專利名稱：一種禾谷孢囊線蟲lamp快速檢測方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種禾谷孢囊線蟲LAMP快速檢測方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
禾谷抱囊線蟲(Heteroderaavenae Wollenweber, I 924),即 Cereal cystnematode (簡稱CCN，又名燕麥孢囊線蟲)，是全世界范圍內(nèi)分布的禾谷類作物重要病原線蟲。該線蟲自1874年在德國被發(fā)現(xiàn)以來，目前在全世界40多個(gè)國家均有發(fā)生和危害，其中中國、澳大利亞、歐洲、印度、中東等地區(qū)的禾谷孢囊線蟲病危害嚴(yán)重并遭受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。例如在澳大利亞禾谷孢囊線蟲的危害面積達(dá)到了 200萬公頃，一般產(chǎn)量損失23-50%，嚴(yán)重時(shí)損失73-89%，年經(jīng)濟(jì)損失約7200萬澳元(Brennan J P, Murray GM.Aust ralian w heat disease assessing their economic import ance[J]. Agric.S c1.，1988，52(2) :176 一 183)。在歐洲主要的禾谷作物種植區(qū)，大約有50%以上的地塊受到禾谷孢囊線蟲的侵染，每年由禾谷孢囊線蟲造成的經(jīng)濟(jì)損失約300萬歐元(AlexanderH M, Julie M N,Nematode parasites of cereals. Plant parasitic nematodes insubtropical and tropical agriculture[M]. Second edition. CAB international2005:1 3 1-1 9 I);在印度，禾谷孢囊線蟲引起小麥和大麥的“Molya”病害，小麥產(chǎn)量損失達(dá) 47. 2 %、大麥損失高達(dá) 87. 2 % (RivoalR. , Cook, R. , Nematode pests of cereals.1n:Plant Parasitic Nematodes in Temperate Agriculture. [B].Evaan K. et al. , Eds.Walling ford Press, UK, 1993，259-303)。在我國，禾谷孢囊線蟲自1989年在湖北天門縣矮黃麥株上首次發(fā)現(xiàn)以來[陳品三，王明祖，彭德良·我國小麥禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae wollenweber)鑒定研究[J]·植物病理學(xué)報(bào)，1992，22(4) : 339-343]，目前在我國小麥主產(chǎn)區(qū)的河北、河南、北京、山西、內(nèi)蒙古、青海、湖北、安徽等16省、市和自治區(qū)均有發(fā)生和分布，危害面積達(dá)400萬hm2以上，且有逐漸蔓延之勢 ，目前已成為危害我國麥類作物的重要病原線蟲(彭德良等，我國小麥孢囊線蟲的新發(fā)生分布地區(qū).中國線蟲學(xué)研究第二卷，2008，2:344-345;黃文坤，葉文興，王高峰，龍海波，歐師琪，彭德良，寧夏地區(qū)禾谷孢囊線蟲的發(fā)生與分布.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011, 30(1) :74-77)。據(jù)調(diào)查，一般病田可減產(chǎn)20%_40%，嚴(yán)重地塊減產(chǎn)達(dá)70%以上[彭德良，張東升，齊淑華，陳品三等，我國小麥孢囊線蟲(Heterodera avenae)發(fā)生分布區(qū)域和防治初步研究.植物保護(hù)研究進(jìn)展，1995，p53-56.中國科學(xué)技術(shù)出版社]。禾谷孢囊線蟲可寄生禾本科植物的27屬34種，對小麥、大麥、燕麥、黑麥等禾谷類作物危害嚴(yán)重[劉維志.病原植物線蟲學(xué)[M].北京中國農(nóng)業(yè)出版社，1998. 294-303.]。目前小麥禾谷孢囊線蟲病已經(jīng)對我國的麥類作生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，嚴(yán)重制約著麥類作物生產(chǎn)的發(fā)展，對該線蟲做出快速準(zhǔn)確的鑒定是當(dāng)前麥類作物生產(chǎn)急需解決的問題。傳統(tǒng)的孢囊線蟲檢測方法為形態(tài)學(xué)檢測。禾谷類孢囊線蟲組(Heteroderaavenae group)包括12個(gè)孢囊線蟲種，其中禾谷孢囊線蟲(H. avenae)和菲利普孢囊線蟲(H. filipjevi)形態(tài)特征差異較小，主要差異為菲利普孢囊線蟲具有明顯的下橋(underbrige)結(jié)構(gòu)。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定,耗時(shí)較多且需要很豐富的專業(yè)知識(shí),很難滿足目前的高通量快速檢測的要求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR等快速檢測技術(shù)已經(jīng)廣發(fā)運(yùn)用到植物線蟲的快速檢測中。