專(zhuān)利名稱(chēng)：一種低脂奶的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別是涉及一種利用轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物生產(chǎn)低脂奶的方法。
背景技術(shù)：
脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase, LPL)是將血衆(zhòng)乳糜微粒和極低密度脂蛋白中的甘油三酯水解為甘油和游離脂防酸反應(yīng)的限速酶，其與機(jī)體肥胖與否密切相關(guān)，在血漿脂蛋白的運(yùn)輸過(guò)程和能量代謝方面也起著重要作用。它主要由脂肪細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞等實(shí)質(zhì)細(xì)胞分泌，在泌乳期的乳腺組織中亦有合成，并且乳腺組織是LPL在各物種中表達(dá)的保守位點(diǎn)。LPL是已報(bào)告的基因突變最豐富的蛋白質(zhì)之一，至今已達(dá)143種突變，且90%以上的突變位點(diǎn)均位于功能區(qū)。LPL基因的突變有可能影響其催化功能，LPL活性或量的改變及功能的失衡與脂代謝紊亂(高甘油三酯血癥、低高密度脂蛋白血癥)、動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病、肥胖等一系列臨床癥狀有關(guān)。此外，LPL基因已作為動(dòng)物脂肪代謝和沉積以及畜禽肉質(zhì)研究的重要基因，與畜禽瘦肉率的提高，調(diào)節(jié)動(dòng)物的體重，影響肉的風(fēng)味等方面有著密切關(guān)系。近年來(lái)LPL成為研究的熱點(diǎn)，構(gòu)建了各種用于研究其功能的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，其中包括全身表達(dá)的，或分別在脂肪、肌肉、心臟、肝等組織中特異表達(dá)的，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)LPL在乳腺中特異表達(dá)的相關(guān)報(bào)道。隨著人們生活水平的提高，對(duì)健康優(yōu)質(zhì)奶品的要求也越來(lái)越高，人們更加關(guān)注牛奶中的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，而希望牛奶中所含的脂肪更少。但是目前市場(chǎng)上的脫脂牛奶，在脫脂的過(guò)程中脂溶性的維生素也會(huì)被除去，主要是維生素A和維生素D，影響了人體對(duì)鈣質(zhì)的吸收，而且如果完全脫除牛奶中的脂肪，會(huì)破壞其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，影響牛奶的口感和風(fēng)味。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)基因工程技術(shù)，制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，并利用該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)低脂奶。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種低脂奶的生產(chǎn)方法，其是將編碼人源脂蛋白脂酶的基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物中，并利用該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)低脂奶。優(yōu)選地，前述方法是將編碼人源脂蛋白脂酶的基因通過(guò)顯微注射法、體細(xì)胞克隆法或精子載體法等方法轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物中，并利用該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)低脂奶。其中，人源脂蛋白脂酶的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。優(yōu)選地，編碼上述人源脂蛋白脂酶的基因序列如SEQ ID No. 2所不。前述的方法，所述哺乳動(dòng)物為牛、羊、豬、馬、兔、鹿、狗等。本發(fā)明還提供含有編碼人源脂蛋白脂酶的基因的乳腺特異表達(dá)載體。優(yōu)選的出發(fā)載體為PBC1。
本發(fā)明還提供含有上述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞。本發(fā)明還提供一種制備克隆胚胎的方法，其以上述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過(guò)核移植技術(shù)獲得克隆胚胎。本發(fā)明進(jìn)一步提供一種制備轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其是將上述方法制備的克隆胚胎通過(guò)非手術(shù)法移入家畜子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因家畜。本發(fā)明利用構(gòu)建LPL乳腺特異表達(dá)載體，制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，特別是轉(zhuǎn)基因奶?；蚰躺窖?，生產(chǎn)出乳脂率顯著減低的奶制品，對(duì)于提高奶制品的應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。


圖I為線(xiàn)性化且去除了 pBCl原核載體骨架結(jié)構(gòu)部分后的特異性人LPL乳腺表達(dá)載體。
