專利名稱：一株高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及工業(yè)微生物的育種，尤其是一株高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌。
背景技術(shù)：
黃酒和白酒是我國(guó)的特色酒種，國(guó)內(nèi)普通白酒和黃酒是以純種培養(yǎng)的釀酒酵母為主進(jìn)行發(fā)酵的，其特點(diǎn)是發(fā)酵周期短、原料出酒率高，但由于釀酒酵母產(chǎn)酯香物質(zhì)的能力極低，致使成品酒品質(zhì)較差。高檔飲料酒(黃酒、白酒)酯香物質(zhì)含量較高的主要原因是采用自然網(wǎng)羅微生物制曲發(fā)酵，通過自然制曲網(wǎng)羅的產(chǎn)酯能力較強(qiáng)的漢遜酵母和假絲酵母等生香微生物來提高酒中酯含量，而這些野生酵母的存在嚴(yán)重影響原料出酒率，其酒精發(fā)酵效率不到釀酒酵母的三分之一，因而導(dǎo)致我國(guó)高檔白酒和黃酒耗糧高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、效率低、 成本高。如何提高酒中酯香物質(zhì)的含量，一直是我國(guó)普通白酒、黃酒企業(yè)和相關(guān)科研單位研究的重要課題。但是，目前國(guó)內(nèi)提高酒中酯香物質(zhì)含量的方法仍存在很多問題。因此，要從根本上解決釀酒酵母的產(chǎn)酯能力還是需要利用分子生物學(xué)育種技術(shù)構(gòu)建高產(chǎn)酯的釀酒酵母工業(yè)菌株。研究表明，乙酸酯類，如乙酸乙酯(溶劑類香氣)，乙酸異戊酯(香蕉風(fēng)味)和乙酸異丁酯(成熟水果香)，是酒中主要的風(fēng)味活性酯。這些酯類的形成是在酵母代謝時(shí)在酵母內(nèi)合成的，形成的酯一部分通過細(xì)胞擴(kuò)散到發(fā)酵液中，一部分被酵母吸附，留在細(xì)胞體內(nèi)。提高這些乙酸酯的含量不僅可以增進(jìn)酒的酯香，同時(shí)能有效地?cái)U(kuò)張、松馳神經(jīng)，可減少喝酒引起的副作用。參與乙酸酯合成的酶主要是醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶(AATase)，該酶催化醇和乙酰輔酶A 形成乙酸酯。該酶是一種巰基酶，有三種不同的類型AATase I>Lg-AATase I和AATase II, 分別由ATFULg-ATFl和ATF2編碼。而國(guó)內(nèi)還沒有醇乙?；D(zhuǎn)移酶及其編碼基因?qū)Π拙坪忘S酒風(fēng)味和品質(zhì)影響的相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決釀酒酵母自身產(chǎn)酯能力較低的問題，提供一株高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌株。本發(fā)明提供的高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),具體為EY-14, 已于2011年12月22日保藏于中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC No 5635。該釀酒酵母在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，模擬半固態(tài)發(fā)酵后，轉(zhuǎn)化子菌株與親本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)相比，乙酸乙酯含量提高3. 6 倍，乙酸異戊酯的含量提高到55. 2mg/L,乙酸異丁酯含量提高到33. 8mg/L。本發(fā)明高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌株的構(gòu)建方法包括
I)將PGKl啟動(dòng)子和終止子與PUC19質(zhì)粒連接得到pUC_P ；2)將來源于釀酒酵母的同源片段IAH連接到第I)步得到的pUC-PGKl上，得到 pUC-PGKl-IAH ；3)將編碼醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶ATF2基因插入到第2)步得到的pUC-PGKl-IAH中的 PGKl啟動(dòng)子和終止子之間，得到pUC-PGKl-IAH-ATF2 ；4)將kan基因連接到第3)步得到的pUC-PGKl-IAH_ATF2上，得到質(zhì)粒 pUC-PGKl-IAH-ATF2-kan (以下簡(jiǎn)稱 pUC_PIA2K)；5)將第4)步構(gòu)建的過表達(dá)質(zhì)粒PUC-PIA2K用Bpull02I酶切，用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分別將其插入釀酒酵母a型和α型單倍體，得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株，6)將純化后的釀酒酵母a型和α型重組單倍體進(jìn)行融合，通過抗性平板和生孢實(shí)驗(yàn)篩選得到高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌(雙倍體)。本發(fā)明同時(shí)提供了一種專門用于鑒定所述高產(chǎn)乙酸酯的釀酒酵母工程菌的基因序列，該基因序列是以ATF-U和ATF-D為引物，以所述高產(chǎn)乙酸酯的釀酒酵母工程菌菌株基因組為模板，擴(kuò)增片段測(cè)序?yàn)橐惶禺愋孕蛄?