專利名稱：旱稻孢囊線蟲特異性rapd和scar標(biāo)記快速分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記全序列、特異性SCAR標(biāo)記引物序列及旱稻孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速分子檢測方法。
背景技術(shù)：
旱稻抱囊線蟲(Heteroderaelachista Ohshima, 1974),最早發(fā)現(xiàn)于日本的櫪木縣山地稻田中(Ohshima, 1974)，廣泛分布于日本的東北地區(qū)和九州地區(qū)，主要侵染水稻，目前在伊朗和中國也有分布。該病害引起的產(chǎn)量損失范圍在 7%-19%(Bridgeet ,Nematode parasites ofrice, Plant parasitic nematodes m tropical andsubtropical agriculture. Wallingford, UKj CABI Publishing, 1990，69-108)。ニ齡幼蟲在五月中旬侵染旱稻根部，卵在五周后開始沉積，孢囊在6-8周后開始形成(ShimizuK. seasonal iluctuation and rhizospherical distribution of population oi theupland rice cyst nematode, Heterodera elachista. Japanese Journal of Nematology1977，7:49-57)。丁中(賀沛成，洪宏，伍敏敏，丁中·旱稻孢囊線蟲(Heteroderaelachista)孵化特性研究.植物保護(hù)，2011，37 (6) : 101-103)研究發(fā)現(xiàn)，旱稻孢囊線蟲適宜的孵化溫度是28-32°C，與玉米孢囊線蟲類似，最佳孵化溫度均為30°C左右(Hashmib, Krusoerg LR. Factors miluencmg emergence of juveniles from cysts oiHeterodera zera. Journal of Nematology. 1995, 27 (3) : 362-369)。在我國，目前旱稻抱囊線蟲僅在湖南湖北部分地區(qū)有報(bào)道。旱稻孢囊線蟲屬于Cyperi群組，在形態(tài)上與H. oryzae, H. sacchari和
H.Ieuceilyma非常相近。其與H. sacchari和H. Ieuceilyma最明顯的區(qū)別是在孢囊細(xì)長的下橋上缺乏指形的投影，而與H. oryzae相比，孢囊略小，ニ齡幼蟲長度略短。目前旱稻孢囊線蟲的鑒定大部分仍然依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，但是由于形態(tài)學(xué)鑒定耗時(shí)、需要很熟練的技術(shù)作為基礎(chǔ)，并且需要專門從事分類的人員來完成，這些原因使傳統(tǒng)的鑒定方法時(shí)常存在一定誤差并且不適用于大規(guī)模的樣品檢測。為了彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定的不足，快速、準(zhǔn)確的對農(nóng)作物孢囊線蟲進(jìn)行鑒定和檢測，分子檢測技術(shù)迅速發(fā)展。20世紀(jì)80年代后期發(fā)展成功的DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，使得直接擴(kuò)增DNA成為可能，在此基礎(chǔ)上還產(chǎn)生了各種新的分子標(biāo)記技術(shù)，這些分子標(biāo)記和檢測技術(shù)都成功的應(yīng)用到植物寄生線蟲特別是農(nóng)作物孢囊線蟲的分類鑒定和檢測過程中。特異性引物PCR或多重PCR技術(shù)是近年來線蟲分子診斷取得的重要進(jìn)展。通過一次PCR測驗(yàn)就可以在混合樣品中特異性地檢測出ー個(gè)或多個(gè)線蟲種。例如Subbotin SA, Peng D L 等(Subboton S A, Peng D L, Moens M. A rapid method for theidentmcation of the soybean cyst nematoae Heterodera glycines using duplexPCR. Nematology 2001, vol. 3 (4) :365-371)運(yùn)用雙重PCR檢測大豆孢囊線蟲的方法，在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)運(yùn)用通用引物D3A和D3B以及特異性引物GlyFl和rDNA2，從52個(gè)大豆孢囊線蟲群體中均擴(kuò)增出兩個(gè)DNA片斷(181bp and345bp),檢測的敏感度高達(dá)單個(gè)孢囊、單頭ニ齡幼蟲的微量DNA。此外，PCR技術(shù)對其他植物寄生線蟲種類的檢測也有較多進(jìn)展。近年來，基于PCR技術(shù)的各種分子標(biāo)記迅速發(fā)展起來，各種分子標(biāo)記檢測技術(shù)特異性更高，檢測更準(zhǔn)確，在植物寄生線蟲的分子檢測中應(yīng)用也越來越廣泛。1990年，Williams 等和 Welsh 等(Welsh Jj MeClelland M. Fingerprinting genomes using PCRwith arbitrary primers. Nuc IicAcids Research·，1990，18:7213-7218)兩個(gè)研究小組幾乎同時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記一RAPD標(biāo)記(Random Amplified Polymorphism DNA)。RAPD引物為隨機(jī)的寡聚核苷酸，長度多為10個(gè)核苷酸左右，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增基因組DNA，從而產(chǎn)生不連續(xù)的DNA產(chǎn)物，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳也可以獲得不同的圖譜。