)物進行分離，單甘酯的分離一般采用分子蒸餾或短程蒸餾，蒸餾的一般流程分為3段蒸餾，第一級脫氣和脫水，溫度一般為8(T10(TC左右；第二級脫除大部分脂肪酸和甘油，溫度一般為150 180°C ;第三級分離出單甘酯，溫度一般為190 220°C。分離完成后單甘酯的含量可達80%以上，回收率在60% 80%。盡管本處給出了一般的操作參數(shù)，實際實施時的蒸餾操作可不受本描述的限制。根據(jù)實際需要，可以增加分子蒸餾的級數(shù)，根據(jù)真空度的大小，可以靈活調(diào)整蒸餾溫度。產(chǎn)物中單甘酯的純度可以通過HPLC檢測。上述脂肪酶催化反應中，脂肪酸供體為具有C2 C22個碳原子的脂肪酸中的一種或一種以上的混合物。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點 及有益效果。( I)采用脂肪酶作為催化劑，條件溫和，易于實現(xiàn)，相對于化學合成法，更環(huán)保、節(jié)倉泛。(2)采用來源于JfeJa1S1Sezia globosa脂肪酶SMGl作為生物催化劑,制備單脂肪酸甘油酯，酯化能力強，產(chǎn)物組分單一，易于分離。(3)采用脂肪酶SMGl在低溫下催化合成的單脂肪酸甘油酯，生成產(chǎn)物顏色淺、得率高。畢赤酵母X33購買于invitrogen公司，載體pGAPZ a A購買于invitrogen公司，載體pBluescript購買于stratagene公司，可以在代理商廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司購買的到。
具體實施例方式上述脂肪酶催化反應采用的脂肪酶SMG1,是通過克隆來源于JfeJa1S1Sezia globosa的中的一段基因序列(GenBank accession number DD210404),并在畢赤酵母X33中的表達得到的。具體制備方法如下
Malassezia WoAiosa脂肪酶SMGl的制備方法采用現(xiàn)有技術(shù)已經(jīng)公開的方法,例如文獻“優(yōu)化畢赤酵母X33重組表達球形馬拉色菌脂肪酶LIP1”報道的方法。iWassezia脂肪酶SMGl基因去信號肽后通過兩步重疊PCR法獲得。利用DNAworks把基因拆分為18條引物(序列如SEQ ID N0:1 SEQ ID N0:18所示)，前面8段和后面10段分別合成大片段，最后兩條大片段合成全長基因。把它克隆到pBluescript載體，得到pBluescript-SMGl，測序驗證堿基序列，突變位點利用定點覆蓋PCR法進行修復。序列正確的基因克隆到畢赤酵母穿梭表達載體pGAPZ a A上，得到pGAPZ a A-SMGl。質(zhì)粒pGAPZ a A- SMGI經(jīng)過限制性內(nèi)切酶AvrII線性化之后，電擊轉(zhuǎn)化pichiapas tor is X33。挑取陽性克隆接到 3ml YPD (含 100 u g/ml Zeocin)中，在 30°C，200rpm條件下培養(yǎng)24h，然后接種到100ml YPD中，相同條件下培養(yǎng)72h。發(fā)酵液經(jīng)4°C，12，OOOrpm離心4min去除酵母細胞。發(fā)酵液經(jīng)濃縮凍干即得到SMGl脂肪酶。得到的脂肪酶SMGl氨基酸序列如SEQ ID NO 19所示。實施例I
將摩爾比為1:5的共軛亞油酸(CLA)和甘油，以及基于反應底物總質(zhì)量1%的水，裝入具塞三角瓶中混合均勻，并置于轉(zhuǎn)速為400rpm的磁力攪拌器上反應，加入基于反應底物總質(zhì)量320U/g的脂肪酶SMGl，通過培養(yǎng)箱控制在5°C下反應24h。反應結(jié)束后，反應產(chǎn)物進行分子蒸餾分離除去其中的脂肪酸和甘油二酯得到以單甘酯為主要成分的產(chǎn)物。反應產(chǎn)物組成、分子蒸餾后的MAG純度和回收率見表I和表2。實施例2
采用加酶量為500U/g，其余操作條件同實施例I。反應產(chǎn)物組成、分子蒸餾后的MAG純度和回收率見表I和表2。實施例3
采用摩爾比為1:3的共軛亞油酸(C LA)和甘油，采用加酶量為50U/g，其余操作條件同實施例I。反應產(chǎn)物組成、分子蒸餾后的MAG純度和回收率見表I和表2。實施例4
采用摩爾比為1:1的共軛亞油酸(CLA)和甘油，其余操作條件同實施例I。反應產(chǎn)物組成、分子蒸餾后的MAG純度和回收率見表I和表2。實施例5
采用加水量為5%，其余操作條件同實施例I。反應產(chǎn)物組成、分子蒸餾后的MAG純度和回收率見表I和表2。實施例6
采用加水量為10%，其余操作條件同實施例I。反應產(chǎn)物組成、分子蒸餾后的MAG純度和回收率見表I和表2。實施例7
采用反應溫度為15°C，其余操作條件同實施例I。反應產(chǎn)物組成、分子蒸餾后的MAG純度和回收率見表I和表2。實施例8
采用反應溫度為50°C，其余操作條件同實施例I。反應產(chǎn)物組成、分子蒸餾后的MAG純度和回收率見表I和表2。實施例9
采用反應時間為48h，其余操作條件同實施例I。反應產(chǎn)物組成、分子蒸餾后的MAG純度和回收率見表I和表2。實施例10