，如序列表I所示。模擬半固態(tài)發(fā)酵將酵母菌接入5mL麥芽汁培養(yǎng)液中，30°C過夜培養(yǎng)12h ;將菌液全部轉(zhuǎn)至20mL新鮮麥芽汁培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)24h。取IOOg粳米置于25 30°C的水中， 浸潰72h ;取出后洗凈，常壓蒸煮30min。將米攤涼，投入500mL三角瓶中，加入IOg熟麥曲和105mL水。最后，接入25mL酵母麥芽汁培養(yǎng)液，28°C發(fā)酵5天。對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分析，包括失重、酒度、殘?zhí)呛虶C測(cè)定香氣成分含量。GC分析發(fā)酵液經(jīng)蒸餾萃取后采用氣相色譜法測(cè)定。內(nèi)標(biāo)物為乙酸正戊酯。氣相色譜儀為 Agilent 7890C ;色譜柱 HPINNOWAX Polyethylene Glyco 260 °C 30mX320ymX0. 5μπι，配FID檢測(cè)器。載氣為高純氮，流速2. OmL/min。起始柱溫為52°C， 以2°C /min的升溫速度升至70°C，再以4°C /min的升溫速度升至90°C，最后以10°C /min 的升溫速度升至200°C。檢測(cè)器溫度為250°C，進(jìn)樣口溫度為230°C，進(jìn)樣量為I. O μ L。分流方式為分流，分流比為25 I。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果本發(fā)明選用強(qiáng)啟動(dòng)子PGKl過表達(dá)編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶的ATF2基因，獲得了高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌EY-14 (CGMCC No 5635)。本發(fā)明所獲得的高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌Saccjaromyces cerevisiae EY-14 (保藏號(hào)CGMCC No 5635)與初始的釀酒酵母菌(受體菌Saccharomyces cerevisiae CGMCC No2. 1525)相比模擬半固態(tài)發(fā)酵后，乙酸乙酯含量提高3. 6倍，乙酸異戊酯的含量提高到55. 2mg/L,乙酸異丁酯含量提高到33. 8mg/L，為釀酒工業(yè)生產(chǎn)提供了優(yōu)良菌株。


圖l.pUC-PIAK質(zhì)粒的驗(yàn)證電泳圖。圖2.陽(yáng)性重組釀酒酵母單倍體的驗(yàn)證，其中(a)為a型陽(yáng)性重組單倍體驗(yàn)證結(jié)果；(b)為α型陽(yáng)性重組單倍體驗(yàn)證結(jié)果。圖3.高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌的構(gòu)建路線圖。
本發(fā)明所述的高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)具體為 EY-14，已于2011年12月22日保藏于中國(guó)微生物保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱 CGMCC，地址為中國(guó)北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路甲3號(hào))，保藏號(hào)為CGMCC No 5635。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所使用的釀酒酵母雙倍體菌體是可以采用任何來源的釀酒酵母雙倍體菌株。下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例I :高產(chǎn)酯釀酒酵母基因工程菌的構(gòu)建(I)基因工程菌株的構(gòu)建I)將PGKl啟動(dòng)子和終止子與PUC19質(zhì)粒連接得到pUC-PGKl ；2)將來源于釀酒酵母的同源片段IAH連接到第I)步得到的pUC-PGKl上，得到 pUC-PGKl-IAH ；3)將編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶ATF2基因插入到第2)步得到的pUC-PGKl-IAH中的 PGKl啟動(dòng)子和終止子之間，得到pUC-PGKl-IAH-ATF2 ；4)將kan基因連接到第3)步得到的pUC-PGKl-IAH_ATF2上，得到質(zhì)粒 pUC-PGKl-IAH-ATF2-kan (以下簡(jiǎn)稱 pUC_PIA2K)；圖I為pUC-PIA2K質(zhì)粒的驗(yàn)證電泳圖其中泳道I為5000bp DNALadder Marker ； 泳道2為受體菌基因組PCR擴(kuò)增同源片斷IAH ;泳道3為pUC-PIA2K質(zhì)粒PCR擴(kuò)增同源片斷 IAH ;泳道4為受體菌基因組PCR擴(kuò)增ATF2 ;泳道5為pUC_PIA2K質(zhì)粒PCR擴(kuò)增ATF2 ;泳道 6為pUG6質(zhì)粒PCR擴(kuò)增Kan ;泳道7為pUC_PIA2K質(zhì)粒PCR擴(kuò)增Kan ;泳道8為pUC_PIA2K 質(zhì)粒，PGKl上游引物+下游引物PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道9為IKb DNA Ladder Marker ;泳道10 為載體PUC19單酶切線性結(jié)果；泳道11為pUC-PIA2K質(zhì)粒單酶切線性結(jié)果。