專利名稱：一種快速檢測水環(huán)境中腸道病毒主要基因型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水環(huán)境中腸道病毒主要基因型的快速檢測方法，該方法根據(jù)腸道病毒RNA保守序列的通用引物，通過給引物添加GC夾板，利用半巢式PCR-DGGE技術(shù)檢測腸道病毒主要基因型，適用于水環(huán)境中分析腸道病毒主要基因型的快速檢測。
背景技術(shù)：
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)是以RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到互補(bǔ)DNA (cDNA)的第一條鏈，再以該cDNA鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，由此可將極微量的RNA在數(shù)小時(shí)內(nèi)以幾何倍數(shù)進(jìn)行特異性擴(kuò)増。半巢式PCR (semi-nested PCR)技術(shù)是ー種變異的PCR技術(shù)，其通過使用ー對半PCR引物完成核酸片段的擴(kuò)增。第一對PCR引物擴(kuò)增片段和普通PCR相似。第二對引物稱為半巢式引物(因其一條引物與第一對PCR引物中的一條 完全相同，但另外一條弓I物在第一次PCR擴(kuò)增片段的內(nèi)部)結(jié)合在第一次PCR產(chǎn)物內(nèi)部，使得第二次PCR擴(kuò)增片段短于第一次擴(kuò)增。半巢式PCR的好處在于，如果第一次擴(kuò)增產(chǎn)生了錯(cuò)誤片斷，則第二次能在錯(cuò)誤片段上進(jìn)行引物配對并擴(kuò)增的概率極低；且通過兩次PCR擴(kuò)增后，其檢測靈敏度大大提高。因此，半巢式PCR的擴(kuò)增非常特異，且靈敏度很好。DGGE即變性梯度凝膠電泳，是根據(jù)DNA在不同濃度的變性劑中解鏈行為的不同而導(dǎo)致電泳遷移率發(fā)生變化，從而將片段大小相同而堿基組成不同的DNA片段分開。即將特定的雙鏈DNA片段在含有從低到高的線性變性劑梯度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，隨著電泳的進(jìn)行，DNA片段向高濃度變性劑方向遷移，當(dāng)它到達(dá)其變性要求的最低濃度變性劑處，雙鏈DNA形成部分解鏈狀態(tài)，這就導(dǎo)致其遷移速率變慢，由于這種變性具有序列特異性，因此DGGE能根據(jù)核酸序列的差異將同樣大小的DNA片段很理想地分開，是ー種很有用分子標(biāo)記方法。現(xiàn)有的關(guān)于水環(huán)境中腸道病毒基因型分型方法并不多見，且在分析主要基因型時(shí)多采用大通量焦磷酸測序的方法，其費(fèi)用十分昂貴。雖然PCR-DGGE技術(shù)已應(yīng)用于環(huán)境微生物的細(xì)菌群落多祥性檢測及親緣關(guān)系鑒定等方面，但目前還沒有一套適用于水環(huán)境中腸道病毒基因分型的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于，提供一種水環(huán)境中腸道病毒主要基因型的檢測方法，以快速分析水環(huán)境中主要腸道病毒的基因型，并提高檢測的靈敏度和特異性。為了實(shí)現(xiàn)上述任務(wù)，本發(fā)明采取如下的技術(shù)方案ー種快速檢測水環(huán)境中腸道病毒主要基因型的方法，其特征在于，包括下列步驟步驟一，樣品采集用預(yù)先滅菌的采樣瓶在水面下O. 3m處采集水樣，水樣采集后放入4 °C冰箱內(nèi)保存；
步驟ニ，水樣的濃縮將含有腸道病毒的水樣加入聚こニ醇(PEG)6000和NaCl，使水樣中的聚こニ醇(PEG)6000濃度為8% (vol/vol)，NaCl的濃度為2. 3% (wt/vol)，于4°C過夜，80rpm攪拌混勻，12h后，于9，000X g，4°C離心30min，收集沉淀，將沉淀用ImL的超純水吹打混勻；步驟三，RNA提取利用RNA提取試劑盒提取病毒RNA ； 步驟四，去除基因組DNA :將5 μ L的RNA和2 μ L的5X g DNA Eraser Buffer混勻，加入I μ L的g DNA Eraser,并用無核酸酶超純水補(bǔ)足至10 μし42で水浴2min,以去除體系內(nèi)DNA對RNA的干擾；步驟五，逆轉(zhuǎn)錄向反應(yīng)液加入4μ L的5 X PrimeScript buffer, I μ L的PrimeScpript RT Enzyme Mix I, I μ L 的RT Primer Mix,用無核酸酶超純水補(bǔ)足至20 μ L,37°C水浴15min獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，85°C，5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，用此反應(yīng)液作為PCR模板；·步驟六，腸道病毒通用引物及其半巢式PCR擴(kuò)增
