(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種加巴噴丁的合成工藝，即1-(氨甲基)環(huán)己基乙酸的合成工藝，特別涉及一種用1-氰基環(huán)己基乙酸直接合成加巴噴丁的方法，屬于藥物合成的技術(shù)領(lǐng)域。

(二)

背景技術(shù)：

加巴噴丁(gabapentin)，商品名為neurontin，化學(xué)名為1-(氨甲基)環(huán)己基乙酸，結(jié)構(gòu)與γ-氨基丁酸(gaba)類似，最早由美國的warner-lambert公司研制開發(fā)，并于1993年首次在英國上市。加巴噴丁是新一代的抗癲癇藥物，同時也適用于各種類型的神經(jīng)痛，具有不良反應(yīng)輕微且持續(xù)時間短，不經(jīng)肝代謝等特點(diǎn)。自其上市以來，銷售額連續(xù)上升，在抗癲癇藥市場中占有較大份額。

由于加巴噴丁含有一個環(huán)己烷基的結(jié)構(gòu)，因此，在現(xiàn)有的報道中加巴噴丁的合成多以環(huán)己烷化合物為起始原料，其他的還有苯甲腈等。然而目前，這些途徑多為化學(xué)合成途徑，均存在一定的缺陷。

在us20030009055中以環(huán)己酮為原料，在氫氧化鉀，乙腈中55℃加熱回流7h，加水溶解，分層干燥后得到環(huán)己基乙腈。環(huán)己基乙腈在含有dmso，碳酸鉀和硝基甲烷的環(huán)境中加熱，獲得1-硝甲基環(huán)己基乙腈，溶于乙醇，通過pd/c催化加氫，得到3-氨基-2-氮雜螺[4.5]癸烷-2-醇。之后在氫氧化鈉溶液中加熱回流，加入鹽酸調(diào)節(jié)ph，低溫析出2-羥基-2-氮雜螺[4.5]癸烷-3-酮，后溶于甲醇，通過雷尼鎳催化加氫，干燥后，在鹽酸中加熱回流，冷卻后用二氯甲烷萃取干燥。經(jīng)離子交換獲得加巴噴丁。該方法需要使用具有一定毒性和爆炸性的硝基甲烷，而且需要經(jīng)過兩次催化加氫對設(shè)備要求較高。

在us68469508中，利用1,1-環(huán)己基-二乙酸為原料，在乙酸酐和乙酸銨的混合液中，高溫反應(yīng)，調(diào)節(jié)不同的ph值，在利用叔丁醇萃取，之后與氫氧化鈉/次氯酸鈉反應(yīng)，鹽酸水解，再經(jīng)過二環(huán)乙胺堿化，甲醇、異丙醇重結(jié)晶得到加巴噴丁精品。其中二環(huán)乙胺處理后可用氫氧化鈉吸附氯離子回收二環(huán)乙胺循環(huán)利用。該法采用乙酸酐和乙酸銨的混合物，一步得到內(nèi)酰胺，而且對二環(huán)乙胺進(jìn)行了回收再利用，但整體收率較低，其中的一些步驟對設(shè)備的要求高，工藝仍較為繁瑣。

在ep0414262和us5132451中1-氰基環(huán)己基乙腈在乙醇，甲苯，氯化氫的環(huán)境下反應(yīng)，通過移除多余氣體，調(diào)節(jié)ph，水洗，再以甲苯作為相轉(zhuǎn)移試劑，后與甲醇，氫氧化鈉溶液反應(yīng)，調(diào)節(jié)ph，低溫結(jié)晶得到1-氰基環(huán)己基乙酸。1-氰基環(huán)己基乙酸在堿性條件下，通過雷尼鎳催化加氫，加入冰乙酸調(diào)節(jié)ph至中性，以四氫呋喃結(jié)晶得到加巴噴丁粗品，再以甲醇、水和異丙醇重結(jié)晶得到加巴噴丁精品。該方法的原料使用量大，廢物排量大，收率較低。

在上述路徑中由于其環(huán)境友好性差(消耗大量的hcl氣體，甲醇，甲苯，氫氧化鈉，水等試劑)，收率低(收率最高達(dá)61.62％)，經(jīng)濟(jì)性較低，因而限制了其工業(yè)化應(yīng)用。因此，在此路線上我們對其進(jìn)行了改進(jìn)。由于生物催化則具有反應(yīng)條件溫和，具有良好的選擇性，催化效率高等優(yōu)點(diǎn)。因此需要篩選出能夠特異選擇性催化1-氰基環(huán)己基乙腈且高酶活的腈水解酶。