將摩爾比為1:5的丁酸和甘油，以及基于反應底物總質(zhì)量1%的水，裝入具塞三角瓶中混合均勻，并置于轉(zhuǎn)速為400rpm的磁力攪拌器上反應，加入基于反應底物總質(zhì)量320U/g的脂肪酶SMGl，通過培養(yǎng)箱控制在5°C下反應。反應24h后，CLA的轉(zhuǎn)化率達到了 85. 9%，其中MAG占73. 1%。分子蒸餾后得到的MAG純度和回收率分別為80. 1%和72. 3%。實施例11
將摩爾比為1:5的油酸和甘油，以及基于反應底物總質(zhì)量1%的水，裝入具塞三角瓶中混合均勻，并置于轉(zhuǎn)速為400rpm的磁力攪拌器上反應，加入基于反應底物總質(zhì)量320U/g的脂肪酶SMGl，通過培養(yǎng)箱控制在5°C下反應。反應24h后，CLA的轉(zhuǎn)化率達到了 88. 3%，其中MAG占76. 7%。分子蒸餾后得到的MAG純度和回收率分別為81. 3%和71. 4%。實施例12
將摩爾比為1:5的共軛亞油酸(CLA)和甘油，以及基于反應底物總質(zhì)量1%的水，裝入具塞三角瓶中混合均勻，并置于轉(zhuǎn)速為400rpm的磁力攪拌器上反應，加入基于反應底物總質(zhì)量320U/g的脂肪酶SMGl，通過培養(yǎng)箱控制在15°C下反應，反應過程中不斷抽真空。24h后，CLA的轉(zhuǎn)化率達到了 86. 4%，其中MAG占75. 8%。分子蒸餾后得到的MAG純度和回收率分別為80. 5%和68. 4%o實施例13
采用無機類載體固定化后的脂肪酶SMGl進行反應，將摩爾比為1:5的共軛亞油酸(CLA)和甘油，以及基于反應底物總質(zhì)量1%的水，裝入具塞三角瓶中混合均勻，并置于轉(zhuǎn)速為400rpm的磁力攪拌器上反應，加入基于反應底物總質(zhì)量320U/g的固定化脂肪酶SMGl，通過培養(yǎng)箱控制在5°C下反應。24h后，C LA的轉(zhuǎn)化率達到了 80. 2%，其中MAG占73. 8%。分子蒸餾后得到的MAG純度和回收率分別為80. 8%和67. 6%。表I
權(quán)利要求
1.脂肪酶SMGl在單脂肪酸甘油酯制備中的應用，其特征在于，編碼所述脂肪酶SMGl的DNA序列的GenBank登陸號為DD210404。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應用，其特征在于，具有所述脂肪酶SMGl活性的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的應用，其特征在于，所述單脂肪酸甘油酯制備，具體包括以下步驟 (O在無溶劑體系中，將反應底物、水和脂肪酶SMGl混合均勻，反應溫度為5 50°C，反應2 48h ;所述反應底物為甘油和脂肪酸供體，每克反應底物的脂肪酶SMGl的加入量是50U/g 500U/g，水的加入量為反應底物質(zhì)量的1% 10% ； (2)反應產(chǎn)物經(jīng)蒸餾獲得單脂肪酸甘油脂。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，所述所述反應溫度為24 15°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在干，所述甘油與脂肪酸供體的摩爾比為1:1 1:5。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述脂肪酸供體選自碳原子數(shù)為C2 C22的脂肪酸中的ー種或兩種以上的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應用，其特征在于，所述脂肪酶SMGl是通過克隆GenBank登陸號為DD210404的基因序列，并在畢赤酵母X33中的表達得到。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應用，其特征在干，所述蒸餾采用3段蒸餾，第一級溫度為80 100で；第二級溫度為150 180°C ;第三級溫度為190 220°C。
全文摘要
本發(fā)明涉及脂肪酶SMG1在單脂肪酸甘油酯制備中的應用，包括以下步驟(1)將甘油、脂肪酸供體，采用一種來源于Malasseziaglobosa偏甘油酯水解酶SMG1作催化劑，添加1%~5%的水，5～15℃催化甘油和脂肪酸供體反應；(2)分離，將(1)得到的產(chǎn)物除去脂肪酶、甘油，再分離除去甘油二酯、脂肪酸后，得到單脂肪酸甘油酯。本發(fā)明采用甘油和脂肪酸供體作原料，通過脂肪酶SMG1低溫下催化甘油和脂肪酸供體的酯化反應生產(chǎn)單脂肪酸甘油酯，生成產(chǎn)物中副產(chǎn)物少、顏色淺、得率高。
文檔編號C12N9/20GK102676592SQ20121004907
公開日2012年9月19日 申請日期2012年2月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月29日
發(fā)明者侯淑琳, 孫麗娟, 徐達, 楊博, 王永華, 陳華勇 申請人:華南理工大學