由于不同基因組DNA序列堿基位點(diǎn)具有明顯的差異，在不同區(qū)段上可與引物發(fā)生結(jié)合的位點(diǎn)也不盡相同，因此擴(kuò)增條帶的大小數(shù)量等特征也不同，從而使不同的種表現(xiàn)出多態(tài)性。RAH)優(yōu)點(diǎn)是所需DNA量極少，要求設(shè)備也相對簡單，但是由于RAPD引物非常短，只有十個(gè)堿基，退火溫度也較低，如果PCR體系變化，或者儀器變化，重復(fù)性會(huì)變差，而且易產(chǎn)生非特異性的條帶。為了彌補(bǔ)這ー不足，可以將其轉(zhuǎn)為SCAR (sequence characterized amplifiedregion)標(biāo)記。RAPD轉(zhuǎn)化的SCAR標(biāo)記技術(shù)由Paran和Michelmore于1993年提出并應(yīng)用(Paran I，Michelmore R W. Development ofreliabie PCR-based markers linkedto downy mildew risistence genes in lettuce, meoretical and Applied genetics1993,85:985-993.)。Edward P. Caswe 11 -Chen 等(Edward P，Caswell-Chenj ValerieMj Williamson, FrancesF. Wu. Random amplified polymorphic DNA analysis ofHeterodera cruciferae and H. schachtiI populations. Journal of Nematology1992，24(3) :343-351)運(yùn)用 RAH)標(biāo)記區(qū)分了 H. cruciferae 和 H. schachtii，用 10 個(gè)不同的隨機(jī)引物擴(kuò)增燕麥孢囊線蟲的不同種群的DNA，產(chǎn)生了 78條清晰的譜帶。1995年Lopez-Braiia I 等對禾谷孢囊線蟲群體做了 RAPD 分析。Jianbo Li (Jianbo Li，JamalFaghhihij John M. Ferris, et al. The use of RAPD amplified DNA as markers forvirulence characteristics in soybean syst menatode. Fundamental And AppliedNematology 1996，19(2) : 143-150)等用RAPD標(biāo)記技術(shù)研究了大豆抗性品種與大豆孢囊線蟲的致病型之間的關(guān)系。Blok V. C. (Blok V Cj Philips, Harrower BE. Comparison ofBritish populations of potato cyst nematodes with populations irom continentalEurope and south America using RAPDs. Genome 1997，40:286-293)等通過 RAPD 技術(shù)研究馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲兩個(gè)群體的線蟲致病型之間的遺傳關(guān)系。在RAPD標(biāo)記與SCAR標(biāo)記的聯(lián)合應(yīng)用方面，Meng Qing-peng等(MengQmgpengj Long H, Xu J H. PCR assays ior rapid and sensitive identificationof three major root-knot nematodes,Meloidogyne incognita,M. javanica andM. arenaria. Acta Phytopathologica Sinica2004，34 (3) : 204-210)成功地將南方根結(jié)線蟲和爪哇根結(jié)線蟲特異的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA片段轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。Adam M. A. M.等(Adam M A M，Phillips M S，Blok V C. Molecular diagnostic key for identificationof single juveniles of seven common and economically important species ofroot-knot nematode(Meloidogyne spp·)·Plant Pathology 2007，56:190-197)運(yùn)用SCAR標(biāo)記技術(shù)區(qū)分了根結(jié)線蟲屬的七種線蟲。在馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲的快速分子診斷中，F(xiàn)ullanodo, A. et. Al (Fullaondo A, Barrena E, Viribay M, Barrena丄，balazar A, Ritter Ε·丄dentification of potato cyst nematode species Gioooderarostocniensis and G. pallida by PCR using specific primer combinations.Nematology 1999，1:157-163)用隨機(jī)引物0PG5分別擴(kuò)增出區(qū)分馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲特異性RAPD標(biāo)記片段，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記后，分別擴(kuò)增出了315bp 和 798bp 的特異性片段。