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腸道病毒通用引物包括，第一輪PCR上游引物EVl的核苷酸序列為5’ -CGG CCCCTG AAT GCG GC-3’ ；第二輪 PCR 上游引物 EVU1-GC 的核苷酸序列為:5，-CGC CCG CCG CGCCCC GCG CCC GTC CCG CCG CCCCCG CCC G-CCC CTG AAT GCG GCT AAT-3’(其中 GC 夾板為5，-CGCCCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3');下游引物 EV2 的序列為:5，-CAC CGG ATG GCC AAT CCA-3’ ；半巢式PCR擴(kuò)增包括第一輪PCR:取 2· 5μ L 的 IOXEx Taq Buffer，2 μ L 的 dNTP Mixture, 10 μ mol/L上游引物EVl和10μmol/L下游引物EV2各lμL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2 μ L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μ L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；第二輪PCR:取 2· 5μ L 的 IOXEx Taq Buffer，2 μ L 的 dNTP Mixture, 10 μ mol/L的上游引物EVUl-GC和10 μ mol/L的下游引物EV2各O. 75 μ L，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物2 μ L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μ L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為①95°C 預(yù)變性 5min ；②擴(kuò)增循環(huán)30 次95V，30s ；52°C，30s ；72°C, 30s ；③72°C 延伸 5min，4°C 冷卻；步驟七，瓊脂糖凝膠電泳檢測配制I. 5%的瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測，確定陽性樣本；步驟八，配制濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為09Γ100%，將陽性樣品進(jìn)行變性梯度凝膠電泳垂直膠檢測，60°C 250V電泳6h，以優(yōu)化變性梯度；步驟九，配制濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠，選擇合適的變性梯度，將陽性樣品進(jìn)行變性梯度凝膠電泳平行膠檢測，60°C 80V電泳15h，以分離不通腸道病毒的擴(kuò)增條帶，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測，將亮帶進(jìn)行割膠純化；步驟十，利用載體連接試劑盒將純化后產(chǎn)品進(jìn)行載體連接，運(yùn)用TSS轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)品轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，37°C 200rpm培養(yǎng)14 16h，篩選出陽性菌落，在含有Amp的LB
液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
步驟十一，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，利用連接載體其自身所具有引物進(jìn)行測序，確定完整的擴(kuò)增核酸序列，在NCBI的BLAST中進(jìn)行基因比對，確定基因型及核酸所在正負(fù)鏈；步驟十二，利用clustal X I. 83進(jìn)行序列比對分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。本發(fā)明的檢測方法由于采用了半巢式PCR，大幅度提高了水環(huán)境中腸道病毒檢測技術(shù)的靈敏度，并具有良好的特異性，同時(shí)結(jié)合DGGE方法能分離出不通基因型腸道病毒的
PCR擴(kuò)增片段，縮短了確定水環(huán)境中腸道病毒主要基因型分析鑒定的時(shí)間，避免了大通量測序所產(chǎn)生的昂貴費(fèi)用，且與環(huán)境中常見的其他病原微生物沒有交叉反應(yīng)，適用于地表水、污水等多種水樣的檢測。


圖I是該方法應(yīng)用于某校園污水處理系統(tǒng)中化糞池上清液、污水廠進(jìn)水及雜排水的半巢式PCR檢測結(jié)果；其中的標(biāo)記表示M、marker，l、某校園污水處理系統(tǒng)化糞池上清液(用于垂直膠優(yōu)化DGGE條件)，2、某校園污水處理系統(tǒng)化糞池上清液(用于平行膠分離腸道病毒)，3、污水廠進(jìn)水,4、雜排水，N、NTC。圖2是DGGE平行膠優(yōu)化變性梯度的電泳檢測圖；圖3是該方法應(yīng)用于某校園污水處理系統(tǒng)中化糞池上清液、污水廠進(jìn)水及雜排水的DGGE垂直膠檢測結(jié)果；其中的標(biāo)記表示A、某校園污水處理系統(tǒng)化糞池上清液(用于平行膠分離腸道病毒)，B、污水廠進(jìn)水，C、雜排水；圖4是依據(jù)測序結(jié)果建立的系統(tǒng)發(fā)育樹；以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式按照本發(fā)明的技術(shù)方案，首先根據(jù)腸道病毒在5’非編碼區(qū)這一區(qū)域核酸的保守性，采用腸道病毒通用引物進(jìn)行半巢式PCR。