目前運(yùn)用到孢囊線蟲的檢測技術(shù)主要包括ITS-RFLP，PCR，real time PCR等。zheng等(2000)用Hinf I酶切歐洲H. avenae (A型)和印度群體(B型)后的結(jié)果與中國禾谷孢囊線蟲均不相同，稱其為“C型” (Zheng, J.，Subbotin S. A.，WaeyenbergeL.，Moens Μ. , Molecular characterization of Chinese Heterodera glycines andH.avenae populations based on RFLPs and sequences of rDNA—ITS regions. RussianJournal ofNematology2000，8:109-113.)。彭德良等(2003)擴(kuò)增了中國小麥禾谷孢囊線蟲群體的核糖體基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，用AluI和RsaI酶切ITS擴(kuò)增產(chǎn)物證明中國禾谷孢囊線蟲ITS屬于“B型”，HinfI酶切揭示出中國與摩洛哥禾谷孢囊線蟲ITS之間存在明顯差異(彭德良，Subbotin S. Α·，M. Moens.小麥禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)的核糖體基因(rDNA)限制性片段長度多態(tài)性研究.植物病理學(xué)報(bào)，2003，33 (4): 323-329)。Guiping Yan 和 Richard W. Smiley (2011)運(yùn)用 rDNA-1TS 區(qū)域 RFLP 結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定的方法對美國部分地區(qū)的禾谷孢囊線蟲進(jìn)行了檢測，該方法釆用6種限制性內(nèi)切酶能夠區(qū)分禾谷抱囊線蟲和菲利普抱囊線蟲(Yan，G. P.，SmileyR. W.，Distinguishing Heteroderafilipjevi and H. avenae Using Polymerase Chain Reaction-Restriction FragmentLength Polymorphism and Cyst Morphology. Nematology2010, 3:216-224. )。Fu 等對我國黃淮海麥區(qū)的禾谷孢囊線蟲進(jìn)行了 ITS和RFLP分析(Fu Boj Ian T. RileyiLi Honglianj etal. Molecular characterisation of cereal cyst nematodes in winter wheat on theHuang-Huai floodplain of China using RFLP and rDNA-1TS sequence analyses.Australasian Plant Pathol2011，40:277285)。在孢囊線蟲模式線蟲甜菜孢囊線蟲的檢測中，Amiri等通過對H. betae、H. cicer1、H. gly cines 和 H. medicaginis、H. schachti1、H. trifolii 的 ITS 序列進(jìn)行分析，篩選出特異性引物SHF6，將此引物與AB28 (或ri)NA2)引物結(jié)合，構(gòu)建了甜菜孢囊線蟲一步雙重 PCR 的檢測方法(Amiri S.，Subbotin S. A.，Moens Μ·，An efficient meth od foridentification of the Heterodera schachtii sensu stricto group using PCR withspecific primers. Nemato1. medit. 2001，29:241-246)。Subbotin S A, Peng D Lj Moens M_ (2001)運(yùn)用雙重PCR檢測大豆孢囊線蟲的方法，在一個(gè)PCR反應(yīng)體系中同時(shí)運(yùn)用通用引物D3A和D3B以及特異性引物GlyFl和ri)NA2，從52個(gè)大豆孢囊線蟲群體中均擴(kuò)增出兩個(gè)DNA片斷(181bp and345bp)，檢測的敏感度高達(dá)單個(gè)抱囊、單頭二齡幼蟲的微量 DNA(Subboton S. A.，Peng D L，Moens Μ·，A rapid methodforthe identification of the soybean cyst nematode Heterodera glycines usingduplex PCR. Nematology 2001，vol. 3 (4) : 365-371 )。0u，S. Q.和 Peng D. L 釆用 RAPD 技術(shù)，獲得了基于大豆孢囊線蟲基因組DNA的特異性SCAR標(biāo)記，同時(shí)和D2A和D3B相結(jié)合，發(fā)明了一步雙重PCR方法檢測大豆孢囊線蟲。在PCR擴(kuò)增條件下，大豆孢囊線蟲群體都獲得了 500bp 的特異性 SCAR 標(biāo)記片段和 800bp 片段(0u S. Q.，Peng D. L，Li Y.，MoensM.，Identification of Heterodera glycines using PCR with sequence characterisedamplified region (SCAR)primers. Nematology2008, 10(3):397-403)。