此前在本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的一篇論文中報道(processbiochemistry49(2014),2141-2148)利用純酶催化1-氰基環(huán)己基乙腈生產(chǎn)1-氰基環(huán)己基乙酸。然而純酶催化存在明顯的弊端：穩(wěn)定性差、需要繁瑣復(fù)雜的純化過程、酶催化劑不易回收等等。因此，為了適用于工業(yè)化生產(chǎn)，我們決定利用含腈水解酶的靜息細(xì)胞催化1-氰基環(huán)己基乙腈生產(chǎn)1-氰基環(huán)己基乙酸，這在我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的另外的一項(xiàng)專利(cn104212850a)和論文(catalysiscommunications66(2015),121-125)均有詳細(xì)的報道。

在利用含腈水解酶的靜息細(xì)胞催化1-氰基環(huán)己基乙腈生成1-氰基環(huán)己基乙酸的過程中，由于靜息細(xì)胞的破碎，導(dǎo)致大量的蛋白質(zhì)及有機(jī)大分子釋放到胞外，這對于下一步的催化加氫反應(yīng)是不利的，這是由于蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)會使得加氫催化劑中毒。此外利用靜息細(xì)胞作為催化劑催化1-氰基環(huán)己基乙腈時，在經(jīng)過一批反應(yīng)后，酶活力迅速衰減，無法重復(fù)使用。因此經(jīng)過后續(xù)改進(jìn)，采用固定化技術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行固定化，這在本實(shí)驗(yàn)室發(fā)表的另外一項(xiàng)專利(cn10491225a)中有詳細(xì)的報道。采用固定化技術(shù)可以極大的增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性，增強(qiáng)機(jī)械強(qiáng)度，保證細(xì)胞的完整性，重復(fù)利用等。

在xue等人發(fā)表的論文和專利cn10491225a中均有報道利用由靜息細(xì)胞或者固定化細(xì)胞催化1-氰基環(huán)己基乙腈合成關(guān)鍵中間體1-氰基環(huán)己基乙酸，通過雷尼鎳催化加氫合成加巴噴丁內(nèi)酰胺。加巴噴丁內(nèi)酰胺在鹽酸的作用下水解，碳酸鈉溶液調(diào)節(jié)ph，中和過多的氯離子，經(jīng)異丙醇重結(jié)晶后得到加巴噴丁精品。該方法以酶法催化和化學(xué)催化相結(jié)合，反應(yīng)條件溫和，特異選擇性高，環(huán)境友好，整體收率較高，步驟簡短。

目前，多數(shù)學(xué)者采用化學(xué)法合成加巴噴丁，需要使用大量的試劑，條件步驟冗長、繁瑣；而之前xue等人采用化學(xué)-酶法合成加巴噴丁需要通過酶法催化，直接加氫和化學(xué)水解三個主要步驟，步驟仍較為繁瑣。