圖2為NotI和SalI雙酶切表達(dá)載體pBC_hLPL線(xiàn)性化后的載體凝膠電泳結(jié)果，其中，M為λ /HindIII分子量標(biāo)準(zhǔn)，I和2為線(xiàn)性化后的載體片段。圖3為轉(zhuǎn)基因小鼠制備流程。圖4為PCR檢測(cè)H)代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)果，其中，M為Ikb梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，轉(zhuǎn)基因小鼠基因組分別為11、16、17、21、25、27、31和37，WT為陰性對(duì)照，P為陽(yáng)性質(zhì)粒。圖5為Southern blotting檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)果,其中,M :為Ikb梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，WT為野生型小鼠對(duì)照，P1、P5、P10分別為相當(dāng)于1、5、10個(gè)拷貝的陽(yáng)性質(zhì)粒對(duì)照雜交結(jié)果，11、16、17、21、25、27、31和37分別為H)代陽(yáng)性小鼠對(duì)應(yīng)基因組的雜交結(jié)果。圖6為Western Blot檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠乳樣中人源LPL表達(dá)情況，其中，H為人奶樣品雜交結(jié)果，WT為野生型小鼠乳樣雜交對(duì)照，21、25、27、31和37為H)代陽(yáng)性小鼠乳樣雜交結(jié)果。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。以下實(shí)施例所使用的載體、菌種、試劑及其來(lái)源pBCl載體(Invitrogen) ；SC120026載體購(gòu)于Origene公司(含有人脂蛋白脂酶cDNA序列)；引物合成及序列測(cè)定由上海生工完成；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用昆明小白鼠，購(gòu)自北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Taq酶、T4DNA連接酶、內(nèi)切酶均為Biolabs公司產(chǎn)品；質(zhì)粒純化及回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品；同位素標(biāo)記試劑盒購(gòu)于Promega公司；放射性同位素a-32P_dCTP以及Southern雜交膜購(gòu)自美國(guó)Amersham biosciences公司；HRP標(biāo)記的抗人脂蛋白脂酶的一抗購(gòu)自Santa Cruz公司；LPL含量檢測(cè)ELISA試劑盒購(gòu)自GBD公司；甘油三酯檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中生北控公司；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天公司；乳糖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Boehringer公司；酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作步驟詳見(jiàn)《分子克隆(第三版)》。實(shí)施例中所使用的其它技術(shù)手段，若未特別指明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例I人LPL乳腺表達(dá)載體構(gòu)建以含有人脂蛋白脂酶cDNA序列的SC120026質(zhì)粒(Origene公司)為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物=Hlpl-F^ -CCGCTCGAGGAGATGGAGAGCAAAGCCCT-3')和 Hlpl-R(5' -CCGCTCGAGTGTGGTAATAAAATGTTGT-3')，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到人源LPL基因cDNA序列，該序列如SEQ IDNo. 2所示。用來(lái)擴(kuò)增LPL cDNA序列的引物Hlpl-F和Hlpl-R序列內(nèi)均含有XhoI酶切位點(diǎn)。將擴(kuò)增序列回收，克隆到經(jīng)過(guò)XhoI酶切的商業(yè)化乳腺表達(dá)載體pBCl (Invitrogen公司)中，利用PCR鑒定插入片段序列及方向，并進(jìn)行測(cè)序鑒定，最終將含有正確插入片段的表達(dá)載體命名為pBC-hLPL，所采用的酶切、連接、回收、轉(zhuǎn)化、PCR擴(kuò)增等技術(shù)均為常規(guī)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)操作步驟，詳見(jiàn)《分子克隆(第三版)》。實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立及檢測(cè)將構(gòu)建好的表達(dá)載體pBC-hLPL進(jìn)行酶切，去除原核載體的骨架結(jié)構(gòu)，然后將該線(xiàn)性化后的載體進(jìn)行顯微注射。線(xiàn)性化后的人LPL乳腺表達(dá)載體結(jié)構(gòu)如圖I所示，其包含了珠蛋白隔離子、β-酪蛋白啟動(dòng)子和酪蛋白3’調(diào)控區(qū)，目的基因人源LPL cDNA克隆到PBCl載體中的XhoI酶切位點(diǎn)上。