亓?xí)岳虻炔捎肦APD的方法，研究出禾谷孢囊線蟲特異性SCAR分子標(biāo)記，該方法能夠特異的將禾谷孢囊線蟲與菲利普孢囊線蟲、大麥孢囊線蟲、旱稻孢囊線蟲和豌豆孢囊線蟲區(qū)分開，檢測靈敏度高達(dá)1/80條2齡幼蟲(亓?xí)岳颍淼铝?，彭煥，龍海波，黃文坤，賀文婦.基于SCAR標(biāo)記的小麥禾谷孢囊線蟲(Heterodera avenae)快速分子檢測技術(shù).中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012,45(21) :4388-4395)。同時(shí)，Ophel-Keller等開發(fā)出蟲土壤中直接檢測禾谷孢囊線蟲的real time PCR檢測技術(shù),靈敏度達(dá)I個(gè)卵/lg(Ophel_Keller Kathy,McKayAlan, Hartley Di，Herdina and Curran, John. Development of a routine DNA—basedtesting servicefor soilborne diseases in Australia. Australian Plant Pathology,2008，37 :243-253)。以PCR為基礎(chǔ)的分子鑒定方法一定程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定上的缺陷。但PCR檢測需要PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)(紫外儀)等昂貴的專業(yè)儀器和分子生物學(xué)試劑，且需要分子生物學(xué)專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員操作，以上檢測只能在實(shí)驗(yàn)室條件下才可以檢測，需要較長的時(shí)間，限制了 PCR檢測方法在生產(chǎn)中的推廣應(yīng)用，在禾谷孢囊線蟲發(fā)生分布調(diào)查中，迫切需要一種簡便快捷的檢測手段。循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediatedisothermal amplification of DNA, LAMP)是2000年日本榮研株式會(huì)社Notomi等人開發(fā)的一種新型循環(huán)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)。(NotomiT,Okayama H,Masubuchi H,Yonekawa T, Watanabe K, Amino N and Hase T.Loop-mediatedisothermal amplification ofDNA [J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28 (12) : e63.),該技術(shù)通過識(shí)別靶序列上6個(gè)特異區(qū)域的引物和利用具有鏈置換功能的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下能特異、高敏、快速地?cái)U(kuò)增靶序列。該技術(shù)技術(shù)有如下特點(diǎn)1)特異性強(qiáng)、靈敏度高。LAMP反應(yīng)正針對靶基因序列的6-8個(gè)特異性位點(diǎn)設(shè)計(jì)出4-6條引物，相比普通其他分子檢測方法具有更強(qiáng)的特異性。2)擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間短、設(shè)備要求簡單。LAMP反應(yīng)具有極高的擴(kuò)增效率，30-90分鐘內(nèi)可將靶基因擴(kuò)增IO9-1Oltl,同時(shí)擴(kuò)增過程無需專業(yè)的PCR儀等設(shè)備，簡單的水浴即可完成反應(yīng)。3)檢測結(jié)果可以肉眼直接觀察，簡便快捷。由于該檢測方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，快速簡便等特點(diǎn)，目前已廣泛引用于人畜病原物、食品安全和環(huán)境衛(wèi)生的檢測中。但在植物病原線蟲檢測中的運(yùn)用剛剛起步，2008年日本科學(xué)家首次利用LAMP技術(shù)建立了從病木中直接檢測松材線蟲LAMP檢測的方法(Kikuchi T, AikawaT,OedaY, Karim N, Kanzaki N. A Rapid and Precise Diagnostic Methodfor Detectingthe Pinewood Nematode Bursaphelenchus xylophilus by Loop-Mediated IsothermalAmplification. Nematology, 2009，12:1365-1369)。