因此通過對比研究發(fā)現(xiàn)，前人對于直接一步加氫催化合成加巴噴丁并未有大量研究，而且之前采用的工藝是將1-氰基環(huán)己基乙酸直接加氫合成環(huán)化物，再水解得到加巴噴丁。因此研究開發(fā)一種只經(jīng)過一步加氫技能合成加巴噴丁的技術(shù)具有極大的意義。此外，需要設(shè)計(jì)產(chǎn)品的提純工藝和中間產(chǎn)物的循環(huán)利用工藝，從而實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化。本發(fā)明正是對于一步加氫催化合成加巴噴丁以及加巴噴丁的提純和1-氰基環(huán)己基乙酸的循環(huán)利用這一思路展開了研究。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種通過1-氰基環(huán)己基乙酸的直接催化加氫生成加巴噴丁的制備方法，即通過對含有1-氰基環(huán)己基乙酸的酶催化轉(zhuǎn)化液進(jìn)行直接加氫生產(chǎn)加巴噴丁，以及通過離子交換分離加氫轉(zhuǎn)化液中的加巴噴丁和1-氰基環(huán)己基乙酸，并對分離出來的1-氰基環(huán)己基乙酸進(jìn)行循環(huán)利用的方法。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種利用1-氰基環(huán)己基乙酸直接合成加巴噴丁的方法(工藝流程如圖1)，所述方法為：(1)轉(zhuǎn)化液：將腈水解酶基因工程菌固定化細(xì)胞分散于去離子水中，加入1-氰基環(huán)己基乙腈，在20-50℃、10-350rpm條件下攪拌反應(yīng)完全后(優(yōu)選35℃，200rpm下攪拌反應(yīng)8h)，抽濾，獲得濾餅a和含1-氰基環(huán)己基乙酸的濾液a；濾餅a為回收固定化細(xì)胞；所述腈水解酶基因工程菌固定化細(xì)胞是將seqidno.1所示腈水解酶基因構(gòu)建的工程菌以硅藻土為載體制備獲得的(具體制備方法參照專利申請cn104911225a實(shí)施例1，腈水解酶基因同cn104911225a中seqidno.1所示)；所述1-氰基環(huán)己基乙腈與固定化細(xì)胞質(zhì)量比為1:1.0-1.1，所述去離子水的體積用量以1-氰基環(huán)己基乙腈質(zhì)量計(jì)為6.5-7.0ml/g；(2)加巴噴丁的合成：取步驟(1)濾液a至加氫反應(yīng)釜中，加入催化劑和助劑，通入氫氣，于20-150℃、300-1100rpm條件下反應(yīng)(優(yōu)選以10℃幅度逐步升溫模式進(jìn)行反應(yīng)，每次升溫后通入氫氣反應(yīng)12h，再排除氫氣，優(yōu)選反應(yīng)溫度為30-80℃)，反應(yīng)完全后將反應(yīng)液冷卻至30-80℃(優(yōu)選60℃)，排空氫氣，過濾，獲得濾液b和濾餅b，濾餅b為回收催化劑；所述催化劑為雷尼鎳、銠碳(銠質(zhì)量負(fù)載量5％)或鈀炭(鈀質(zhì)量負(fù)載量10％)(優(yōu)選雷尼鎳)，所述助劑有機(jī)酸、無機(jī)酸、無機(jī)堿或有機(jī)堿，更優(yōu)選為甲酸、乙酸、甲酸銨或三乙胺中的一種或多種；所述催化劑與濾液a中1-氰基環(huán)己基乙酸質(zhì)量比為0.1-1:1，所述助劑用量以濾液a體積計(jì)為0.5-2.5％(優(yōu)選1-2％)；(3)分離純化：將步驟(2)獲得的濾液b冷卻后調(diào)節(jié)ph值至4.0-5.0，上樣過陽離子交換樹脂，首先以蒸餾水洗滌，收集ph為3.0-6.0范圍內(nèi)的流出液a為含有1-氰基環(huán)己基乙酸的洗出液；再以體積濃度15％的氨水溶液為洗脫液，收集ph為7.5-13.0范圍內(nèi)的流出液b；流出液b減壓濃縮至原體積的1/10，獲得濃縮液a，濃縮液a加入2倍體積的異丙醇靜置1h后再次在50℃下濃縮至原體積的1/6-1/5，獲得的濃縮液b加入2-5倍體積的異丙醇冰浴攪拌后在0-4℃下冷卻靜置，收集晶體干燥，得到加巴噴??；流出液a回收循環(huán)利用。

進(jìn)一步，步驟(2)所述助劑為甲酸和三乙胺以體積比0.1-3.6:1的混合或者2m乙酸水溶液與三乙胺以體積比0.1-3.6:1的混合。

進(jìn)一步，步驟(3)所述陽離子交換樹脂為001×7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂，購買自寧波爭光樹脂廠，其他型號的陽離子交換樹脂也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

進(jìn)一步，步驟(2)所述反應(yīng)以升溫幅度10℃的梯度逐步升溫至80℃，每次升溫后通入氫氣反應(yīng)12h，然后排出氣體，通入氫氣量為0-2mpa(優(yōu)選0.5-1.0mpa)。

進(jìn)一步，步驟(2)所述反應(yīng)在40℃，500rpm下反應(yīng)12h后排除氫氣，升溫至50℃后再通入氫氣，保留12h后排除氫氣，升溫至60℃通入氫氣反應(yīng)12h，排除氫氣后，將反應(yīng)液過濾，獲得濾液b和濾餅b。

進(jìn)一步，步驟(3)所述流出液b在50℃下濃縮至原來體積的1/10，獲得的濃縮液a加入2倍體積的異丙醇靜置1h后再次在50℃下濃縮至原體積的1/6-1/5，獲得的濃縮液b加入2-5倍體積的異丙醇冰浴攪拌后在0-4℃下冷卻靜置，有白色晶體析出，抽濾后濾餅烘干即為加巴噴丁。

本發(fā)明所述催化劑銠碳的銠質(zhì)量負(fù)載量為5％；鈀炭中鈀質(zhì)量負(fù)載量為10％。所述雷尼鎳購買自大連通用化工有限公司，其他型號的雷尼鎳也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)；鈀炭(鈀負(fù)載量為10％)購買自上海麥克林生化科技有限公司，其他型號的鈀炭也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

