專利名稱：豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性rapd標(biāo)記和scar標(biāo)記快速分子檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性RAPD標(biāo)記全序列、特異性SCAR標(biāo)記引物序列及豌豆孢囊線蟲(chóng)SCAR標(biāo)記快速分子檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
豌豆孢囊線蟲(chóng)(H. goettingiana Liebscher, 1892),是歐洲一些國(guó)家中侵染豌豆的主要病害。目前已在歐洲、非洲、前蘇聯(lián)和地中海地區(qū)有分布，美國(guó)也有報(bào)道，但是相關(guān)分布范圍較小。豌豆孢囊線蟲(chóng)在我國(guó)的分布和傳播正在調(diào)查中，目前在青海，湖北，四川等地均有為害大豆的發(fā)現(xiàn)。豌豆孢囊線蟲(chóng)的寄主主要為豆科的豌豆(PisumsativumL.),蠶 豆(Viciafaba)JHl5_M (Viciaspp.),大豆(Glycines max),小扁豆(Lens sculenta)等(Winslow R D.Provisional lists of host plants of some root eelworm(Heteroderaspp.). Annals of Applied Biology 1954，41:591-605),此外還可寄生野草寄主，寄主范圍相對(duì)較窄。通常進(jìn)行3-6年輪作就可降低豌豆孢囊線蟲(chóng)種群水平不對(duì)寄主構(gòu)成危害，但必須嚴(yán)格控制野草寄主(Di Vito M, Greco N. The pea cyst nematode. In:Lamberti, F. &Taylor, C. E. (Eds). Cyst nematodes. New York & London, Plenum Press 1986,321-332)。被侵染的豌豆植株會(huì)矮化，葉片變黃，根部分支減少，不能開(kāi)花或者花過(guò)早脫落，同受大豆孢囊線蟲(chóng)侵染的大豆一樣，豌豆的根部發(fā)育不良。豌豆孢囊線蟲(chóng)完成一代大約需要3-15周，時(shí)間隨著土壤溫度的改變而變化。含有卵的孢囊即使在無(wú)寄主的條件下也能存活12年。豌豆孢囊線蟲(chóng)侵染后，豌豆開(kāi)花期表現(xiàn)出矮縮黃萎，豌豆孢囊線蟲(chóng)抑制豌豆根瘤的形成和固氮作用，從而使豌豆產(chǎn)量降低，同時(shí)還可導(dǎo)致植株對(duì)土壤中一些對(duì)根部為害的菌類敏感，從而造成線蟲(chóng)與菌類的復(fù)合侵染。目前豌豆孢囊線蟲(chóng)的鑒定大部分仍然依賴于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法，豌豆孢囊線蟲(chóng)的孢囊與其近緣屬種的孢囊形態(tài)類似，形態(tài)學(xué)鑒定耗時(shí)、需要很熟練的技術(shù)作為基礎(chǔ)，并且需要專門從事分類的人員來(lái)完成，因此豌豆孢囊線蟲(chóng)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法不適用于大規(guī)模的樣品檢測(cè)且不能有效的調(diào)查豌豆孢囊線蟲(chóng)的分布和擴(kuò)散。為了彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)鑒定的不足，快速、準(zhǔn)確的對(duì)農(nóng)作物孢囊線蟲(chóng)進(jìn)行鑒定和檢測(cè)，分子檢測(cè)技術(shù)迅速發(fā)展。20世紀(jì)80年代后期發(fā)展成功的DNA多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))，使得直接擴(kuò)增DNA成為可能，在PCR基礎(chǔ)上還產(chǎn)生了各種新的分子標(biāo)記技術(shù)，例如RFLP，RAPD, AFLP, Real-time PCR, SSR等。這些分子標(biāo)記和檢測(cè)技術(shù)都成功的應(yīng)用到植物寄生線蟲(chóng)特別是農(nóng)作物孢囊線蟲(chóng)的分類鑒定和檢測(cè)過(guò)程中。各種分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)各有利弊，在這些分子標(biāo)記中，RAPD標(biāo)記(RandomAmplified Polymorphism DNA)的優(yōu)點(diǎn)在于所需DNA量極少，要求設(shè)備也相對(duì)簡(jiǎn)單。在植物寄生線蟲(chóng)的分子檢測(cè)中應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。RAPD標(biāo)記由Wi 11 iams等和Welsh等兩個(gè)研究小組在1990年發(fā)現(xiàn)。隨著RAPD技術(shù)的應(yīng)用，RAPD的缺點(diǎn)也凸顯出來(lái)，由于RAI3D引物非常短，只有十個(gè)堿基，退火溫度也較低，如果PCR體系變化，或者儀器變化，重復(fù)性會(huì)變差，而且易產(chǎn)生非特異性的條帶。為了彌補(bǔ)這一不足，Paran和Michelmore于1993年提出可以將其轉(zhuǎn)為 SCAR (sequence characterized amplified region)標(biāo)記(Paran I, MichelmoreR W. Development of reliable PCR—based markers linked to downy mildew risistencegenes in lettuce. Theoretical and Applied Genetics 1993，85:985-993.)，并應(yīng)用到了快速分子檢測(cè)中。