2011 年 Niu et al 等建立了南方根結(jié)線蟲LAMP檢測技術(shù)，能夠從土壤和根結(jié)中檢測出南方根結(jié)線蟲(Niu J H, Guo Q X，JianH,Chen C L, Yang D,Liu Q, Guo Y D. Rapid detection of Meloidogyne spp.by LAMPassay in soil and roots. Crop Protection, 2011，8:1063-1069)和象耳豆根結(jié)線蟲(NiuJ H, Jian H, Guo Q X, Chen C L, Wang X Y,Liu Q, Guo Y D. Evaluation of loop-mediatedisothermal amplification(LAMP)assays based on5S rDNA_IGS2regionsfor detectingMeloidogyne enterolobi1. Plant Pathology, 2011，02562. x)。2012 年彭德良首次以象耳豆根結(jié)線蟲ITS為靶標(biāo)，建立了象耳豆根結(jié)線蟲LAMP快速檢測技術(shù)，檢測靈敏度達(dá)到1/200000 條幼蟲(專利號(hào)201110034960)。2012 年彭煥等(Peng H, Peng D L, Hu X Q, He XF，Wang Q, Huang W K, He W T. Loop-mediated isothermal amplification for rapid andprecise detection of the burrowing nematode, Radopholus similis, directly fromdiseased plant tissues. Nematology, 2012, 14 (8) :977-986.)研究出從摧病植物組織中用LAMP快速和特異性檢測香蕉穿孔線蟲的方法，檢測極限達(dá)1/20000條幼蟲，靈敏度比常規(guī)PCR檢測高100倍。除此之外，LAMP檢測技術(shù)在禾谷孢囊線蟲上尚無相關(guān)報(bào)道，本發(fā)明首次建立了禾谷孢囊線蟲LAMP快速檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)檢測禾谷孢囊線蟲的LAMP快速檢測方法，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件下檢測工作的使用，也適合在實(shí)驗(yàn)條件不足的室外檢測。一種禾谷孢囊線蟲LAMP快速檢測方法，其特征在于其中LAMP反應(yīng)體系所使用的引物是①HA5-F3 :5' -TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5' -GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP 5' -TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGCTTCATTTGAGAACAATG-3' ;④HA5-FIP :5' -ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCATGGCAAAGA-3' ;⑤HA5-LB :5' -CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG-3' ;其中的LAMP反應(yīng)體系包括 I)引物混合液外引物HA5-F3和HA5-B3各O. 2 μ mol/L,內(nèi)引物HA5-FIP和HA5-BIP 各1. 4 μ mol/L,環(huán)引物 HA5-LB 為 O. 4 μ mol/L ;2)反應(yīng)混合液3.2mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8), 10mmol/LKCl, 3mmol/LMgS04, lOmmol/L (NH4)2S04, 0. l%Triton x-100，8U Bst DNA 聚合酶大片段;3) I μ IDNA 模板；加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ I。其中LAMP反應(yīng)條件如下將引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加入I μ IDNA模板，61 65°C保溫 30 90min，85°C保溫 lOmin。LAMP反應(yīng)的最終產(chǎn)物中加入顯色劑，輕甩離心管后觀察。所述顯色劑為SYBRgreen I與PCR級DMSO的混合物，其體積比為1:9。所述DNA模板的提取方法為挑取單個(gè)禾谷孢囊放入裝有10 μ IddH2O的0. 