本發(fā)明步驟(3)中流出液a(即含1-氰基環(huán)己基乙酸的溶液)的循環(huán)利用可采用直接加氫反應(yīng)，也可采用與步驟(1)的濾液a(即固定化細(xì)胞催化后的1-氰基環(huán)己基乙酸轉(zhuǎn)化液)混合后再進(jìn)行直接加氫反應(yīng)，更優(yōu)選采用與固定化細(xì)胞催化的1-氰基環(huán)己基乙酸轉(zhuǎn)化液混合后再加氫。

本發(fā)明所述濾液a和濾液b，濾餅a和濾餅b均為不同步驟過濾所得濾液和濾餅，所述流出液a和流出液b為不同洗脫液獲得的流出液，濃縮液a和濃縮液b均指濃縮液，字母本身沒有含義。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果主要體現(xiàn)在：

原子經(jīng)濟(jì)性好，采用生物催化與化學(xué)催化相結(jié)合生產(chǎn)加巴噴丁，其中在催化加氫步驟中能夠?qū)⒐潭ɑ?xì)胞催化后的反應(yīng)液直接用于加氫反應(yīng)生成產(chǎn)物加巴噴丁，因此避免提純1-氰基環(huán)己基乙酸，且利用水作為介質(zhì)，利于回收循環(huán)利用，減少污染。而且通過助劑的添加和升溫策略的改變，可直接催化1-氰基環(huán)己基乙酸一步合成加巴噴丁，在最優(yōu)條件下，反應(yīng)一個批次加巴噴丁收率達(dá)53.3％；利用離子交換法對加巴噴丁與1-氰基環(huán)己基乙酸進(jìn)行分離，可將未反應(yīng)完的1-氰基環(huán)己基乙酸回收循環(huán)利用于二次加氫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)中間產(chǎn)物的完全轉(zhuǎn)化，通過過對1-氰基環(huán)己基乙酸的回收并進(jìn)行加氫反應(yīng)，經(jīng)過5次循環(huán)后，使得加巴噴丁收率達(dá)到80％以上，比已報道的化學(xué)工藝提高了近20％(ep0414262)。

(四)附圖說明

圖1從1-氰基環(huán)己基乙腈選擇性水解、直接加氫一步合成加巴噴丁的路徑圖。

圖2為化學(xué)-酶法合成加巴噴丁的工藝流程圖。

圖3為不同的升溫策略對于1-氰基環(huán)己基乙酸在該體系中直接加氫生成加巴噴丁的反應(yīng)曲線圖，a:實(shí)施例2梯度升溫；b：實(shí)施例8恒溫60℃。

圖4為1-氰基環(huán)己基乙酸經(jīng)過回收循環(huán)利用后多批次反應(yīng)柱狀圖。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

lb液體培養(yǎng)基：酵母粉5g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，溶劑為去離子水，ph值自然。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨15g/l，酵母粉12g/l，nacl10g/l，甘油12g/l，(nh4)2so45g/l，kh2po41.36g/l，k2hpo4·3h2o2.28g/l，mgso4·7h2o0.375g/l，溶劑為去離子水，ph值自然。

加巴噴丁與1-氰基環(huán)己基乙酸的hplc檢測條件：色譜柱welchromc18柱(5μm×250mm×4.6mm)；流動相：緩沖液(5mmnh4h2po4/13mmnaclo4·h2o，高氯酸調(diào)節(jié)ph至1.8):乙腈＝76:24，v/v；柱溫：40℃；波長：215nm；流速1ml/min。

實(shí)施例1：一種化學(xué)-酶法合成加巴噴丁的方法，步驟如下：

(1)種子液的制備：將實(shí)驗(yàn)室之前已構(gòu)建好的含腈水解酶基因(seqidno.1)的工程菌e.colibl21(de3)/pet28b(+)-f168v(同專利申請cn104911225a實(shí)施例1)接種于含有終濃度5g/l卡那霉素的lb平板培養(yǎng)基，于37℃條件下過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于100ml含有終濃度5g/l卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，與37℃，150rpm下過夜培養(yǎng)，獲得種子液。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：接種種子液于含有終濃度5g/l卡那霉素的3l發(fā)酵培養(yǎng)基的5l發(fā)酵罐中，接種量為3％(v/v)，調(diào)節(jié)通氣比為1.3vvm，在37℃，500rpm條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵過程流加體積濃度8％的氨水和體積濃度10％的磷酸水溶液以維持發(fā)酵液ph在6.5左右，培養(yǎng)4h后，降溫至28℃，加入乳糖誘導(dǎo)，乳糖終濃度為12.5g/l(m/v)，培養(yǎng)10h，停止發(fā)酵，放罐獲得發(fā)酵液。于8000rpm離心10min，棄上清，收集獲得濕菌體。

