專利名稱：一種篩選功能菌群的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種篩選功能菌群的方法。
背景技術(shù)：
目前菌種的篩選方法一般有如下兩種単一菌的純化篩選和自然發(fā)酵物菌劑的篩選制備。単一菌的純化篩選是根據(jù)所需的功能要求從自然界中分離、純化，得到目的単一菌；自然發(fā)酵物菌劑篩選是將自然材料按ー定比例混合堆積，使其在自然條件下緩慢發(fā)酵，得到自然發(fā)酵菌劑。但是上述兩種菌篩選方法均有不足， 影響其實(shí)際應(yīng)用價值。單ー菌在純化過程中，一方面失去了與自然條件下長期處于協(xié)同關(guān)系的其它菌共存的機(jī)會，導(dǎo)致該單ー菌功能大大降低；另ー方面，単一菌的純化使其對生長條件的適應(yīng)范圍越來越狹窄，對發(fā)酵條件要求高，發(fā)酵成本昂貴；再者，單ー菌孤立生長，容易受到其它菌的污染和抑制，難以生長和發(fā)揮功能。自然發(fā)酵物菌劑中所含的菌種是在自然的被動發(fā)酵過程中無序地集合而成的多菌聯(lián)合體，無法掌握其菌種組成，缺乏科學(xué)性，使用效果難以控制；而且自然發(fā)酵物菌劑的發(fā)酵過程遵循被動的自然循環(huán)規(guī)律，其分解效率低，效果不穩(wěn)定。因此，為了提高生產(chǎn)效率，需要建立一種高效的菌篩選方法，使得到的菌保留原來功能、應(yīng)用成本低且效果可控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過長期的研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)微生物從原來棲息的生境中分離、純化培養(yǎng)時許多功能被削弱或喪失。因此，多數(shù)微生物是形成ー種特殊群體，依靠群體內(nèi)部各成員的協(xié)同作用才充分發(fā)揮應(yīng)有的功能的。由此，本發(fā)明發(fā)明人發(fā)明了如下保留協(xié)同作用菌群的菌分離方法。以微生物群的功能為核心，在不破壞功能群體的協(xié)同關(guān)系的前提下，采用各種限制性手段逐漸排除與功能無關(guān)的微生物種類，保留核心功能群體，定向馴化成高效而穩(wěn)定的協(xié)同群體。其中的穩(wěn)定包括微生物功能的穩(wěn)定和菌種組成的穩(wěn)定。功能穩(wěn)定表現(xiàn)在經(jīng)過多次的繼代，菌種功能不退化并且抗逆性強(qiáng)(更廣的PH適用范圍、更廣的適用溫度等)，菌種穩(wěn)定性表現(xiàn)在經(jīng)過多代的繼代培養(yǎng)，菌種組成不發(fā)生變化。本發(fā)明的ー個目的是提供一種篩選功能菌群的方法。本發(fā)明所提供的篩選功能菌群的方法，由如下步驟組成I)選取含有功能菌群的基質(zhì)；2)將所述基質(zhì)接種于限制性培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，再傳代培養(yǎng)；3)建立評價所述功能菌群功能的指標(biāo)；在每代培養(yǎng)過程中檢測所述指標(biāo)和檢測所述功能菌群中菌種組成是否穩(wěn)定；4)若在某代培養(yǎng)過程中，所述指標(biāo)符合對所述功能菌群的功能要求，且所述菌種組成穩(wěn)定，則所述某代培養(yǎng)過程中得到所述功能菌群；所述限制性培養(yǎng)基為所述功能菌群在其中生長而非所述功能菌群不在其中生長
的培養(yǎng)基。
上述過程中，所述培養(yǎng)的條件與所述功能菌群在所述基質(zhì)中生存的條件相同。所述培養(yǎng)的條件為溫度、光照、厭氧或好氧等。上述過程中，所述功能菌群具體可為分解木質(zhì)纖維素的菌群。上述篩選分解木質(zhì)纖維素的菌群的過程中，所述基質(zhì)可為秸桿柴垛腐爛的垛底、常年堆積的秸桿及樹葉。上述篩選分解木質(zhì)纖維素的菌群的過程中，所述限制性培養(yǎng)基由終濃度為5g/L的蛋白胨、終濃度為lg/L的酵母提取物、終濃度為5g/L的NaCl、終濃度為lg/L的K2HPO4,終濃度為O. 35g/L的MgSO4 · 7H20、終濃度為3g/L的CaCO3和終濃度為O. lg/L (作為底物)的秸桿組成；所述終濃度為各物質(zhì)在所述限制性培養(yǎng)基中的濃度。上述篩選分解木質(zhì)纖維素的菌群的過程中，所述評價所述功能菌群功能的指標(biāo)為 秸桿分解率；所述指標(biāo)符合對所述功能菌群的功能要求為秸桿分解率在所述傳代培養(yǎng)的各代間穩(wěn)定。上述過程中，所述功能菌群還可為用于制備秸桿發(fā)酵飼料的菌群。上述篩選用于制備秸桿發(fā)酵飼料的菌群的過程中，所述基質(zhì)為農(nóng)作物秸桿、農(nóng)作物賴以生長的土壤或農(nóng)作物秸桿與農(nóng)作物賴以生長的土壤的混合物；所述培養(yǎng)基為R-MRS
培養(yǎng)基。上述篩選用于制備秸桿發(fā)酵飼料的菌群的過程中，所述評價所述功能菌群功能的指標(biāo)為乳酸產(chǎn)率和PH值下降速度；所述指標(biāo)符合對所述功能菌群的功能要求為所述乳酸產(chǎn)率在所述傳代培養(yǎng)的各代間穩(wěn)定，和所述PH值下降速度12小時可將pH從6. 4降至3. 8。上述任一所述過程中，所述檢測所述功能菌群中菌種組成是否穩(wěn)定的方法為在所述傳代培養(yǎng)過程中，PCR擴(kuò)增每代培養(yǎng)中的所述功能菌群的16S rDNA基因，得到各代的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，比較各代的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的圖譜，若圖譜穩(wěn)定不變，則所述功能菌群中菌種組成穩(wěn)定。上述方法中，所述基質(zhì)具體可以為根據(jù)所需要的功能從自然界中或其它環(huán)境中選擇的具有所需功能菌群的基質(zhì)，如菌群附著的材料(如枯枝爛葉、土壌、植物材料等)。上述方法中，是用適宜優(yōu)勢菌生長的限制性培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)來逐步淘汰功能弱、適應(yīng)性弱的其它雜菌的，并且在培養(yǎng)基中添加1% -5%的秸桿、植物材料或待降解物作為底物；選擇培養(yǎng)的條件需模擬所需功能菌群在基質(zhì)中生存時的條件。上述方法中，所述指標(biāo)，具體可以根據(jù)篩選目的而定，簡便、直觀更好。實(shí)際應(yīng)用中，本領(lǐng)域技術(shù)人員事先知道要篩選什么類型的功能菌群，如分解纖維素的菌群，通過現(xiàn)有技術(shù)也知道所要篩選的功能菌群適合什么培養(yǎng)基及適合什么培養(yǎng)條件。本發(fā)明方法得到的功能菌群能夠繼續(xù)保持各種菌間的協(xié)同作用，組成穩(wěn)定，功能強(qiáng)大，不會因?yàn)閺淖匀唤绲姆蛛x而削弱作用力；另外，本發(fā)明方法操作簡單、成本低廉，省時省力。因此，本發(fā)明方法在功能菌的篩選領(lǐng)域?qū)袕V闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
實(shí)施例I、篩選分解木質(zhì)纖維素的復(fù)合菌群一、復(fù)合菌群的篩選I、菌源將秸桿柴垛的腐爛垛底作為菌源。因?yàn)榻諚U柴垛中的秸桿的主要成分是木質(zhì)纖維素，柴垛腐爛表明是秸桿腐爛，進(jìn)而說明是木質(zhì)纖維素被降解，木質(zhì)纖維素被降解一定是由于分解木質(zhì)纖維素的菌群所致， 由此可斷定腐爛的秸桿中一定含有分解木質(zhì)纖維素的菌群，則腐爛垛底中一定含有分解木質(zhì)纖維素的菌群，所以將腐爛垛底作為菌源；腐爛垛底為分解木質(zhì)纖維素的菌群的棲息基質(zhì)，其中含有腐爛秸桿、土壌、分解木質(zhì)纖維素的菌群等。2、限制性培養(yǎng)和篩選實(shí)驗(yàn)組取5. Og菌源樣品接種到盛有150ml限制性培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，三角瓶中含有已滅菌的O. 15g水稻稻桿和lcmX6cm的濾紙條,在室溫(34°C )、150rpm/min條件下震蕩培養(yǎng)，至濾紙條顔色變?yōu)辄S色(記作第O代培養(yǎng))，將三角瓶中的所有物質(zhì)一起稱作培養(yǎng)物；當(dāng)濾紙條顔色變?yōu)辄S色后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接到新鮮的限制性培養(yǎng)基內(nèi)，接種量為5%(體積百分比)，在與第O代相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，至濾紙條顔色變?yōu)辄S色后，再進(jìn)行轉(zhuǎn)接傳代，如此培養(yǎng)數(shù)代。