在抱囊線蟲(chóng)的RAPD 檢測(cè)實(shí)例方面，Edward P. CaswelI-Chen 等(Edward P，Caswell-Chenj Valerie M，Williamson, FrancesF. Wu. Random amplified polymorphicDNA analysis of Heterodera cruciferae and H. schachtii populations. Journal ofNematology 1992，24(3) :343-351)運(yùn)用 RAPD 標(biāo)記區(qū)分了 H. cruciferae 和 H. schachtii，用10個(gè)不同的隨機(jī)引物擴(kuò)增燕麥孢囊線蟲(chóng)的不同種群的DNA，產(chǎn)生了 78條清晰的譜帶。1995 年 Lopez-Braiia I 等(Lopez-Braiia I，Romero M D，Delibes A. Analysis ofHeterodera avenae populations by the random amplifiedpolymorphic DNAtechnique.Genome 1995，Vol. 39:1996)對(duì)禾谷孢囊線蟲(chóng)群體做了 RAPD分析。1996年，Jianbo Li等 (Jianbo Li，Jamal Faghhihij John M. Ferris, et al. The use of RAPD amplified DNA asmarkers for virulence characteristics in soybean syst menatode. Fundamental AndApplied Nematology 1996，19 (2) : 143-150)用RAPD標(biāo)記技術(shù)研究了大豆抗性品種與大豆孢囊線蟲(chóng)的致病型之間的關(guān)系。1997年，Blok V. C.等(Blok V C，Philips，Harrower BE. Comparison of British populations of potato cyst nematodes with populationsfrom continental Europe and south America using RAPDs. Genome 1997,40:286-293)通過(guò)RAPD技術(shù)研究馬鈴薯金線蟲(chóng)和馬鈴薯白線蟲(chóng)兩個(gè)群體的線蟲(chóng)致病型之間的遺傳關(guān)系ORAH)標(biāo)記與SCAR標(biāo)記的聯(lián)合應(yīng)用后，在孢囊線蟲(chóng)的分子檢測(cè)方面也取得了—定進(jìn)展，例如 Fullanodo，A. et. al (Fullaondo A，Barrena Ej Viribay M，BarrenaI,Salazar A，Ritter E.Identification of potato cyst nematode species Globoderarostochiensis and G. pallida by PCR using specific primer combinations.Nematology 1999，1:157-163)用隨機(jī)引物0PG5分別擴(kuò)增出區(qū)分馬鈴薯金線蟲(chóng)和馬鈴薯白線蟲(chóng)特異性RAH)標(biāo)記片段，轉(zhuǎn)化成SCAR標(biāo)記后，分別擴(kuò)增出了 315bp的馬鈴薯金線蟲(chóng)片段和 798bp 的馬鈴薯白線蟲(chóng)片段。Ou，S.Q.，Peng D. L (Ou S Qj Peng D L，Li Y，MoensM.Identification of Heterodera glycines using PCR with sequence characterisedamplified region (SCAR) primers. Nematology 2008，10(3) : 397-403)米用 RAPD 技術(shù)，獲得了基于大豆孢囊線蟲(chóng)基因組DNA的特異性SCAR標(biāo)記，構(gòu)建的特異性SCAR標(biāo)記引物擴(kuò)增出500bp大豆孢囊線蟲(chóng)的特異性SCAR片段，選用核糖體引物D2A和D3B作為內(nèi)標(biāo)與上述特異性引物SCNFl和SCNRl相結(jié)合，發(fā)明了一步雙重PCR方法檢測(cè)大豆孢囊線蟲(chóng)，在PCR擴(kuò)增條件下，大豆孢囊線蟲(chóng)群體都獲得了 500bp的特異性SCAR標(biāo)記片段和800bp片段。在其他線蟲(chóng)的檢測(cè)方面，RAH)和SCAR標(biāo)記也有不少應(yīng)用，例如Meng Qing-peng等(Meng Qingpengj Long H，Xu J H. PCR assays for rapid and sensitive identificationof three majorroot-knot nematodes,Meloidogyne incognita, M. javanica andM. arenaria. Acta Phytopathologica Sinica 2004, 34 (3) : 204-210)成功地將南方根結(jié)線蟲(chóng)和爪哇根結(jié)線蟲(chóng)特異的隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA片段轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。Adam Μ. A. M.等(Adam M A M，Phillips M S，Blok V C. Molecular diagnostic key for identificationof single juveniles of seven common and economically important species ofroot-knot nematode (Meloidogyne spp.). Plant Pathology 2007，56:190-197)運(yùn)用 SCAR標(biāo)記技術(shù)區(qū)分了根結(jié)線蟲(chóng)屬的七種線蟲(chóng)。