專利名稱：一種白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化菌種篩選、菌種鑒定及利用該菌種進行白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物活性物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化技術(shù)領(lǐng)域，特別是一種能高效將白藜蘆醇類似物轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的菌種的篩選方法及菌種鑒定及利用該菌種進行白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化的方法。
背景技術(shù)：
白藜蘆醇作為天然活性物，在自然界中含量低，而白藜蘆醇與葡萄糖結(jié)合的糖甙類物質(zhì)——白藜蘆醇苷，則含量較高，研究有效提高白藜蘆醇產(chǎn)量的途徑具有重要的產(chǎn)業(yè)化意義。都建立等建立一種化學(xué)合成方法，白藜蘆醇的總收率41.9%，僅三步就成功的合成了白藜蘆醇(都建立，鄒永，肖春芬.白藜蘆醇的簡便合成.精細化工，2009，26 (6)580-584)。丁劉剛等改進了 Wittig反應(yīng)，產(chǎn)率可65. 3% (丁劉剛，晏日安，黃雪松等.白藜蘆醇合成過程中雙鍵形成方法的研究.現(xiàn)代食品科技，2007，23 (I) :48-49)。Moro等以重氮鹽為離去基團用3步反應(yīng)合成白藜蘆醇，總收率達72% (Moro. et al. 2008)。雖然化學(xué)合成白藜蘆醇的方法取得了較大的進展，但是所有的方法都存在著，合成成本高，污染大，產(chǎn)品安全性差等問題，均有待進一步改進。生物轉(zhuǎn)化與化學(xué)催化相比，具有選擇性及專一性強，催化效率高，反應(yīng)過程條件溫，應(yīng)用范圍廣，綠色，天然等多項優(yōu)點，生物轉(zhuǎn)化中使用的是天然生物催化劑，包括微生物、植物、動物及其酶都是可再生的，并且使用后易被降解。從白藜蘆醇轉(zhuǎn)化菌種的篩選出發(fā)，獲得具產(chǎn)有轉(zhuǎn)化能力的菌種，并對其進行較準確的鑒定，保證其安全性，具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述缺點，本發(fā)明提供一種能高效將白藜蘆醇苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇的菌種的篩選方法及菌種鑒定方法，還提供一種利用為該菌種進行白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化的方法，可以有效提高虎杖中白藜蘆醇類似物的轉(zhuǎn)化率，具有高效、安全及低成本的特點。為達到上述目的，本發(fā)明的實施方案為一種白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化菌種的篩選方法，包括以下步驟I)取打碎的虎杖置于燒杯中，向其中加入去離子水，料液重量體積比為lg/2ml，靜置24h，得虎杖浸出液；2)取富集培養(yǎng)基分裝至若干個三角燒瓶中，分別標號并加入虎杖浸出液20 iiL，封口于28°C、避光、200r/min下震蕩培養(yǎng)4d后，采用TLC方法檢測，得出轉(zhuǎn)化效率最高的培養(yǎng)液；3)將轉(zhuǎn)化效率最高的培養(yǎng)液于篩選培養(yǎng)基上做梯度稀釋涂板，于28°C下培養(yǎng)，然后觀察是否有能形成水解圈的菌種長出，挑出單菌落重復(fù)操作，48h后觀察水解圈形成情況；4)取水解圈培養(yǎng)基，用甲醇提取，水解圈培養(yǎng)基/甲醇=lg/10ml，稀釋后進行TLC分析，并對白藜蘆醇生成的提取物進行HPLC分析，觀察白藜蘆醇生成情況，根據(jù)得到的水解圈及白藜蘆醇生成情況得到具有高轉(zhuǎn)化能力的菌種S-4。步驟2)中，所述富集培養(yǎng)基由以下方法制得a)稱取硝酸鈉0. 3g，磷酸氫二鉀0. lg，MgSO4 *7H200. 05g，氯化鉀0. 05g，硫酸亞鐵