2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉(zhuǎn)動(dòng)至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8 μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然后在_80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應(yīng)IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于 LAMP 和 PCR 反應(yīng)，所述 LB 溶液為 500mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2,1. 0mmol/L DTT, 4. 5%Tween20,等體積混勻，過濾滅菌。上述任一檢測方法在診斷植物、土壤的禾谷孢囊線蟲感染情況或鑒別禾谷孢囊線蟲中的應(yīng)用。本發(fā)明利用循環(huán)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermalamp Ii feat ion, LAMP)建立針對禾谷孢囊線蟲的檢測方法。本方法具有多條引物的擴(kuò)增，并在兩端形成了帶有引物功能的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，這種多引物結(jié)合和可自產(chǎn)生引物的原理使其具有了靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，由于LAMP反應(yīng)操作步驟簡單及反應(yīng)產(chǎn)物中包含大量核酸和焦磷酸鎂的沉淀，熒光劑顯色后可以用肉眼觀察判定反應(yīng)結(jié)果，適用于各種實(shí)驗(yàn)條件下檢測工作的使用，也適合在實(shí)驗(yàn)條件不足的室外檢測。本發(fā)明的方案具體實(shí)施步驟如下1.線蟲DNA提取試劑配制I) LB (Lysis Buffer)溶液500mmol/L KCI, 10mmo I /I, Tris-HCl, 1 Smmol /I,MgCl2,1. Ommol/L DTT, 4. 5%Tween20,等體積混勻，過濾滅菌。2)蛋白酶 K :600 μ g/ml 蛋白酶 K。2. DNA 的提取挑取單個(gè)禾谷孢囊放入裝有10 μ I ddH20的O. 2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉(zhuǎn)動(dòng)至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然后在_80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應(yīng)IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)。3.禾谷孢囊線蟲RAPD擴(kuò)增及序列分析應(yīng)用SCAR 標(biāo)記弓丨物 0PD13-HaFl(5'-TGACGAGAACATATGATGGGGATGAT-3')和0PD13-HaRl (5'-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT—3')擴(kuò)增禾谷孢囊線蟲 SCAR 片段。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為50μ 1，PCR反應(yīng)體系為10 X Buffer (含Mg2+) 5 μ I, IOmM dNTP4 μ 1，引物0PD13-HaFl 和 0PD13_HaRl (10 μ mol/L)各 I μ 1，Taq 酶(5U/μ 1，Takara) 0. 5μ I,模板DNA5y 1，滅菌(1(1!120補(bǔ)足至5(^ I。PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min，59°C退火30sec，72°C延伸1. 5min ;35個(gè)循環(huán)；72°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴(kuò)增后，取5 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物加I μ I加樣緩沖液在1. 5%瓊脂糖 凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測并照相回收、克隆和測序，序列測定由北京六合華大基因科技有限公司完成。4.禾谷孢囊線蟲LAMP引物設(shè)計(jì)根據(jù)禾谷孢囊線蟲RAPD測序結(jié)果為模板，設(shè)計(jì)以下5條引物，序列如下①HA5-F3 :5'-TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5' -GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP 5'-TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGC TTCATTTGAGAACAATG-3' ;④HA5-FIP :5'-ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCA TGGCAAAGA-3' ;⑤HA5-LB 5' -CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG-3' ;5. LAMP反應(yīng)體系配置外引物HA5-F3和HA5-B3各O. 2 μ mol/L,內(nèi)引物HA5-FIP和 HA5-BIP 各1. 