Ou, S. Q.，Peng D. L. (Ou S Q, Peng D L, Li Y, MoensM. Identification of Heterodera glycines using PCR with sequence characterisedamplifiedregion (SCAR) primers. Nematology 2008, 10(3) : 397-403)米用 RAPD 技術(shù)，獲得了基于大豆孢囊線蟲基因組DNA的特異性SCAR標(biāo)記，構(gòu)建的特異性SCAR標(biāo)記引物擴(kuò)增出500bp大豆孢囊線蟲的特異性SCAR片段，選用核糖體引物D2A和D3B作為內(nèi)標(biāo)與上述特異性引物SCNFl和SCNRl相結(jié)合，發(fā)明了一步雙重PCR方法檢測大豆孢囊線蟲，在PCR擴(kuò)增條件下，大豆孢囊線蟲群體都獲得了 500bp的特異性SCAR標(biāo)記片段和SOObp片段。國內(nèi)外雖然有關(guān)于旱稻孢囊線蟲核糖體DNA的ITS區(qū)域的研究報(bào)道，但國內(nèi)外尚未見基于基因組DNA的旱稻孢囊線蟲RAPD和SCAR標(biāo)記特異性分子檢測旱稻孢囊線蟲的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述技術(shù)領(lǐng)域的空白，本發(fā)明提供旱稻孢囊線蟲特異性RAro標(biāo)記的全長序列，同時(shí)將RAro標(biāo)記轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，提供了特異性SCAR標(biāo)記的特異性引物。本發(fā)明還提供旱稻孢囊線蟲特異性SACR快速分子檢測方法，為制定線蟲的快速分子檢測、旱稻孢囊線蟲病的早期診斷和制定線蟲病害綜合治理對策服務(wù)。旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。根據(jù)旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段的保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物。特異性引物為HeFl和HeRl，其序列為HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3，，HeRl : 5 ’ -GAGGGTGTTGAACAATTAAAAAA-3，。旱稻孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速分子檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系中含有上述特異性引物。所述PCR反應(yīng)體系中含有特異性引物HeFl和HeRl。所述PCR反應(yīng)體系為反應(yīng)體系總體積為25μ1，其中含有2. 5μ I IOXPCRBuffer (含 Mg++);2. Ομ I dNTP ；1. Ομ I HeFl (0· I μ g/μ I); I. 0 μ I HeRl (O. I μ g/μ I)；O. 25 μ ITaq DNA 聚合酶(5U/μ I) ；1. Ομ I 模板 DNA ;ddH20 補(bǔ)足 25 μ I。其中PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4°C 預(yù)變性 5min，然后 94°C 30S, 54°C 30S, 72°C Imin 循環(huán)35次，72°C延伸lOmin，保存在4°C條件下。本發(fā)明利用RAPD技木，獲得了基于旱稻孢囊線蟲基因組DNA的特異性RAPD標(biāo)記，經(jīng)克隆測序后，設(shè)計(jì)SCAR標(biāo)記引物，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)換成SCAR標(biāo)記，利用該SCAR標(biāo)記的特 異性引物，可檢測出目標(biāo)線蟲。本發(fā)明構(gòu)建了特異性SCAR標(biāo)記的特異性引物HeFl和HeRl(即SEQ ID N02和SEQID N03)。利用旱稻孢囊線蟲特異性引物HeFl和HeRl，在PCR擴(kuò)增條件下，所有旱稻孢囊線蟲群體都獲得了 434bp的特異性SCAR標(biāo)記片段，而其它線蟲類則沒有434bp的特異性SCAR標(biāo)記片段。本發(fā)明構(gòu)建的特異性引物HeFl和HeRl，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確，靈敏。本發(fā)明應(yīng)用特異性SCAR標(biāo)記PCR檢測技術(shù)檢測目標(biāo)線蟲，與重復(fù)性較差的RAPD技術(shù)(RAPD-PCR),核糖體DNA限制性內(nèi)切酶技術(shù)(RFLP-PCR)檢測方法相比，更能夠省時(shí)、準(zhǔn)確、靈敏，更能建立快速、準(zhǔn)確的旱稻孢囊線蟲檢測技木。該技術(shù)可應(yīng)用于對旱稻孢囊線蟲田間土壤樣品及旱稻孢囊線蟲病發(fā)生的早期快速分子檢測，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。


圖I :用12個(gè)Operon系列的含10個(gè)堿基的隨機(jī)引物對旱稻孢囊線蟲HeOl進(jìn)行 擴(kuò)增。M 為標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子標(biāo)記(DNAmarker DL 2，000) ;1_12 為隨機(jī)引物 OPAtl2, OPA03, OPA