0.OOlg于容量瓶，蒸餾水定容至IOOmL,即得基礎(chǔ)培養(yǎng)基；b)將無菌白藜蘆醇苷IOOmg加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制得富集培養(yǎng)基。c)在步驟a)所得基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基重量I. 5%的瓊脂固定，使用前加熱溶解，冷卻至50°C時稱取無菌白藜蘆醇苷IOOmg加入其中，充分混勻，即得篩選培養(yǎng)基。上述步驟中，所述無菌白藜蘆醇苷是在無菌工作環(huán)境下將白藜蘆醇苷加入無菌乙醇中，自然揮干所得，白藜蘆醇苷無菌乙醇=0.5g 10ml。上述菌種S-4的鑒定方法包括以下步驟I)菌種的形態(tài)學(xué)觀察，將PDA固體培養(yǎng)，察氏固體培養(yǎng)基倒平板，冷凝后用接種鉤挑取菌絲少許，點接于平板，30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h以上，觀察菌落形成的過程和形態(tài)；2)用水浸片法制片,在干凈的載波片中央滴加一滴乳酸石炭酸藍棉液,用解剖針從菌落邊緣劃取菌絲體一小塊，放入乳酸石炭酸藍棉液中，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌株的菌絲有無橫隔、足細胞，觀察孢子的形狀大小和著生方式及其孢子梗；3)參照真菌提取試劑盒附帶提取方法操作提取菌種基因組DNA，配制好PCR擴增體系，然后在PCR儀上進行擴增，完成后經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳后，觀察與拍攝結(jié)果； 4)將得到的菌株ITS序列用GenBank中的Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的其它菌株進行比較分析，得出相似性。本發(fā)明的菌種鑒定為卡門培爾青霉。利用上述菌種轉(zhuǎn)化白藜蘆醇類似物為白藜蘆醇的工藝，包括以下步驟I)取打碎的虎杖置于燒杯中，向其中加入去離子，料液重量體積比為lg/2ml，靜置16-24h得虎杖浸出液；2)另取PDA培養(yǎng)基裝容器中，加入虎杖浸出液，封口，得虎杖苷溶液；3)將菌液加入虎杖苷溶液中，菌液和虎杖苷溶液的體積比為0. 5 1，封口于28°C、避光、200r/min下震蕩培養(yǎng)4d。采用高效液相色譜分析表明，該菌種的培養(yǎng)液具有很強的催化能力，能將白藜蘆醇苷完全轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇。同時菌株利用生成的葡萄糖作為碳源，不具有催化能力的菌種會在生長過程中慢慢消亡。
具體實施例方式實施例I :白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化菌種的篩選方法，具體步驟是(I)白藜蘆醇苷前處理及培養(yǎng)基配置無菌工作環(huán)境下將0. 5g白藜蘆醇苷加入IOmL無菌乙醇中，自然揮干，得無菌白藜蘆醇苷備用；稱量硝酸鈉0. 3g，磷酸氫二鉀0. Ig,硫酸鎂(MgSO4 *7H20) 0. 05g,氯化鉀0. 05g,硫酸亞鐵0. OOlg于容量瓶，蒸餾水定容至IOOmL,即得基礎(chǔ)培養(yǎng)基。使用前稱取無菌白藜蘆醇苷IOOmg加入已滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制備富集培養(yǎng)基。(2)同理，使用上述基礎(chǔ)培養(yǎng)基并添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基重量I. 5%瓊脂固定，使用前加熱溶解，冷卻至50°C時稱取無菌白藜蘆醇苷IOOmg加入其中，充分混勻，防止結(jié)塊，即得篩