(3)固定化細(xì)胞的制備：取20g濕菌體完全懸浮于200ml蒸餾水中，添加1.2g硅藻土在磁力攪拌器攪拌1h，后加入6ml的體積濃度5％的聚乙烯亞胺水溶液攪拌1h，添加2ml的體積濃度25％戊二醛水溶液攪拌30min后抽濾，蒸餾水洗2-3次，濾餅即為固定化細(xì)胞，稱重得31.44g。

(4)中間產(chǎn)物1-氰基環(huán)己基乙酸的合成：取15.72g固定化細(xì)胞于100ml去離子水中，攪拌使其分散均勻后加入14.8g1-氰基環(huán)己基乙腈，在35℃，200rpm下攪拌反應(yīng)8h后，抽濾，獲得濾液a和濾餅a。濾液a(hplc檢測1-氰基環(huán)己基乙酸濃度為1mm)用于下一步的催化加氫，濾餅a為固定化細(xì)胞，用于下一個批次的酶催化反應(yīng)。

(5)加巴噴丁的合成：取用蒸餾水稀釋4倍后的步驟(4)濾液a(1-氰基環(huán)己基乙酸濃度為250mm)100ml至加氫反應(yīng)釜中，加入約1.0graneyni(購自大連通用化工有限公司)，加入1ml(98％)三乙胺和0.5ml(98％)甲酸；通入氮?dú)庵脫Q空氣，置換3次后，通入1mpa氫氣于40℃，500rpm下保留12h后排除氫氣，升溫至50℃后再通入氫氣，保留12h后排除氫氣后，升溫至60℃通入氫氣后，保留12h。排除反應(yīng)釜內(nèi)的氣體后，將反應(yīng)液過濾，獲得濾液b和濾餅b，濾餅b為回收催化劑，濾液b冷卻至室溫。

(6)加巴噴丁的提純：取上述濾液b加入提前配制好的2mol/l甲酸水溶液調(diào)節(jié)ph至5.0左右；通過001×7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(購買自寧波爭光樹脂廠)吸附，完全吸附之后首先用蒸餾水洗滌，收集ph值在3.0-6.0范圍內(nèi)的流出液a，再用體積濃度為15％的氨水洗脫，收集ph值在7.5-13.0范圍內(nèi)的流出液b(即獲得含有加巴噴丁的洗脫液)。流出液b200ml在50℃下濃縮至20ml，獲得濃縮液a，再加入2倍體積的異丙醇靜置1h后再次在50℃下濃縮至10ml，獲得的濃縮液b加入2-5倍體積的異丙醇冰浴攪拌后在0-4℃下冷卻靜置，有白色晶體析出，抽濾后濾餅烘干即為加巴噴丁，質(zhì)量收率達(dá)到50％。流出液a(即未吸附在陽離子交換樹脂上的物質(zhì))為含有1-氰基環(huán)己基乙酸的轉(zhuǎn)化液，回收用于二次加氫使用。

剩余1-氰基環(huán)己基乙酸的循環(huán)利用：經(jīng)過hplc檢測，流出液a中1-氰基環(huán)己基乙酸未發(fā)生較大改變以及未引入其他雜質(zhì)。并與上述固定化細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化液(即步驟(4)濾液a)混合后濃度為215.6mm，按照上述加巴噴丁合成體系進(jìn)行二次加氫。在對1-氰基環(huán)己基乙酸進(jìn)行5次循環(huán)利用之后，加巴噴丁收率達(dá)到80％以上(1-氰基環(huán)己基乙酸的回收利用如圖4)。

實(shí)驗(yàn)例2：含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的轉(zhuǎn)化液直接加氫生產(chǎn)加巴噴丁

(1)加巴噴丁的合成：取實(shí)施例1中步驟(4)的含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的濾液a用蒸餾水稀釋4倍后(1-氰基環(huán)己基乙酸濃度為250mm)100ml至加氫反應(yīng)釜中，加入約1.0graneyni，加入1ml98％三乙胺和0.5ml98％甲酸；通入氮?dú)庵脫Q空氣，置換3次后，通入1mpa氫氣于30℃，500rpm下保留12h后排除氫氣，升溫至40℃，500rpm下保留12h后排除氫氣，升溫至50℃后再通入氫氣，保留12h后排除氫氣后，升溫至60℃通入氫氣后，保留12h，通入氫氣于70℃，500rpm下保留12h后排除氫氣，升溫至80℃后再通入氫氣，保留12h后排除氫氣后，反應(yīng)液降溫至60℃后，將反應(yīng)液過濾，獲得濾液b和濾餅b，濾餅b為回收催化劑，濾液b冷卻至室溫。反應(yīng)進(jìn)程見圖3中a所示。