在上述傳代培養(yǎng)過程中，每代都檢測秸桿的分解率，檢測時間為從接種開始計起第I天，從第5天開始檢測分解率。在上述傳代培養(yǎng)過程中，每代都檢測培養(yǎng)物中菌群的16S rDNA組成是否穩(wěn)定，從而檢測培養(yǎng)物中菌種組成是否穩(wěn)定，檢測時間為從接種開始計起第I天(接種當(dāng)天記作第I天)，第5天檢測16S rDNA。上述培養(yǎng)及檢測過程，均設(shè)對照組，對照組中除三角瓶中不添加任何秸桿外，其余均與實(shí)驗(yàn)組相同。對照組的目的在于消除秸桿分解率計算時菌體及培養(yǎng)基的影響。當(dāng)秸桿分解率高且傳代間穩(wěn)定、傳代間菌種組成穩(wěn)定時，相應(yīng)代的培養(yǎng)物中即含有所需分解木質(zhì)纖維素的菌群。如果菌群穩(wěn)定，降解率就會穩(wěn)定。限制性培養(yǎng)基為蛋白胨纖維素培養(yǎng)液(PCS)改良培養(yǎng)基，由終濃度為5g/L的蛋白胨、終濃度為lg/L的酵母提取物、終濃度為5g/L的NaCl、終濃度為lg/L的K2HPO4、終濃度為O. 35g/L的MgSO4 · 7H20和終濃度為3g/L的CaCO3組成，所述終濃度為各物質(zhì)在培養(yǎng)基中的濃度。3、秸桿分解率的測量方法及菌種組成的檢測方法( I)秸桿分解率的檢測方法分別稱量分解前和分解后的秸桿重量，按照下述公式計算得到分解率分解率=(分解前的稻桿重量-分解后的稻桿重量)/分解前的稻桿重量。分解前的秸桿重量為O. 15g ;分解后的秸桿重量的計算及稱量方法將培養(yǎng)物用已知重量的濾紙過濾，將濾渣在105°C下烘干后稱重；濾前濾紙的重量公式是(秸桿分解前原始重量+濾紙重量)-(分解后秸桿+濾紙重量)。(2)菌種組成的檢測方法原理PCR擴(kuò)增各代復(fù)合菌群的16S rDNA,再進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，比較各代復(fù)合菌群的16S rDNA條帶，分析各代間菌種組成的變化，當(dāng)各代之間的PCR-DGGE條帶趨于穩(wěn)定時，證明復(fù)合菌群組成穩(wěn)定。I)用氯仿-苯酚抽提法提取各代復(fù)合菌群總DNA ；2)以總DNA為模板，用如下引物357F/517R進(jìn)行PCR擴(kuò)增357F GC,GC cIampb 5，-CCTACGGGAGGCAGCAG-3，(GC-clamp 序列為 5，-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3，)；517R : 5，-GTGCCAGC (A/C)GCCGCGG-3，。PCR反應(yīng)條件為首先，95 °C預(yù)變性lOmin，然后，93 °C變性lmin，48 °C退火lmin30sec，72°C延伸lmin，共30個循環(huán)，最后，72°C延伸lmin，4°C維持。3)將步驟2)得到的各代PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，比較各代PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的圖譜(即PCR-DGGE條帶)，當(dāng)各代之間的PCR-DGGE條帶趨于穩(wěn)定時，證明復(fù)
合菌群組成穩(wěn)定。結(jié)果表明，從第O代培養(yǎng)開始，培養(yǎng)至30代，秸桿分解率趨于穩(wěn)定且高，分解率為70%以上；培養(yǎng)至20代，復(fù)合菌群組成穩(wěn)定；培養(yǎng)至20代，得到組成穩(wěn)定、秸桿分解率高且穩(wěn)定的復(fù)合菌群。 ニ、篩選的復(fù)合菌群對木質(zhì)纖維素的降解I、復(fù)合菌群降解水稻秸桿將第30代的培養(yǎng)物與水稻稻桿和培養(yǎng)基混合(培養(yǎng)物、水稻稻桿和培養(yǎng)基的配比為5ml培養(yǎng)物lg水稻秸桿50ml培養(yǎng)基)，在室溫(34°C )、150rpm/min條件下震蕩培養(yǎng)條件下發(fā)酵6-15天。