4 μ mol/L,環(huán)引物 HA5-LB 為 0. 4 μ mol/L, 3. 2mmol/L dNTP, 20mmol/LTris-HCl (ρΗ8· 8)，I Ommol/L KCl, 3mmol/L MgSO4, I Ommol/L (NH4)2S04, 0. l%Triton x-100 和8U Bst DNA聚合酶大片段，I μ IDNA模板，用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足25 μ I。6. LAMP反應(yīng)擴(kuò)增條件將以上混合液置于65°C恒溫水浴中等溫?cái)U(kuò)增75min，再85°C保溫lOmin，反應(yīng)結(jié)束后加入I μ I配制好的顯色劑混勻后觀察結(jié)果。7. LAMP結(jié)果檢測結(jié)果可以采用以下兩種檢測方法I)將上述反應(yīng)完的體系中加入I μ I的顯色劑。輕晃混勻，即可觀察；2)取3 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳中電泳可觀察到梯形帶；本發(fā)明所提供的禾谷孢囊線蟲LAMP快速檢測方法具有以下優(yōu)點(diǎn)一、靈敏度高。對禾谷孢囊線蟲的檢測極限可達(dá)到1/200000條幼蟲水平，比常規(guī)PCR檢測禾谷孢囊線蟲的檢測靈敏度高100倍，也說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物特異性非常好。二、特異性強(qiáng)。所用的特異引物根據(jù)禾谷孢囊線蟲的RAro片段六個(gè)不同區(qū)域設(shè)計(jì)出5條引物，特異性比常規(guī)PCR要強(qiáng)。三、檢測時(shí)間短。I小時(shí)左右可獲得檢測結(jié)果，比常規(guī)PCR檢測縮短2 4h。四、不需要PCR儀。對儀器設(shè)備要求低，不需要任何PCR儀、凝膠電泳和成像系統(tǒng)，只需要一個(gè)水浴鍋或者保溫瓶就可以完成檢測。五、操作簡單、結(jié)果明顯。整個(gè)檢測過程不涉及復(fù)雜儀器和設(shè)備，一般技術(shù)人員即可完成檢測，結(jié)果容易辨別，通過不同顏色，肉眼即可觀察結(jié)果，不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。六、對人和環(huán)境友好。檢測過程不需要使用EB等有毒試劑，對人和環(huán)境非常安全。綜上所述，本發(fā)明具有比現(xiàn)有PCR技術(shù)檢測禾谷孢囊線蟲的方法具有更高的特異性、靈敏度和便攜性?？梢栽趯?shí)際生產(chǎn)中現(xiàn)場應(yīng)用檢測。該技術(shù)可應(yīng)用于對禾谷孢囊線蟲田間土壤樣品及小麥孢囊線蟲病的發(fā)生早期快速分子檢測，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。


圖1為禾谷孢囊線蟲RAPD序列的LAMP弓丨物設(shè)計(jì)示意圖，圖2為禾谷孢囊線蟲LAMP方法檢測，

A為加熒光染料檢測結(jié)果，1:陽性結(jié)果，具有綠色熒光，2 :陰性對照，為紅褐色。B檢測結(jié)果為電泳圖，M:D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)1:陽性結(jié)果，為LAMP擴(kuò)增梯形條帶，2 :陰性對照，無擴(kuò)增產(chǎn)物。圖3為禾谷孢囊線蟲LAMP檢測方法特異性檢測結(jié)果圖A為LAMP加熒光染料檢測結(jié)果圖，I為陽性，2 11為陰性，B為LAMP檢測結(jié)果電泳圖，圖4為禾谷孢囊線蟲靈敏度檢測結(jié)果A為LAMP加熒光染料檢測結(jié)果圖，I 7分別為:單頭線蟲，10'10_2、10_3、10_4、10_5、10_6和陰性對照。B為LAMP檢測結(jié)果電泳圖，M :D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)，I 7分別為單頭線蟲，10-1、10_2、10_3、I O-4、I O-5、10_6 和陰性對照。C為普通PCR法檢測結(jié)果電泳圖，M D2000DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量(Takara)，I 7分別為單頭線蟲，10-1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、陰性對照。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。所述試劑均為市售，所用禾谷孢囊線蟲本申請人實(shí)驗(yàn)室均有保存，可以免費(fèi)向公眾發(fā)放。主要試劑Taq DNA聚合酶購自天根公司；DNA marker購自TaKaRa公司；引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成；pGEM_T EasyVector購于美國promega Pro K(蛋白酶K)購自Roche公司；Bst DNA聚合酶大片段購自New England Biolabs公司；SYBR green I購自 Invitrogen 公司。