國(guó)內(nèi)外雖然有關(guān)于豌豆孢囊線蟲(chóng)核糖體DNA的ITS區(qū)域的研究報(bào)道，但在我國(guó)，豌豆孢囊線蟲(chóng)的報(bào)道較少，并且國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)基于基因組DNA的RAPD和SCAR標(biāo)記特異性分子檢測(cè)豌豆孢囊線蟲(chóng)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述技術(shù)領(lǐng)域的空白，本發(fā)明提供豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性RAro標(biāo)記的全長(zhǎng)序列，同時(shí)設(shè)計(jì)SCAR標(biāo)記特異性引物將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，提供豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性RAPD和SACR標(biāo)記的快速分子檢測(cè)方法，為制定線蟲(chóng)的快速分子檢測(cè)、豌豆孢囊線蟲(chóng)病的早期診斷和制定線蟲(chóng)病害綜合治理對(duì)策服務(wù)。 豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NOl所示。根據(jù)豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段的保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物。優(yōu)選該特異性引物HgoFl和HgoRl，其序列為HgoFl :5’ -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’，HgoRl :5’ -TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3’。豌豆孢囊線蟲(chóng)SCAR標(biāo)記快速分子檢測(cè)方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系中含有上述特異性引物HgoFl和HgoRl。所述反應(yīng)體系反應(yīng)體系總體積為25μ 1，其中2.5μ I IOXPCR含Mg2+的Buffer ；2. Ομ IdNTP ；1. Ομ I 引物 HgoFl (O. I μ g/μ 1)；1. Ομ I 引物 HgoRl (O. I μ g/μ I)；O. 25 μ I Taq DNA聚合酶(5U/μ I) ；1.0μ I模板DNA (豌豆孢囊線蟲(chóng)及其它孢囊線蟲(chóng)群體提取的基因組DNA) ;(1(1!120補(bǔ)足2541。所述PCR 的擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5min，然后 94°C 30S，56°C 30S，72°C Imin 循環(huán)35次，72°C延伸lOmin，保存在4°C條件下。本發(fā)明利用RAPD技術(shù)，獲得了基于豌豆孢囊線蟲(chóng)基因組DNA的特異性RAPD標(biāo)記，經(jīng)克隆測(cè)序后，設(shè)計(jì)SCAR標(biāo)記引物，將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)換成SCAR標(biāo)記，利用該SCAR標(biāo)記的特異性引物，可檢測(cè)出目標(biāo)線蟲(chóng)。本發(fā)明構(gòu)建了特異性SCAR標(biāo)記的特異性引物HgoFl和HgoRl (即SEQ ID N02和SEQ ID N03)。利用此特異性引物，在PCR擴(kuò)增條件下，所有豌豆孢囊線蟲(chóng)群體都獲得了544bp的特異性SCAR標(biāo)記片段，而其它線蟲(chóng)類則沒(méi)有544bp的特異性SCAR標(biāo)記片段。本發(fā)明構(gòu)建的特異性引物HgoFl和HgoRl，特異性強(qiáng)，準(zhǔn)確，靈敏。本發(fā)明應(yīng)用特異性SCAR標(biāo)記PCR檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)目標(biāo)線蟲(chóng)，與重復(fù)性較差的RAPD技術(shù)(RAPD-PCR)、核糖體DNA限制性內(nèi)切酶技術(shù)(RFLP-PCR)檢測(cè)方法相比，能夠更省時(shí)、準(zhǔn)確、靈敏，更能建立快速、準(zhǔn)確的豌豆孢囊線蟲(chóng)檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)可應(yīng)用于對(duì)豌豆孢囊線蟲(chóng)發(fā)生的大豆田間土壤樣品及豌豆孢囊線蟲(chóng)病發(fā)生的早期快速分子檢測(cè)，具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。


圖I :用12個(gè)Operon系列的含10個(gè)堿基的隨機(jī)引物對(duì)豌豆孢囊線蟲(chóng)HgoOl進(jìn)行擴(kuò)增的擴(kuò)增結(jié)果，M 為標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子標(biāo)記(DNA marker DL 2，000);1_12 :隨機(jī)引物 OPAtl2, OPA06, OPA09，OPA13, OPA18, OPB15, OPC06, OPD13, OPG06, OPG08, OPG10, OPK16; 13 :陰性對(duì)照。