(2)加巴噴丁的提純：取上述濾液b加入提前配制好的2mol/l甲酸水溶液調(diào)節(jié)ph至5.0左右；通過001×7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(購買自寧波爭光樹脂廠)吸附，完全吸附之后首先用蒸餾水洗滌，收集ph值在3.0-6.0范圍內(nèi)的流出液a，再用體積濃度為15％的氨水洗脫，收集ph值在7.5-13.0范圍內(nèi)的流出液b(即獲得含有加巴噴丁的洗脫液)。流出液b200ml在50℃下濃縮至20ml，獲得的濃縮液a加入2倍體積的異丙醇靜置1h后再次在50℃下濃縮至10ml，獲得的濃縮液b加入2-5倍體積的異丙醇冰浴攪拌后在0-4℃下冷卻靜置，有白色晶體析出，抽濾后濾餅烘干即為加巴噴丁，質(zhì)量收率達(dá)到48％。流出液a(即未吸附在陽離子交換樹脂上的物質(zhì))為含有1-氰基環(huán)己基乙酸的轉(zhuǎn)化液，回收用于二次加氫使用。

實(shí)驗(yàn)例3：含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的轉(zhuǎn)化液直接加氫生產(chǎn)加巴噴丁

(1)加巴噴丁的合成：取實(shí)施例1步驟(4)中的含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的濾液a用蒸餾水稀釋4倍后(1-氰基環(huán)己基乙酸濃度為250mm)100ml至加氫反應(yīng)釜中，加入約1.0gpd/c(pd質(zhì)量負(fù)載量10％)，1ml98％三乙胺和0.5ml98％甲酸；通入氮?dú)庵脫Q空氣，置換3次后，通入1mpa氫氣于40℃，500rpm下保留12h后排除氫氣，升溫至50℃后再通入氫氣，保留12h后排除氫氣后，升溫至60℃通入氫氣后，保留12h。排氣后，將反應(yīng)液過濾，獲得濾液b和濾餅b，濾餅b為回收催化劑，濾液b冷卻至室溫。

(2)加巴噴丁的提純：取上述濾液b加入提前配制好的2mol/l甲酸水溶液調(diào)節(jié)ph至5.0左右；通過001×7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(購買自寧波爭光樹脂廠)吸附，完全吸附之后首先用蒸餾水洗滌，收集ph值在3.0-6.0范圍內(nèi)的流出液a，再用體積濃度為15％的氨水洗脫，收集ph值在7.5-13.0范圍內(nèi)的流出液b(即獲得含有加巴噴丁的洗脫液)。流出液b300ml在50℃下濃縮至30ml，獲得濃縮液a，取濃縮液a加入2倍體積的異丙醇靜置1h后再次在50℃下濃縮至15ml，將獲得的濃縮液b加入2-5倍體積的異丙醇冰浴攪拌后在0-4℃下冷卻靜置，有白色晶體析出，抽濾后濾餅烘干即為加巴噴丁，質(zhì)量收率達(dá)到84％，但同時約有10％加巴噴丁內(nèi)酰胺。流出液a(即未吸附在陽離子交換樹脂上的溶液)為含有1-氰基環(huán)己基乙酸的轉(zhuǎn)化液，回收用于二次加氫使用。

結(jié)果表明，pd/c具有更佳的催化活力，但同時催化選擇性略低于raneyni。

實(shí)驗(yàn)例4：含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的轉(zhuǎn)化液直接加氫生產(chǎn)加巴噴丁。

(1)加巴噴丁的合成：取實(shí)施例1步驟(4)中的含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的濾液a用蒸餾水稀釋4倍后(1-氰基環(huán)己基乙酸濃度為250mm)100ml至加氫反應(yīng)釜中，加入約1.0graneyni，加入1.07ml98％三乙胺和0.43ml98％甲酸；通入氮?dú)庵脫Q空氣，置換3次后，通入1mpa氫氣于40℃，500rpm下保留12h后排除氫氣，升溫至50℃后再通入氫氣，保留12h后排除氫氣后，升溫至60℃通入氫氣后，保留12h，排氣后，將反應(yīng)液過濾，獲得濾液b和濾餅b，濾餅b為回收催化劑，濾液b冷卻至室溫。