然后測秸桿中纖維素和半纖維素的含量。發(fā)酵所用培養(yǎng)基為改良的PCS培養(yǎng)基，其組成為蛋白胨5g，酵母提取物lg，NaC15g，K2HPO4Ig, MgSO4 · 7H20 O. 35g，CaC033g，溶解在 IL 水中。秸桿中纖維素和半纖維素的含量測定步驟(I)將分解前后的水稻秸桿樣品分別稱取Ig (相同樣品設(shè)置3個重復(fù))，裝在醋酸纖維濾通中，安裝在SOKURE玻璃萃取管內(nèi)，用こ醇ーこ醚(I I，體積比)混合液處理24小時，干燥后，得到殘留固體，接著用水環(huán)流2小時，干燥后稱得的重量為Ml。(2)將(I)得到的殘留物用O. 65mol/L HCl環(huán)流2小時，干燥后，稱得的重量為M2。(3)將(2)得到的殘留物用15M H2SO4浸泡2小時后，用O. 42M H2SO4環(huán)流5小時，干燥后稱得的重量為M3。(4)分解后秸桿重量稱量方法減重法。計算公式半纖維素的重量=M1-M2 ;纖維素的重量=M2-M3 ;半纖維素分解率=(分解前半纖維素重量-分解后半纖維素重量)/ (分解前秸桿 重量-分解后秸桿重量);纖維素分解率=(分解前纖維素重量-分解后纖維素重量)/ (分解前秸桿重量-分解后稻桿重量)。實(shí)施例2、用于制備秸桿發(fā)酵飼料的復(fù)合菌群的篩選一、復(fù)合菌群的篩選I、菌源
取東北水稻產(chǎn)區(qū)的的秸桿作為菌源。2、復(fù)合菌群的限制性培養(yǎng)和篩選實(shí)驗(yàn)組取O. 5g菌源秸桿接入裝有IOml限制性培養(yǎng)基的三角瓶中，厭氧培養(yǎng)于5°C冰箱中，培養(yǎng)IOd (記作第O代培養(yǎng))，得到培養(yǎng)物(將三角瓶中的所有物質(zhì)一起稱作培養(yǎng)物)；然后取15 μ I培養(yǎng)物接入新鮮的限制性培養(yǎng)基中，5°C、厭氧培養(yǎng)4d (記作第I代培養(yǎng));再將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入新鮮的限制性培養(yǎng)基，在與第I代培養(yǎng)相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，依此連續(xù)傳代培養(yǎng)數(shù)代。在上述傳代培養(yǎng)過程中，每代都檢測培養(yǎng)物的pH值，。在上述傳代培養(yǎng)過程中，每代都檢測乳酸的產(chǎn)率，檢測時間為從接種開始時計起培養(yǎng)48h。在上述傳代培養(yǎng)過程中，每代都檢測培養(yǎng)物中菌群的16S rDNA組成是否穩(wěn)定，從而檢測培養(yǎng)物中菌種組成是否穩(wěn)定，檢測時間為從接種開始計起第3天(接種當(dāng)天記作第I天)。當(dāng)乳酸產(chǎn)率高且傳代間穩(wěn)定、傳代間菌種組成穩(wěn)定、pH下降迅速(即12小時可將PH從6. 4降至3. 8)時，相應(yīng)代的培養(yǎng)物中即含有用于制備秸桿發(fā)酵飼料的菌群。所用的限制性培養(yǎng)基為，R-MRS培養(yǎng)基，其組成如表I所示。R-MRS的意思就是加了稻草做底物的MRS培養(yǎng)基。表I、MRS培養(yǎng)基的組成
權(quán)利要求
1.一種篩選功能菌群的方法，由如下步驟組成 1)選取含有功能菌群的基質(zhì)； 2)將所述基質(zhì)接種于限制性培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，再傳代培養(yǎng)； 3)建立評價所述功能菌群功能的指標(biāo)；在每代培養(yǎng)過程中檢測所述指標(biāo)和檢測所述功能菌群中菌種組成是否穩(wěn)定； 4)若在某代培養(yǎng)過程中，所述指標(biāo)符合對所述功能菌群的功能要求，且所述菌種組成穩(wěn)定，則所述某代培養(yǎng)過程中得到所述功能菌群； 所述限制性培養(yǎng)基為所述功能菌群在其中生長、且不屬于所述功能菌群的菌不能在其中生長的培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述培養(yǎng)的條件與所述功能菌群在所述基質(zhì)中生存的條件相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述功能菌群為分解木質(zhì)纖維素的菌群。