選培養(yǎng)基。(3)白藜蘆醇與白藜蘆醇苷TLC與HPLC檢測方法 標準品采用甲醇稀釋5倍后，于展開劑為氯仿丙酮無水乙醇水=4 4 0. 5 0.2的TLC條件下測定Rf值。采用色譜條件迪馬C18鉆石柱(200 X 4. 6mm)；檢測波長306nm;流動相A(0.05%磷酸水溶液)，B(乙腈)，A B = 65 35 ;流速ImL/min ;進樣體積lOiiL。同時，使用外標法建立標準曲線，建立白藜蘆醇與白藜蘆醇苷同時檢測的有效條件。(4)菌種的篩選取打碎的虎杖10. Og置于燒杯中，向其中加入20mL去離子，靜置24h，得虎杖浸出液備用。另取富集培養(yǎng)基分裝至5個三角燒瓶中，分別標號并加入虎杖浸出液20y L，封口于28°C、避光、200r/min下震蕩培養(yǎng)4d后，采用TLC方法檢測。將轉(zhuǎn)化效率最高的培養(yǎng)液于篩選培養(yǎng)基上做梯度稀釋涂板，于28°C下培養(yǎng)，然后觀察是否有能形成水解圈的菌種長出，挑出單菌落重復(fù)操作，48h后觀察水解圈形成情況。取水解圈培養(yǎng)基，用刀片切出lg，用IOmL甲醇提取后，稀釋后進行TLC分析，并對白藜蘆醇生成的提取物進行HPLC分析，觀察白藜蘆醇生成情況。根據(jù)得到水解圈及白藜蘆醇生成情況得到具有高轉(zhuǎn)化能力的菌種S-4。實施例2 :白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化菌種的鑒定方法。對待鑒定菌種S-4分別進行形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定，具體方法是I)菌種的形態(tài)學(xué)觀察，將PDA固體培養(yǎng)，察氏固體培養(yǎng)基倒平板，冷凝后用接種鉤挑取菌絲少許，點接于平板，30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h以上，觀察菌落形成的過程和形態(tài)；2)用水浸片法制片,在干凈的載波片中央滴加一滴乳酸石炭酸藍棉液,用解剖針從菌落邊緣劃取菌絲體一小塊，放入乳酸石炭酸藍棉液中，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察。觀察菌株的菌絲有無橫隔、足細胞，觀察孢子的形狀大小和著生方式及其孢子梗；3)參照真菌提取試劑盒附帶提取方法操作提取菌種基因組DNA。按照表I所示配制好PCR擴增體系，然后在PCR儀上進行擴增。完成后經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳后，觀察與拍攝結(jié)果； 表I菌種18SrDNA片段PCR擴增體系
權(quán)利要求
1.一種白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化菌種的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟 1)取打碎的虎杖置于燒杯中，向其中加入去離子水，料液重量體積比為lg/2ml，靜置24h，得虎杖浸出液； 2)取富集培養(yǎng)基分裝至若干個三角燒瓶中，分別標號并加入虎杖浸出液20ii L，封口于28°C、避光、200r/min下震蕩培養(yǎng)4d后，采用TLC方法檢測，得出轉(zhuǎn)化效率最高的培養(yǎng)液； 3)將轉(zhuǎn)化效率最高的培養(yǎng)液于篩選培養(yǎng)基上做梯度稀釋涂板，于28°C下培養(yǎng)，然后觀察是否有能形成水解圈的菌種長出，挑出單菌落重復(fù)操作，48h后觀察水解圈形成情況； 4)取水解圈培養(yǎng)基，用甲醇提取，水解圈培養(yǎng)基/甲醇=lg/10ml，稀釋后進行TLC分析，并對白藜蘆醇生成的提取物進行HPLC分析，觀察白藜蘆醇生成情況，根據(jù)得到的水解圈及白藜蘆醇生成情況得到具有高轉(zhuǎn)化能力的菌種S-4。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化菌種的篩選方法，其特征在于，步驟2)中，所述富集培養(yǎng)基的制備方法是，稱取硝酸鈉0. 3g，磷酸氫二鉀0. lg，MgSO4 WH2OO. 05g，氯化鐘0. 05g，硫酸亞鐵0. OOlg于容量瓶，蒸餾水定容至IOOmL,即得基礎(chǔ)培養(yǎng)基；使用前稱無菌白藜蘆醇苷IOOmg加入已滅菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，制得富集培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化菌種的篩選方法，其特征在于，步驟3)中，所述篩選培養(yǎng)基的制備方法是，稱取硝酸鈉0. 