(2)加巴噴丁的提純：取上述濾液b加入提前配制好的2mol/l甲酸水溶液調(diào)節(jié)ph至5.0左右；通過001×7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(購買自寧波爭光樹脂廠)吸附，完全吸附之后首先用蒸餾水洗滌，收集ph值在3.0-6.0范圍內(nèi)的流出液a，再用體積濃度為15％的氨水洗脫，收集ph值在7.5-13.0范圍內(nèi)的流出液b(即獲得含有加巴噴丁的洗脫液)。流出液b200ml在50℃下濃縮至20ml，獲得濃縮液a，將濃縮液a加入2倍體積的異丙醇靜置1h后再次在50℃下濃縮至10ml，將獲得的濃縮液b加入2-5倍體積的異丙醇冰浴攪拌后在0-4℃下冷卻靜置，有白色晶體析出，抽濾后濾餅烘干即為加巴噴丁，質(zhì)量收率達(dá)到60％。流出液a(即未吸附在陽離子交換樹脂上的溶液)為含有1-氰基環(huán)己基乙酸的轉(zhuǎn)化液，回收用于二次加氫使用。

結(jié)果表明，助劑中酸和堿的比例影響1-氰基環(huán)己基乙酸在該體系中加巴噴丁的合成，最合適體積比例為1:2。

實(shí)施例5：含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的轉(zhuǎn)化液直接加氫生產(chǎn)加巴噴丁。

(1)加巴噴丁的合成：取實(shí)施例1中步驟(4)的含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的濾液a用蒸餾水稀釋4倍后(1-氰基環(huán)己基乙酸濃度為250mm)100ml至加氫反應(yīng)釜中，加入約1.0gpd/c(pd質(zhì)量負(fù)載量10％)，加入1ml98％三乙胺和0.5ml甲酸。通入氮?dú)庵脫Q空氣，置換3次，不通入氫氣，直接在40℃，500rpm下保留12h，升溫至50℃保留12h，后再升溫至60℃保留12h，排氣后，將反應(yīng)液過濾，獲得濾液b和濾餅b，濾餅b為回收催化劑，濾液b冷卻至室溫。

(2)加巴噴丁的提純：取上述濾液b加入提前配制好的2mol/l甲酸水溶液調(diào)節(jié)ph至5.0左右；通過001×7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(購買自寧波爭光樹脂廠)吸附，完全吸附之后首先用蒸餾水洗滌，收集ph值在3.0-6.0范圍內(nèi)的流出液a，再用體積濃度為15％的氨水洗脫，收集ph值在7.5-13.0范圍內(nèi)的流出液b(即獲得含有加巴噴丁的洗脫液)。流出液b200ml在50℃下濃縮至20ml，獲得濃縮液a，再加入2倍體積的異丙醇靜置1h后再次在50℃下濃縮至10ml，獲得的濃縮液b加入2-5倍體積的異丙醇冰浴攪拌后在0-4℃下冷卻靜置，有白色晶體析出，抽濾后濾餅烘干即為加巴噴丁，質(zhì)量收率達(dá)到37.2％。流出液a(即未吸附在陽離子交換樹脂上的物質(zhì))為含有1-氰基環(huán)己基乙酸的轉(zhuǎn)化液，回收用于二次加氫使用。

結(jié)果表明，在該體系中，即使沒有氫氣作為氫供體，pd/c依然能夠催化部分1-氰基環(huán)己基乙酸加氫合成加巴噴丁，這是由于甲酸可以作為氫供體。

實(shí)施例6：含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化液直接加氫合成加巴噴丁

(1)加巴噴丁的合成：取實(shí)施例1中步驟(4)的含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的濾液a用蒸餾水稀釋4倍后(1-氰基環(huán)己基乙酸濃度為250mm)100ml至加氫反應(yīng)釜中，加入約1.0graneyni，加入0.715ml98％三乙胺和0.285ml甲酸；通入氮?dú)庵脫Q空氣，置換3次后，通入1mpa氫氣于40℃，500rpm下保留12h后排除氫氣，升溫至50℃后再通入氫氣，保留12h后排除氫氣后，升溫至60℃通入氫氣后，保留12h，排氣后，將反應(yīng)液過濾，獲得濾液b和濾餅b，濾餅b為回收催化劑，濾液b冷卻至室溫。