(代碼見(jiàn)表 I 和表 2)圖2 :用隨機(jī)引物OPAtl6擴(kuò)增豌豆孢囊線蟲(chóng)、禾谷孢囊線蟲(chóng)、菲利普孢囊線蟲(chóng)、大豆孢囊線蟲(chóng)、旱稻孢囊線蟲(chóng)、大麥孢囊線蟲(chóng)、香蕉穿孔線蟲(chóng)、馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)等的RAH)的特異性DNA片段結(jié)果，M 為標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子標(biāo)記(DNA marker DL 2，000)；l-9:Hgo01, Hgo02, Hgo03, Hgo04,Hgo05, Hgo08, Hgo09, HgolO, Hgol2; 10-20:HfOl, Hf06, HaOI, Ha06, HgOI, Hg03, HeOl, He04, H101,Rs01,Dd01;21 :陰性對(duì)照。(代碼見(jiàn)表I)圖3 :用豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性SCAR標(biāo)記引物(HgoFl和HgoRl)擴(kuò)增6種孢囊線蟲(chóng) 和2種非孢囊線蟲(chóng)的結(jié)果，M 為標(biāo)準(zhǔn) DNA 分子標(biāo)記(DNA marker DL 2，000);l_12:Hgo01，Hgo02, Hgo03, Hgo04，Hgo05, Hgo06, Hgo07, Hgo08, Hgo09, HgolO, Hgol 1，Hgol2; 13-23:HfOl, Hf06, HaOI, Ha06, Hg
01,Hg03, HeOl, He04, H101, RsOl, DdOl; 24 :陰性對(duì)照。(代碼見(jiàn)表 I)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)選用的材料供試線蟲(chóng)包括19個(gè)禾谷孢囊線蟲(chóng)群體，11個(gè)菲利普孢囊線蟲(chóng)群體，3個(gè)大豆孢囊線蟲(chóng)群體，12個(gè)豌豆孢囊線蟲(chóng)群體，5個(gè)旱稻孢囊線蟲(chóng)群體，I個(gè)大麥孢囊線蟲(chóng)群體,I個(gè)馬鈴薯腐爛莖線蟲(chóng)群體，I個(gè)松材線蟲(chóng)群體，I個(gè)香蕉穿孔線蟲(chóng)群體，共計(jì)54個(gè)線蟲(chóng)群體。如表I所示。所述供試線蟲(chóng)樣品可以對(duì)公眾發(fā)放。表I供試線蟲(chóng)樣品代碼及群體來(lái)源
權(quán)利要求
1.豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段，其核苷酸序列如SEQID NOl所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段的保守序列設(shè)計(jì)的特異性引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的特異性引物為HgoFl和HgoRl，其序列為HgoFl :5’ -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’，HgoRl :5’ -TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3’。
4.豌豆孢囊線蟲(chóng)SCAR標(biāo)記快速分子檢測(cè)方法，其特征在于PCR反應(yīng)體系中含有權(quán)利要求2或3所述的特異性引物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測(cè)方法，所述的特異性引物為HgoFl和HgoRl，其序列為HgoFl :5’ -GATGTTGTGCTTTCACAGGTTTG-3’，HgoRl :5’ -TGTTTGTACTCACTCCTTCGCTC-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，所述反應(yīng)體系總體積為25μ1，其中2. 5μ I10 X PCR 含 Mg2+的 Buffer ;2·0μ I dNTP ；1. Ομ I 濃度為 O. I μ g/μ I 的引物 HgoFl ；1. Ομ I濃度為O. I μ g/ μ I的引物HgoRl ；0. 25 μ I濃度為5U/ μ I的Taq DNA聚合酶；1. O μ I模板DNA ;ddH20 補(bǔ)足 25 μ I。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法，所述PCR的擴(kuò)增程序?yàn)?4°C預(yù)變性5min，然后940C 30S,56°C 30S,72°C Imin 循環(huán) 35 次，72°C延伸 lOmin，保存在 4°C條件下。
全文摘要
本發(fā)明為“豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性RAPD標(biāo)記和SCAR標(biāo)記快速分子檢測(cè)方法”，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性RAPD標(biāo)記的DNA片段，其具有如SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。根據(jù)該豌豆孢囊線蟲(chóng)特異性RAPD擴(kuò)增片段，設(shè)計(jì)特異性引物HgoF1和HgoR1，將其轉(zhuǎn)化為更加穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記片段，在SCAR標(biāo)記快速分子檢測(cè)豌豆孢囊線蟲(chóng)的方法中，可擴(kuò)增出544bp的特異性片段。本發(fā)明提高了分子檢測(cè)靈敏度并且快速準(zhǔn)確，在豌豆孢囊線蟲(chóng)檢測(cè)以及豌豆孢囊線蟲(chóng)病的早期診斷方面，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/11GK102690825SQ201210200468
公開(kāi)日2012年9月26日 申請(qǐng)日期2012年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月14日
發(fā)明者丁中, 亓?xí)岳? 彭德良, 彭煥, 賀文婷, 黃文坤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所