所述的腸道病毒通用引物包括，第一輪PCR上游引物EVl的核苷酸序列為5’-CGG CCC CTGAAT GCG GC-3’ ；第二輪PCR上游引物EVU1-GC的核苷酸序列為:5，-CGCCCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-CCCCTGAAT GCG GCT AAT-3，(其中 GC 夾板為 5，-CGC CCG CCG CGC CCCGCG CCC GTC CCG CCG CCCCCG CCC G-3’);下游引物EV2 的序列為:5，-CAC CGG ATG GCC AAT CCA-3’。經(jīng)過在GenBank數(shù)據(jù)庫上比對分析，與該通用引物具有高度相似性的序列都來源于腸道病毒，并未發(fā)現(xiàn)相似性較高的其他微生物序列。以下是發(fā)明人給出的具體實(shí)施例I、設(shè)備和試劑( I)高速冷凍離心機(jī)；(2)離心管；(3)4で冰箱；(4)磁力攪拌器；(5)金屬浴；(6)定性 PCR 儀；
(7)紫外凝膠成像儀；(8) Dcode基因突變檢測系統(tǒng)；(9)聚こニ醇(PEG)，分子量 6000 ;(10) NaCl ；(11)病毒RNA提取試劑盒；(12)去除基因組DNA試劑盒；(13)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；(14)定性PCR試劑盒；( 15)載體連接轉(zhuǎn)化試劑盒；(16)質(zhì)粒提取試劑盒；(17) LB液體培養(yǎng)基；(18)腸道病毒通用引物包括，第一輪PCR上游引物EVl的核苷酸序列為5’-CGGCCC CTG AAT GCG GC-3’ ；第二輪 PCR 上游引物 EVU1-GC 的核苷酸序列為:5，-CGC CCG CCGCGC CCC GCG CCC GTC CCG CCGCCC CCG CCC G-CCC CTG AAT GCG GCT AAT-3，(其中 GC 夾板為 5，-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3’ );下游引物 EV2的序列為5’-CAC CGG ATG GCC AAT CCA-3'。引物均由專業(yè)生物工程公司合成。2.測定程序(I)樣品采集用預(yù)先滅菌的采樣瓶采集水樣，在水面下O. 3m處取水樣，水樣采集后放入4°C冰箱內(nèi)保存，6h內(nèi)進(jìn)行檢測；(2)水樣的濃縮將含有腸道病毒的水樣加入聚こニ醇(PEG)6000和NaCl，使水樣中的聚こニ醇(PEG) 6000濃度為8% (vol/vol)，NaCl的濃度為2. 3% (wt/vol)，于4°C過夜，80rpm攪拌混勻，12h 14h后，于9，000X g，4°C離心30min，收集沉淀，將沉淀用ImL超純水吹打混勻；(3) RNA提取利用RNA提取試劑盒提取病毒RNA ；(4)去除基因組 DNA :將 5μ L RNA 和 2 μ L 5Xg DNA Eraser Buffer 混勻，加入I μ L g DNA Eraser,并用無核酸酶超純水補(bǔ)足至10 μ L，42°C水浴2min，以去除體系內(nèi)DNA對RNA的干擾；(5)逆轉(zhuǎn)錄向上述反應(yīng)液加入4 μ L 5XPrimeScript buffer, I μ LPrimeScpriptRT Enzyme Mix I, I μ L RT Primer Mix,用無核酸酶超純水補(bǔ)足至 20 μ L, 37°C水浴 15min獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，85°C，5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，用此反應(yīng)液作為PCR模板；(6)腸道病毒通用引物及其半巢式PCR擴(kuò)增腸道病毒通用引物包括，第一輪PCR上游引物EVl的核苷酸序列為5’ -CGG CCCCTG AAT GCG GC-3';第二輪PCR上游引物EVU1-GC 的核苷酸序列為:5，-CGC CCG CCG CGCCCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCGCCC G-CCC CTG AAT GCG GCT AAT-3’(其中 GC 夾板為5，-CGC CCGCCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3');下游引物 EV2 的序 列為5，-CAC CGG ATG GCC AAT CCA-3;；半巢式PCR擴(kuò)增包括第一輪PCR :取 2· 5μ L IOXEx Taq Buffer,2y L dNTP Mixture，10 μ mol/L 上游引物EVl和10μmol/L下游引物EV2各lμL，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2 μ L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μ L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；第二輪PCR :取 2· 5μ L IOXEx Taq Buffer,2y L dNTP Mixture，10 μ mol/L 上游引物EVUl-GC和10μmol/L下游引物EV2各0·75μL，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀釋的第ー輪PCR產(chǎn)物2 μ L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μ L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為①95°C 預(yù)變性 5min ；②擴(kuò)增循環(huán)30 次95V，30s ；52°C，30s ；72°C, 30s ；③72で延伸5min，4°C冷卻； (7)瓊脂糖凝膠電泳檢測配置I. 5%的瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測，確定陽性樣本；(8) DGGE條件優(yōu)化配制濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為0°/Γ 00%，將陽性樣品進(jìn)行變性梯度凝膠電泳垂直膠檢測，60°C 250V電泳6h，以優(yōu)化變性梯度；(9)DGGE檢測配制濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠，其合適的變性梯度為10°/Γ40%，將陽性樣品進(jìn)行變性梯度凝膠電泳平行膠檢測，60°C 80V電泳15h，以分離不通腸道病毒的擴(kuò)增條帶，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測，將亮帶進(jìn)行割膠純化；( 10)連接轉(zhuǎn)化利用載體連接試劑盒將純化后產(chǎn)品進(jìn)行載體連接，運(yùn)用TSS轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)品轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，37°C 200rpm培養(yǎng)14 16h，篩選出陽性菌落，在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(11)質(zhì)粒提取利用質(zhì)粒提取試劑盒提取感受:態(tài)細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，利用連接載體上自身所具有引物進(jìn)行測序，確定完整的擴(kuò)增核酸序列，在NCBI的BLAST中進(jìn)行基因比對，確定基因型及核酸所在正負(fù)鏈；(12)系統(tǒng)發(fā)育樹的建立利用clustal X I. 83進(jìn)行序列比對分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。參見圖1，該圖是將本發(fā)明的方法應(yīng)用于某校園污水處理系統(tǒng)中化糞池上清液、污水廠進(jìn)水及雜排水的半巢式PCR檢測結(jié)果；圖2給出了 DGGE平行膠優(yōu)化變性梯度的電泳檢測圖；圖3是采用本發(fā)明的方法應(yīng)用于某校園污水處理系統(tǒng)中化糞池上清液、污水廠進(jìn)水及雜排水的DGGE垂直膠檢測結(jié)果。圖4是依據(jù)條帶f 10的測序結(jié)果建立的系統(tǒng)發(fā)育樹。表I是經(jīng)DGGE分離條帶后所得基因序列。表I
權(quán)利要求
1.一種快速檢測水環(huán)境中腸道病毒主要基因型的方法，其特征在于，包括下列步驟 步驟一，樣品采集 用預(yù)先滅菌的 采樣瓶采集 水樣，在水面下O. 3m處取水樣，水樣采集后放入4°C冰箱內(nèi)保存； 步驟二，水樣的濃縮 將含有腸道病毒的水樣加入聚乙二醇(PEG) 6000和NaCl，使水樣中的聚乙二醇(PEG)·6000 濃度為 8% (vol/vol),NaCl 的濃度為 2. 3% (wt/vol),于 4°C,80rpm 攬拌混勻,12h 后，于9，000 X g，4°C離心30min，收集沉淀，將沉淀用ImL超純水吹打混勻； 步驟三，RNA提取 利用RNA提取試劑盒提取病毒RNA ； 步驟四，去除基因組DNA: 將 5 μ L RNA 和 2 μ L 5 X g DNA Eraser Buffer 混勻，加入 IyLg DNAEraser,并用無核酸酶超純水補(bǔ)足至10 μ L，42°C水浴2min，以去除體系內(nèi)DNA對RNA的干擾； 步驟五，逆轉(zhuǎn)錄 向上述反應(yīng)液力口入 4μ L 5XPrimeScript buffer, I μ L PrimeScpript RTEnzyme MixI,luL RT Primer Mix，用無核酸酶超純水補(bǔ)足至20 μ L，37°C水浴15min獲得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，85°C，5s滅活反轉(zhuǎn)錄酶，用此反應(yīng)液作為PCR模板； 