5)Bpull02I(Blp I)酶切質(zhì)粒pUC_PIA2K ;用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法分別將其插入釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2. 1525)a型和α型單倍體,得到同源重組后的釀酒酵母基因工程單倍體菌株。圖2中(a)為a型陽(yáng)性重組單倍體PCR驗(yàn)證結(jié)果；(b)為 α型陽(yáng)性重組單倍體PCR驗(yàn)證結(jié)果。其中泳道I為5000bp DNALadder Marker，泳道2為受體菌a/ α型單倍體上游PCR陰性對(duì)照；泳道3為a/ α型重組單倍體上游PCR產(chǎn)物；泳道 4為受體菌a/ α型單倍體下游PCR陰性對(duì)照；泳道5為a/ α型重組單倍體下游PCR產(chǎn)物。6)將純化后的釀酒酵母a型和α型重組單倍體進(jìn)行融合，通過抗性平板和生孢實(shí)驗(yàn)篩選得到高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌ΕΥ-14(雙倍體)。圖3為高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌的構(gòu)建過程。(2)基因工程菌株的特異性序列獲得的基因工程菌株ΕΥ-14染色體中含有一段特異性序列，可通過PCR擴(kuò)增測(cè)序后進(jìn)彳丁囷株鑒定。特異性片段擴(kuò)增的引物序列為ATF-U :5’ -TCGGCCTAAACGTTTGCTCCACA-3’ATF-D :5，-TGGTTTGGAGGAGAAGATAACGACG-3’該特異性片段的基因序列見序列表I。
實(shí)施例2 :高產(chǎn)酯釀酒酵母工程菌與出發(fā)菌株發(fā)酵性能的研究將實(shí)施例I得到的工程菌和受體菌分別接入5mL麥芽汁培養(yǎng)液中，30°C過夜培養(yǎng) 12h ;將菌液全部轉(zhuǎn)至20mL新鮮麥芽汁培養(yǎng)液中，30°C培養(yǎng)24h。取IOOg粳米置于25 30°C的水中，浸潰72h ;取出后洗凈，常壓蒸煮30min。將米攤涼，投入500mL三角瓶中，加入 IOg熟麥曲和105mL水。最后，接入25mL酵母麥芽汁培養(yǎng)液，28°C發(fā)酵5天。發(fā)酵期間每隔 12h振蕩并稱重，記錄失重；發(fā)酵結(jié)束后，停止培養(yǎng)并稱重；測(cè)定發(fā)酵液的殘?zhí)菨舛取⒕凭w積分?jǐn)?shù)以及主要香氣成分含量，以發(fā)酵能力、殘?zhí)菨舛群彤a(chǎn)物生成量表征其綜合性能，結(jié)果見表I。表I釀酒酵母受體菌和工程菌的發(fā)酵性能
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，具體為EY-14，保藏號(hào)為 CGMCC No 5635。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的釀酒酵母，其特征在于，在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，模擬半固態(tài)發(fā)酵后，轉(zhuǎn)化子菌株與親本菌株(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No2.1525)相比，乙酸乙酯含量提高3. 6倍，乙酸異戊酯的含量提高到55. 2mg/L，乙酸異丁酯含量提1 到33. 8mg/L0
全文摘要
一株高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌。本發(fā)明提供的釀酒酵母菌，是選用強(qiáng)啟動(dòng)子PGK1過表達(dá)編碼醇乙?；D(zhuǎn)移酶的ATF2基因，得到高產(chǎn)乙酸酯釀酒酵母工程菌SaccharomycescerevisiaeEY-14，保藏號(hào)為CGMCC No.5635。該菌在其它發(fā)酵性能不受影響的情況下，轉(zhuǎn)化子菌株與親本菌株(SaccharomycescerevisiaeCGMCC No2.1525)相比模擬半固態(tài)發(fā)酵后，乙酸乙酯含量提高3.6倍，乙酸異戊酯的含量提高到55.2mg/L，乙酸異丁酯含量提高到33.8mg/L；篩選得到的工程菌對(duì)發(fā)酵設(shè)備及條件沒有特殊要求，一般酒廠的設(shè)備和條件均可使用，因而有廣泛的應(yīng)用前景，能為酒廠的工業(yè)化生產(chǎn)帶來顯著經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號(hào)C12R1/865GK102604848SQ20121008023
公開日2012年7月25日 申請(qǐng)日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者張建煒, 張翠英, 戴隆海, 肖冬光, 郭學(xué)武 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)