2. I顯微注射生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠研究表明，用顯微注射法生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因小鼠，線(xiàn)性DNA比環(huán)狀DNA整合效率高，因此要將構(gòu)建好的表達(dá)載體pBC-hLPL酶切去除無(wú)用的原核部分同時(shí)線(xiàn)性化后進(jìn)行顯微注射。用Notl/Sall酶切表達(dá)載體pBC_hLPL去掉原核載體骨架結(jié)構(gòu)部分。然后將酶切DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖2。切下含有19. Ikb大小的目的片段的凝膠，利用可回收IOkb以上DNA片段的凝膠回收試劑盒(Omega)進(jìn)行回收。將回收片段溶于TE溶液(lOmmol/LTris · Cl (pH7. 4),0. lmmol/L EDTA，用 Milli-Q 水配制)中，在紫外分光光度計(jì)中測(cè)定260nm和280nm下OD比值并計(jì)算濃度，所得0D260/0D280比值在I. 8以上，可用于注射小鼠受精卵。將含有外源基因片段的TE溶液稀釋至終濃度2. 5 μ g/ml，注射到小鼠受精卵的雄原核，然后移植到同期發(fā)情的假孕母鼠輸卵管中。轉(zhuǎn)基因小鼠制備過(guò)程參見(jiàn)《小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)指南》(A.納吉等著，2004，科學(xué)出版社)。轉(zhuǎn)基因小鼠制備流程如圖3所示。2. 2轉(zhuǎn)基因小鼠的PCR檢測(cè)取3周齡轉(zhuǎn)基因小鼠的尾巴組織樣品，提取DNA。以提取的基因組為模板，利用人源 LPL cDNA 序列設(shè)計(jì)的引物(L-F :5，-GTGGCTACCTGTCATTTCAAT-3，，L-R 5’-ACAGAGAGTCGATGAAGAG-3’)在轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠中可以擴(kuò)增出648bp片段，以野生型小鼠基因組為陰性對(duì)照，以載體pBC-hLPL為陽(yáng)性對(duì)照。擴(kuò)增條件為94°C，30sec ；58°C,30sec ；72°C,90sec ；30個(gè)循環(huán)。I. 0%瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。PCR在H)代42只小鼠中檢測(cè)出8只陽(yáng)性小鼠，結(jié)果見(jiàn)圖4，第11、16、17、21、25、27、31和37號(hào)小鼠均為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性小鼠。2. 3 轉(zhuǎn)基因小鼠的 Southern blotting 檢測(cè)
將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的代8只轉(zhuǎn)基因小鼠，剪尾部組織提取基因組，取IOyg用EcoRI內(nèi)切酶消化，以EcoRI酶切的野生型小鼠基因組為陰性對(duì)照，EcoRI酶切的pBC-hLPL注射載體片段為陽(yáng)性對(duì)照，雜交探針是以人LPLcDNA為模板利用PCR擴(kuò)增后回收 I. Ikb 的基因片段(引物為 S-F :5’ -ATTCTGGATCTTTCGGACTGA-3’，S-R 5’ -ATTCCAAGCCTGATGATGTTA-3’ )。將樣品低壓慢速電泳，采用堿轉(zhuǎn)移方法將DNA從瓊脂糖轉(zhuǎn)移至尼龍膜，將尼龍膜上DNA的一面朝內(nèi)，卷成筒狀放入雜交管中，加入預(yù)雜交液，于65°C預(yù)雜交不短于lhr，加入經(jīng)過(guò)加熱變性的a-P32dCTP同位素標(biāo)記的探針，65°C雜交12 16hr，洗膜后用保鮮膜包好，置于暗盒中，暗室中壓上X光片，于_70°C放射自顯影，12小時(shí)沖洗X光片觀察結(jié)果。Southern blotting結(jié)果見(jiàn)圖5,結(jié)果表明陽(yáng)性小鼠Southernblotting檢測(cè)結(jié)果與PCR檢測(cè)結(jié)果一致。
實(shí)施例3重組人LPL在轉(zhuǎn)基因小鼠乳樣中的表達(dá)分析3. I轉(zhuǎn)基因小鼠乳樣的Western blotting檢測(cè)采集H)代21、25、27、31和37號(hào)小鼠泌乳中期的奶樣，野生型小鼠乳汁作為陰性對(duì)照，人奶為陽(yáng)性對(duì)照。乳汁在小鼠出生后第8-12天采集，采集前將母鼠與仔鼠分離3小時(shí)以上，并向腹腔注射一定劑量的催產(chǎn)素。將離心后去除乳脂和酪蛋白的乳清在10%的SDS-PAGE上電泳后轉(zhuǎn)到尼龍膜上。用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗人的LPL —抗進(jìn)行Western Blot分析，即可檢測(cè)重組人LPL在轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的表達(dá)。重組人LPL與人奶中LPL分子量大小相一致,約為56kDa。結(jié)果如圖6所示。3. 2轉(zhuǎn)基因小鼠乳樣中LPL表達(dá)量分析采用ELISA法對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁中的LPL表達(dá)量進(jìn)行分析，選取了 10只轉(zhuǎn)基因小鼠泌乳中期的奶樣進(jìn)行檢測(cè)。由于采用的商業(yè)化的ELISA試劑盒并不能有效地區(qū)分人源與鼠源的LPL，因此本發(fā)明檢測(cè)了 6只野生型小鼠泌乳中期的奶樣作為對(duì)照(具體操作按說(shuō)明書(shū))。轉(zhuǎn)基因鼠表達(dá)的LPL含量極顯著高于野生型鼠奶中的LPL含量，最高表達(dá)量達(dá)到0. 16mg/ml。3. 3轉(zhuǎn)基因小鼠奶樣中LPL的活性檢測(cè)采用與上述3. 