06,OPA09, OPA13, OPB15, OPC06, OPD13, OPG06, OPG08, OPG10, OPK16; 13 為陰性對照。(代碼見表 I 和表2)圖2 :用隨機(jī)引物OPB15擴(kuò)增旱稻孢囊線蟲、禾谷孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、大豆孢囊線蟲、大麥孢囊線蟲、馬鈴薯腐爛莖線蟲等的RAPD的特異性DNA片段結(jié)果，M 為標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子標(biāo)記(DNAmarker DL 2，000)；l-5:He01, He02, He03, He04, He05;6-16:HfOl, Hf06, HaOI, Ha06, HalO, HgOI, Hg03, HgoOI, Hgo05, RsOl, DdOl; 17 :陰性對照。(代碼見表I)圖3 :用旱稻孢囊線蟲特異性SCAR標(biāo)記引物(HeFl和HeRl)擴(kuò)增5種孢囊線蟲和2種非孢囊線蟲的結(jié)果，M 為標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子標(biāo)記(DNA marker DL 2，000);l_5:He01，He02, He03, He04, He05;6-15:Ha01, Ha06, HalO, HfOI, Hf06, HgOI, Hg03, HgoOI, RsOl, DdOl; 16 :陰性對照。(代碼見表I)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步的詳細(xì)說明。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)選用的材料供試線蟲包括19個(gè)禾谷孢囊線蟲群體，11個(gè)菲利普孢囊線蟲群體，3個(gè)大豆孢囊線蟲群體，12個(gè)豌豆孢囊線蟲群體，5個(gè)旱稻孢囊線蟲群體，I個(gè)大麥孢囊線蟲群體，I個(gè)松材線蟲群體，I個(gè)馬鈴薯腐爛莖線蟲群體，I個(gè)香蕉穿孔線蟲群體，共計(jì)54個(gè)線蟲群體。其中17個(gè)小麥禾谷孢囊線蟲群體為本實(shí)驗(yàn)室長期從山東省、青海省、河南省、甘肅省、北京等地收集保存且繁殖在小麥上的孢囊線蟲種群，9個(gè)菲利普孢囊線蟲群體為本實(shí)驗(yàn)室從河南等省市收集保存，2個(gè)小麥禾谷孢囊線蟲國外群體，2個(gè)菲利普孢囊線蟲國外群體以及其他線蟲群體為本實(shí)驗(yàn)室工作人員收集。如表I所示。下述供試線蟲樣品可以對外公開發(fā)放。表I供試線蟲樣品代碼及群體來源
權(quán)利要求
1.旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段的保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性引物為HeFl和HeRl，其序列為HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3’，HeRl :5’ -GAGGGTGTTGAACAATTAAAAAA-3>
4.旱稻孢囊線蟲SCAR標(biāo)記快速分子檢測方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系中含有權(quán)利要求I或2所述的特異性引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，所述PCR反應(yīng)體系中含有特異性引物HeFl和HeRl,其序列為HeFl :5’ -AATCGTTTTCAGTTGAGACCCAT-3’，HeRl :5’ -GAGGGTGTTGAACAATTAAAAAA-3>
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測方法，所述PCR反應(yīng)體系總體積為25μ 1，其中2. 5μ I10 X PCR 含 Mg2+的 Buffer ；2. 0μ I dNTP ；1. 0μ I 濃度為 0. I μ g/ μ I 的 HeFl, ;1. O μ I 濃度為 O. I μ g/ μ I 的 HeRl ；0. 25 μ I 濃度為 5U/ μ I 的 Taq DNA 聚合酶；I. O μ I 模板 DNA ；ddH20補(bǔ)足25 μ I。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測方法，其中PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后940C 30S，54°C 30S，72°C Imin 循環(huán) 35 次，72°C延伸 lOmin，保存在 4°C條件下。
全文摘要
本發(fā)明涉及旱稻孢囊線蟲特異性RAPD和SCAR標(biāo)記快速分子檢測方法，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。旱稻孢囊線蟲特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段，具其如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。根據(jù)旱稻孢囊線蟲特異性RAPD擴(kuò)增片段，設(shè)計(jì)特異性引物HeF1和HeR1，將其轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記片段，在SCAR標(biāo)記快速分子檢測旱稻孢囊線蟲的方法中，可擴(kuò)增出434bp的特異性片段。本發(fā)明提高了分子檢測靈敏度并且快速準(zhǔn)確，在旱稻孢囊線蟲檢測以及旱稻孢囊線蟲病的早期診斷方面，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號C12Q1/68GK102690824SQ201210200140
公開日2012年9月26日 申請日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者丁中, 亓?xí)岳? 彭德良, 彭煥, 賀文婷, 黃文坤 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所