步驟六，腸道病毒通用引物及其半巢式PCR擴(kuò)增 腸道病毒通用引物包括，第一輪PCR上游引物EVl的核苷酸序列為5’-CGG CCC CTGAAT GCG GC-3，； 第二輪PCR上游引物EVUl-GC的核苷酸序列為5’-CGC CCG CCGCGC CCC GCG CCC GTCCCG CCG CCC CCG CCC G-CCC CTG AATGCG GCT AAT-3’，其中，GC 夾板為:5，-CGC CCG CCGCGC CCC GCGCCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC G-3，； 下游引物 EV2 的序列為5’-CAC CGG ATG GCC AAT CCA-3’ ； 半巢式PCR擴(kuò)增包括 第一輪 PCR :取 2· 5μ L IOXEx Taq Buffer,2y L dNTP Mixture，10 μ mol/L 上游引物EVl和10 μ mol/L下游引物EV2各I μ L，Ex Taq酶2U，加入模板cDNA2 μ L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μ L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增； 第二輪 PCR :取 2· 5μ L IOXEx Taq Buffer,2y L dNTP Mixture，10 μ mol/L 上游引物EVUl-GC和10 μ mol/L下游引物EV2各0.75 μ L，Ex Taq酶2U，加入1000倍稀釋的第一輪PCR產(chǎn)物2 μ L，用無菌超純水補(bǔ)足至25 μ L，以無菌超純水作模板為陰性對照，在定性PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增； 兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為 ①95°C預(yù)變性5min；②擴(kuò)增循環(huán)30 次95°C,30s ； 52 °C, 30s ；72°C,30s ； ③72°C延伸5min，4°C冷卻； 步驟七，瓊脂糖凝膠電泳檢測配制I. 5%的瓊脂糖凝膠，100V電泳30min，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測，確定陽性樣本； 步驟八，配制濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為09Γ100%，將陽性樣品進(jìn)行變性梯度凝膠電泳垂直膠檢測，60°C 250V電泳6h，以優(yōu)化變性梯度； 步驟九，配制濃度為10%的聚丙烯酰胺凝膠，其合適的變性梯度為109Γ40%，將陽性樣品進(jìn)行變性梯度凝膠電泳平行膠檢測，60°C 80V電泳15h，以分離不通腸道病毒的擴(kuò)增條帶，在凝膠成像儀下進(jìn)行成像檢測，將亮帶進(jìn)行割膠純化； 步驟十，利用載體連接試劑盒將純化后產(chǎn)品進(jìn)行載體連接，運(yùn)用TSS轉(zhuǎn)化法將連接產(chǎn)品轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，370C 200rpm培養(yǎng)14 16h，篩選出陽性菌落，在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)； 步驟十一，利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，利用連接載體上自身所具有引物進(jìn)行測序，確定完整的擴(kuò)增核酸序列，在NCBI的BLAST中進(jìn)行基因比對，確定基因型及核酸所屬正負(fù)鏈； 步驟十二，利用clustal X I. 83進(jìn)行序列比對分析，建立系統(tǒng)發(fā)育樹。
2.如權(quán)利要求I所述的定性檢測方法，其特征在于，對于腸道病毒通用引物通過附帶GC夾板后經(jīng)PCR擴(kuò)增，DGGE平行膠檢測，進(jìn)而快速分析水環(huán)境中的腸道病毒不同基因型。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速檢測水環(huán)境中腸道病毒主要基因型的方法，該方法根據(jù)道病毒RNA在5’非編碼區(qū)這一段核酸的保守性，利用腸道病毒通用引物進(jìn)行半巢式PCR擴(kuò)增，結(jié)合DGGE分析方法來鑒定水環(huán)境中主要腸道病毒的基因型。由于采用了半巢式PCR，大幅度提高了水環(huán)境中腸道病毒檢測技術(shù)的靈敏度，并具有良好的特異性，同時(shí)結(jié)合DGGE方法能分離出不通基因型腸道病毒的PCR擴(kuò)增片段，縮短了確定水環(huán)境中腸道病毒主要基因型分析鑒定的時(shí)間，避免了大通量測序所產(chǎn)生的昂貴費(fèi)用，且與環(huán)境中常見的其他病原微生物沒有交叉反應(yīng)。適用于地表水、污水等多種水樣的檢測。
文檔編號C12Q1/70GK102676699SQ201210157470
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月21日
發(fā)明者三浦尚之, 佐野大輔, 吉錚, 徐麗梅, 王曉昌 申請人:西安建筑科技大學(xué)