3g，磷酸氫二鉀0. lg，MgSO4 *7H200. 05g，氯化鉀0. 05g，硫酸亞鐵0. OOlg于容量瓶，蒸餾水定容至IOOmL,即得基礎(chǔ)培養(yǎng)基；在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基重量I. 5%的瓊脂固定，使用前加熱溶解，冷卻至50°C時稱取無菌白藜蘆醇苷IOOmg加入其中，充分混勻，即得篩選培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化菌種的篩選方法，其特征在于，所述無菌白藜蘆醇苷是在無菌工作環(huán)境下將白藜蘆醇苷加入無菌乙醇中，自然揮干所得，白藜蘆醇苷無菌乙醇=0. 5g 10ml。
5.一種白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化菌種的鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟 1)菌種的形態(tài)學(xué)觀察，將PDA固體培養(yǎng)，察氏固體培養(yǎng)基倒平板，冷凝后用接種鉤挑取菌絲少許，點接于平板，30°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)48h以上，觀察菌落形成的過程和形態(tài)； 2)用水浸片法制片，在干凈的載波片中央滴加一滴乳酸石炭酸藍棉液，用解剖針從菌落邊緣劃取菌絲體一小塊，放入乳酸石炭酸藍棉液中，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌株的菌絲有無橫隔、足細胞，觀察孢子的形狀大小和著生方式及其孢子梗； 3)參照真菌提取試劑盒附帶提取方法操作提取菌種基因組DNA，配制好PCR擴增體系，然后在PCR儀上進行擴增，完成后經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳后，觀察與拍攝結(jié)果； 4)將得到的菌株ITS序列用GenBank中的Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的其它菌株進行比較分析，得出相似性。
6.一種利用如權(quán)利要求所述的方法篩選的菌種進行白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化的方法，包括以下步驟 1)取打碎的虎杖置于燒杯中，向其中加入去離子，料液重量體積比為lg/2ml，靜置16-24h得虎杖浸出液； 2)另取PDA培養(yǎng)基裝容器中，加入虎杖浸出液，封口，得虎杖苷溶液； 3)將菌液加入虎杖苷溶液中，菌液和虎杖苷溶液的體積比為0.5 1，封口于28°C、避光、200r/min下震蕩培養(yǎng)4d。
全文摘要
一種白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化菌種篩選、菌種鑒定及進行白藜蘆醇生物轉(zhuǎn)化的方法，篩選方法是將富集培養(yǎng)基加入虎杖浸出液中，封口于28℃、避光、200r/min下震蕩培養(yǎng)4d后，將得出轉(zhuǎn)化效率最高的培養(yǎng)液于篩選培養(yǎng)基上做梯度稀釋涂板，于28℃下培養(yǎng)，得水解圈培養(yǎng)基，用甲醇提取，經(jīng)TLC分析和HPLC分析，得到具有高轉(zhuǎn)化能力的菌種S-4。經(jīng)鑒定，該菌種為卡門培爾青霉。該菌種的培養(yǎng)液具有很強的催化能力，能將白藜蘆醇苷完全轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，同時菌株利用生成的葡萄糖作為碳源，不具有催化能力的菌種會在生長過程中慢慢消亡。本發(fā)明為白藜蘆醇的高效、安全及低成本的生產(chǎn)具有重要的意義。
文檔編號C12Q1/04GK102703331SQ20121018878
公開日2012年10月3日 申請日期2012年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月11日
發(fā)明者曹庸, 李赟, 陳雪香 申請人:曹庸