實(shí)施例1禾谷孢囊線蟲DNA的提取、RAPD擴(kuò)增及序列分析1.1禾谷孢囊線蟲DNA的提取挑取單個(gè)禾谷孢囊放入裝有10 μ IddH2O的O. 2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用無菌的玻璃棒在離心管中轉(zhuǎn)動(dòng)至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的600 μ g/ml蛋白酶K溶液，然后在_80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應(yīng)IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)。1. 2禾谷孢囊線蟲RAPD擴(kuò)增及序列分析應(yīng)用SCAR 標(biāo)記引物 0PD13-HaFl(5'-TGACGAGAACATATGATGGGGAT-GAT-3')和0PD13-HaRl (5'-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3' )擴(kuò)增禾谷孢囊線蟲特異性 SCAR 片段。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 μ 1，PCR反應(yīng)體系為10XBuffer (含Mg2+) 5 μ l,10mMdNTP4y 1，引物 0PD13-HaFl 和 0PD13-HaRl (10 μ mol/L)各 I μ 1，Taq 酶(5U/μ 1，Takara) O. 5 μ 1，模板DNA5y 1，滅菌ddH20補(bǔ)足至50 μ I。PCR擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變性5min，59°C退火30sec，72°C延伸1. 5min ;35個(gè)循環(huán)；72°C再次延伸10min，4°C保存。PCR擴(kuò)增后，取5 μ I擴(kuò)增產(chǎn)物加I μ I加樣緩沖液在1. 5%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測并照相回收、克隆和測序，序列測定由北 京六合華大基因科技有限公司完成。實(shí)施例2LAMP技術(shù)檢測禾谷孢囊線蟲方法的建立2.1LAMP 引物設(shè)計(jì)根據(jù)禾谷孢囊線蟲 RAH)擴(kuò)增序列測序結(jié)果，設(shè)計(jì)并篩選下述LAMP引物(見圖1)，引物交上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列如下①HA5-F3 :5'-TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5' -GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP :5'-TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGC TTCATTTGAGAACAATG—3' ;④HA5-FIP :5'-ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCA TGGCAAAGA—3' ;⑤HA5-LB :5' -CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG—3' ;2. 2LAMP反應(yīng)體系配置引物混合液外引物HA5-F3和HA5-B3各O. 2 μ mol/L，內(nèi)引物HA5-FIP和HA5BIP各1. 4 μ mol/L,環(huán)引物 HA5-LB 為 O. 4 μ mol/L ；反應(yīng)混合液3.2mmol/LdNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8), 10mmol/LKCl, 3mmol/L MgSO4, lOmmol/L(NH4)2S04, 0. l%Triton x-100, 8U Bst DNA 聚合酶大片段，I μ IDNA模板，加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ I。2. 3LAMP反應(yīng)擴(kuò)增條件將以上混合液置于65°C恒溫水浴中等溫?cái)U(kuò)增75min，85°C保溫lOmin，反應(yīng)結(jié)束后加入I μ I配制好的顯色劑混勻后觀察結(jié)果(圖2中Α)。取2 μ I產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳，EB染色，在紫外燈下觀測并照相，可看到有LAMP的特征性梯形帶(圖2中B)。實(shí)施例3禾谷孢囊線蟲LAMP特異性檢測收集禾谷孢囊線蟲、菲利普孢囊線蟲、大豆孢囊線蟲、旱稻孢囊線蟲、豌豆孢囊線蟲、大麥孢囊線蟲、南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲、香蕉穿孔線蟲(見表1)，分別提取其DNA作為模板與禾谷孢囊線蟲DNA模板一起進(jìn)行LAMP檢測，以檢測禾谷孢囊線蟲LAMP檢測方法的特異性。