(2)加巴噴丁的提純：取上述濾液b加入提前配制好的2mol/l甲酸水溶液調(diào)節(jié)ph至5.0左右；通過001×7型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(購買自寧波爭光樹脂廠)吸附，完全吸附之后首先用蒸餾水洗滌，收集ph值在3.0-6.0范圍內(nèi)的流出液a，再用體積濃度為15％的氨水洗脫，收集ph值在7.5-13.0范圍內(nèi)的流出液b(即獲得含有加巴噴丁的洗脫液)。流出液b200ml在50℃下濃縮至20ml，獲得的濃縮液a加入2倍體積的異丙醇靜置1h后再次在50℃下濃縮至10ml，獲得濃縮液b加入2-5倍體積的異丙醇冰浴攪拌后在0-4℃下冷卻靜置，有白色晶體析出，抽濾后濾餅烘干即為加巴噴丁，質(zhì)量收率達(dá)到50.6％。流出液a(即未吸附在陽離子交換樹脂上的物質(zhì))為含有1-氰基環(huán)己基乙酸的轉(zhuǎn)化液，回收用于二次加氫使用。

結(jié)果表明，減少甲酸和三乙胺的加入量，對于加巴噴丁的積累具有一定的抑制。

實(shí)施例7：含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化液直接加氫生成加巴噴丁

加巴噴丁的合成：取實(shí)施例1中步驟(4)的含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的濾液a用蒸餾水稀釋4倍后(1-氰基環(huán)己基乙酸濃度為250mm)100ml至加氫反應(yīng)釜中，加入約1.0graneyni，加入1.0ml98％三乙胺和3.5ml2m的乙酸水溶液；通入氮?dú)庵脫Q空氣，置換3次后，通入1mpa氫氣于40℃，500rpm下保留12h后排除氫氣，升溫至50℃后再通入氫氣，保留12h后排除氫氣后，升溫至60℃通入氫氣后，保留12h，排氣后，將反應(yīng)液過濾，獲得濾液b和濾餅b，濾餅b為回收催化劑，濾液b冷卻至室溫。對濾液b進(jìn)行hplc檢測，加巴噴丁收率達(dá)到81.6％。

實(shí)施例8：含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化液直接加氫生成加巴噴丁

(1)加巴噴丁合成：取實(shí)施例1中步驟(4)含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的濾液a用蒸餾水稀釋4倍后(1-氰基環(huán)己基乙酸濃度為250mm)100ml至加氫反應(yīng)釜，加入約1.0graneyni，加入0.715ml98％三乙胺和0.285ml甲酸；通入氮?dú)庵脫Q空氣，置換3次后，通入1mpa氫氣于60℃，500rpm下反應(yīng)24h，排除氫氣后，將反應(yīng)液過濾，獲得濾液b和濾餅b，濾餅b為回收催化劑，濾液b冷卻至室溫。利用hplc檢測濾液b，結(jié)果顯示反應(yīng)液中只有少量的加巴噴丁生成，大部分產(chǎn)物為加巴噴丁內(nèi)酰胺，底物轉(zhuǎn)化率只有61.5％。反應(yīng)進(jìn)程見圖3中b所示。

結(jié)果表明，在某一溫度下進(jìn)行恒溫催化不利于加巴噴丁在該加氫體系中積累。

實(shí)施例9：含1-氰基環(huán)己基乙酸晶體直接加氫生成加巴噴丁

(1)1-氰基環(huán)己基乙酸晶體的提純：取實(shí)施例1中步驟(4)含1-氰基環(huán)己基乙酸的固定化細(xì)胞催化的濾液100ml(1-氰基環(huán)己基乙酸濃度為250mm)與0.6g活性炭混合后在60℃條件下攪拌1h，待混合液降溫至室溫后，抽濾，濾液用2mhcl溶液調(diào)節(jié)ph至2.0，此時有大量晶體析出，抽濾即可獲得1-氰基環(huán)己基乙酸晶體，在50℃過夜烘干，即可獲得干燥的1-氰基環(huán)己基乙酸晶體。

(2)加巴噴丁合成：取14.5g1-氰基環(huán)己基乙酸晶體溶于70ml甲醇，之后加入1grh/c(rh質(zhì)量負(fù)載量為5％)；通入氮?dú)庵脫Q空氣，置換3次后，通入0.5mpa氫氣于室溫下，反應(yīng)2h，排氣后，將反應(yīng)液過濾，獲得濾液b和濾餅b，濾餅b為回收催化劑，濾液b即為加氫反應(yīng)液，經(jīng)hplc檢測，發(fā)現(xiàn)只有少量的加巴噴丁生成，轉(zhuǎn)化率極低。

結(jié)果表明，rh/c在催化溶于甲醇的1-氰基環(huán)己基乙酸生成加巴噴丁時，催化活性低，無法達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。