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述基質(zhì)為秸桿柴垛腐爛的垛底、常年堆積的秸桿或常年堆積的樹葉。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述限制性培養(yǎng)基由終濃度為5g/L的蛋白胨、終濃度為lg/L的酵母提取物、終濃度為5g/L的NaCl、終濃度為lg/L的K2HPO4,終濃度為O. 35g/L的MgSO4 ·7Η20、終濃度為3g/L的CaCO3和終濃度為O. lg/L的秸桿組成；所述終濃度為各物質(zhì)在所述限制性培養(yǎng)基中的濃度。
6.根據(jù)權(quán)利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于所述評價所述功能菌群功能的指標(biāo)為秸桿分解率；所述指標(biāo)符合對所述功能菌群的功能要求為秸桿分解率在所述傳代培養(yǎng)的各代間穩(wěn)定。
7.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述功能菌群為用于制備秸桿發(fā)酵飼料的菌群。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述基質(zhì)為農(nóng)作物秸桿、農(nóng)作物賴以生長的土壤或農(nóng)作物秸桿與農(nóng)作物賴以生長的土壌的混合物；所述培養(yǎng)基為R-MRS培養(yǎng)基。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述評價所述功能菌群功能的指標(biāo)為乳酸產(chǎn)率和PH值下降速度；所述指標(biāo)符合對所述功能菌群的功能要求為所述乳酸產(chǎn)率在所述傳代培養(yǎng)的各代間穩(wěn)定，和所述PH值下降速度為12小時內(nèi)pH從6. 4降至3. 8。
10.根據(jù)權(quán)利要求3-9中任一所述的方法，其特征在于所述檢測所述功能菌群中菌種組成是否穩(wěn)定的方法為在所述傳代培養(yǎng)過程中，PCR擴(kuò)增每代培養(yǎng)中的所述功能菌群的16SrDNA基因，得到各代的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，比較各代的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的圖譜，若圖譜穩(wěn)定不變，則所述功能菌群中菌種組成穩(wěn)定。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種篩選功能菌群的方法。該方法由如下步驟組成1)選取含有功能菌群的基質(zhì)；2)將所述基質(zhì)接種于限制性培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，再傳代培養(yǎng)；3)建立評價所述功能菌群功能的指標(biāo)；在每代培養(yǎng)過程中檢測所述指標(biāo)和檢測所述功能菌群中菌種組成是否穩(wěn)定；4)若在某代培養(yǎng)過程中，所述指標(biāo)符合對所述功能菌群的功能要求，且所述菌種組成穩(wěn)定，則所述某代培養(yǎng)過程中得到所述功能菌群。本發(fā)明方法得到的功能菌群能夠繼續(xù)保持各種菌間的協(xié)同作用，組成穩(wěn)定，功能強(qiáng)大，不會因?yàn)閺淖匀唤绲姆蛛x而削弱作用力；另外，本發(fā)明方法操作簡單、成本低廉，省時省力。因此，本發(fā)明方法在功能菌的篩選領(lǐng)域?qū)袕V闊的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/68GK102703321SQ20121017748
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者崔宗均, 王小芬 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)