表I供試的其它植物線蟲群體樣品代碼及來源
權(quán)利要求
1.一種禾谷孢囊線蟲LAMP快速檢測方法，其特征在于其中LAMP反應(yīng)體系所使用的引物是①HA5-F3 5'-TGATAGGGAAAAAATTCTCCAA-3' ；②HA5-B3 5'-GTCGGCAATGGTCAACAA-3' ;③HA5-BIP 5'-TTGTGGTGCCGTAGTGTTAGAAATGC TTCATTTGAGAACAATG-3';④HA5-FIP 5'-ACACAACGCTTAGTCCGGTCCCAATGGCATGGCAAAGA-3' ;⑤HA5-LB 5'-CGGGGATGAAAGAAGGCAAAGTG-3'。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其中的LAMP反應(yīng)體系包括1)引物混合液:外引物HA5-F3和HA5-B3各O.2ymol/L,內(nèi)引物HA5-FIP和HA5-BIP 各1. 4ymol/L,環(huán)引物 HA5-LB 為 O. 4 μ mol/L ;2)反應(yīng)混合液3.2mmol/L dNTP, 20mmol/L Tris-HCl (pH8. 8)，IOmmoI/L KCl, 3mmol/L MgSO4, IOmmoVL(NH4)2SO4, 0. l%Triton χ-100, 8U Bst DNA 聚合酶大片段;3)I μ I DNA 模板；加滅菌雙蒸餾水補(bǔ)全到25 μ I。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其中LAMP反應(yīng)條件如下將引物混合液和反應(yīng)混合液混合均勻后加入I μ I DNA模板，61 65°C保溫30 90min，85°C保溫lOmin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的檢測方法，LAMP反應(yīng)的最終產(chǎn)物中加入顯色劑，輕甩離心管后觀察。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述顯色劑為SYBRgreen I與PCR級DMSO的混合物，其體積比為1:9。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，所述DNA模板的提取方法為挑取單個(gè)禾谷孢囊放入裝有10 μ I ddH20的O. 2mL離心管中，液氮冷凍，取出后置于冰上，用滅菌的玻璃棒在離心管中轉(zhuǎn)動(dòng)至冰融化，將孢囊捅破，釋放出卵，加入8μ I的LB溶液，2 μ I的eOOyg/ml 蛋白酶K溶液，然后在-80°C下冷凍30min。將離心管取出，在65°C下溫育90min，95°C反應(yīng) IOmin處理后上清液作為線蟲DNA模板直接用于LAMP和PCR反應(yīng)，所述LB溶液為500mmol/ L KCl, 10mmol/L Tris-HCl, 15mmol/L MgCl2,1. 0mmol/L DTT，4. 5%Tween20，等體積混勻，過濾滅菌。
7.如權(quán)利要求1-6所述的任一檢測方法在診斷植物、土壤的禾谷孢囊線蟲感染情況或鑒別禾谷孢囊線蟲中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種禾谷孢囊線蟲LAMP快速檢測方法及應(yīng)用。根據(jù)克隆得到的禾谷孢囊線蟲RAPD序列，設(shè)計(jì)篩選5條LAMP引物HA5-F3、HA5-B3、HA5-FIP、HA5-BIP和HA5-LB；配制并優(yōu)化了LAMP反應(yīng)體系。通過對禾谷孢囊線蟲DNA提取，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物顯色和觀察，從而快速檢測出禾谷孢囊線蟲。本發(fā)明的檢測方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、成本低廉、操作簡便，在禾谷孢囊線蟲快速檢測和禾谷孢囊線蟲病的早期和田間診斷方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103045751SQ20131002038
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月20日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月20日
發(fā)明者彭德良, 徐小琴, 彭煥, 亓?xí)岳? 黃文坤, 賀文婷, 姜道宏 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所