2中使用的同樣一批轉(zhuǎn)基因和野生型的鼠奶進(jìn)行酶活性的檢測(cè)。使用含3H標(biāo)記三油酸甘油酯的甘油乳劑為底物，標(biāo)本與底物37°C孵育反應(yīng)后通過(guò)抽提將甘油酯與游離脂肪酸分開(kāi)，脂解產(chǎn)生的游離脂肪酸的放射活性與標(biāo)本中脂肪酶的活性成正比的放射性同位素標(biāo)記法測(cè)定體外LPL活性。具體操作可參考文獻(xiàn)(張愛(ài)宏，劉國(guó)慶，放射性同位素標(biāo)記法檢測(cè)脂蛋白脂肪酶活性及其應(yīng)用，中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2003年第11卷第6期)。轉(zhuǎn)基因鼠奶中LPL活性在泌乳期各階段均顯著高于野生型鼠奶，具體結(jié)果見(jiàn)表I。表I轉(zhuǎn)基因鼠奶及野生型鼠奶在泌乳早、中、晚三期LPL表達(dá)量和活性統(tǒng)計(jì)表
LPL 蛋白(pg / ml)LPL 活性(mU / ml)
WT(n=6) hLPL(n=10)WT(n=6) hLPL(n=10)泌乳早期23.03 ±1.77 152.30 ±7.70 ***4013.30 ±625.88 6923.30 ± 1849.63*
泌乳中期 19.73 ±2.94 148.60 ±5.86***2914.82 ±702.93 5872.96 ± 1913.60*
泌乳晚期 21.65 ±1.60 127.91 ±22.24***1993.46 ±270.77 4922.80 ±2018.19**P < 0. 05 < O. 001。以上數(shù)據(jù)代表平均值土 SD。實(shí)施例4轉(zhuǎn)基因鼠奶中主要成分檢測(cè)4. I奶中甘油三酯，蛋白，乳糖含量的檢測(cè)采用與實(shí)施例3中3. 2使用的同樣一批轉(zhuǎn)基因和野生型的鼠奶進(jìn)行奶中各物質(zhì)成分的檢測(cè)。對(duì)奶中三種主要成分的檢測(cè)均采用的是商業(yè)化試劑盒，具體操作步驟依照說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)基因鼠奶中在泌乳各個(gè)時(shí)期的甘油三酯含量較在野生型鼠奶中顯著降低，而蛋白和乳糖的含量在轉(zhuǎn)基因和野生型鼠奶中變化不大，無(wú)顯著性差異，具體結(jié)果見(jiàn)表2。表2轉(zhuǎn)基因鼠奶及野生型鼠奶在泌乳早、中、晚三期甘油三酷、蛋白、乳糖含量統(tǒng)計(jì)表
權(quán)利要求
1.一種低脂奶的生產(chǎn)方法，其特征在于，其是將編碼人源脂蛋白脂酶的基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物中，并利用該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)低脂奶。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，其是將編碼人源脂蛋白脂酶的基因通過(guò)顯微注射法、體細(xì)胞克隆法或精子載體法轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物中。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，人源脂蛋白脂酶的氨基酸序列如SEQID No. I所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，編碼人源脂蛋白脂酶的基因序列如SEQID No. 2 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于，所述哺乳動(dòng)物為牛、羊、豬、馬、兔、鹿、 狗。
6.含有編碼人源脂蛋白脂酶的基因的乳腺特異表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體,其特征在于,其出發(fā)載體為pBCl。
8.含有權(quán)利要求6或7所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
9.一種制備克隆胚胎的方法，其以權(quán)利要求8所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞為核移植供體細(xì)胞，離體的卵母細(xì)胞為核移植受體細(xì)胞，通過(guò)核移植技術(shù)獲得克隆胚胎。
10.一種制備轉(zhuǎn)基因家畜的方法，其是將權(quán)利要求9所述方法制備的克隆胚胎通過(guò)非手術(shù)法移入家畜子宮內(nèi)進(jìn)行妊娠，獲得轉(zhuǎn)基因家畜。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種低脂奶的生產(chǎn)方法，其是通過(guò)基因工程技術(shù)，將編碼人源脂蛋白脂酶(LPL)的基因轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物中，利用該轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)低脂奶。本發(fā)明利用構(gòu)建LPL乳腺特異表達(dá)載體，制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，特別是轉(zhuǎn)基因奶?；蚰躺窖?，生產(chǎn)出乳脂率顯著減低的奶制品，對(duì)于提高奶制品的應(yīng)用價(jià)值具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102628060SQ201210078350
公開(kāi)日2012年8月8日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者李寧, 王媛媛, 趙要風(fēng) 申請(qǐng)人:北京濟(jì)福霖生物技術(shù)有限公司