一種l-草銨膦的酶-化學(xué)催化去消旋化制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及L-草銨膦的酶-化學(xué)催化去消旋化制備方法，屬于酶法制備手性農(nóng)藥
技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 德國赫斯特(Hoechst)公司開發(fā)的草銨膦(Glufosinate)是一種谷氨酰胺合成酶 (GS)抑制劑，能抑制GS所有已知的形式，導(dǎo)致植物體內(nèi)氮代謝紊亂、氨的過量積累、葉綠體 解體，從而使光合作用受抑，最終導(dǎo)致植物死亡。草銨膦具有很強(qiáng)的除草活性，幾乎能有效 防除各種供試雜草，對(duì)農(nóng)作物安全，活性高，殺草譜廣，藥害小，是目前轉(zhuǎn)基因抗性作物理想 的除草劑。草銨膦同時(shí)也是一種優(yōu)良的殺菌劑。
[0003] 草銨膦含一個(gè)手性中心，其L-對(duì)映體的除草活性是消旋體的2倍，不易產(chǎn)生抗藥 性，產(chǎn)品壽命周期比消旋體更長。如果草銨膦產(chǎn)品能以L-構(gòu)型的純光學(xué)異構(gòu)體形式使用，可 使草銨膦的使用量降低50%，這對(duì)于提高原子經(jīng)濟(jì)性、降低使用成本、減輕環(huán)境壓力都具有 十分重要的意義。
[0004] L-草銨膦的制備方法主要包括化學(xué)法和生物法。
[0005] ( - )化學(xué)法。赫斯特公司（US5767309)采用不對(duì)稱轉(zhuǎn)換法，以奎寧為手性拆分劑拆 分DL-草銨膦制備L-草銨膦。該方法使用昂貴的手性拆分劑，經(jīng)歷成鹽、誘導(dǎo)結(jié)晶、解鹽、重 結(jié)晶等復(fù)雜步驟。文獻(xiàn)報(bào)道了大量的L-草銨膦化學(xué)不對(duì)稱合成法(毛明珍等，農(nóng)藥，2014,53
[6] :391-393)?；瘜W(xué)不對(duì)稱合成法采用價(jià)格昂貴的手性源、手性助劑或手性催化劑，通常步 驟冗長，合成路線復(fù)雜，反應(yīng)條件苛刻，產(chǎn)品收率和光學(xué)純度低，生產(chǎn)成本高，不適合L-草銨 膦的工業(yè)化生產(chǎn)。
[0006] (二)生物法。生物法包括生物不對(duì)稱合成法和生物拆分法(樓億圓等，現(xiàn)代農(nóng)藥， 2009,8(3): 1-10)。生物不對(duì)稱合成法主要包括氨基酸脫氫酶法和轉(zhuǎn)氨酶法。氨基酸脫氫 酶法以2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸為原料，采用谷氨酸脫氫酶/葡萄糖脫氫酶體系制 備L-草銨勝，收率僅為25%，ee值為89.2%(Fang JM et al. J Chem Soc, Perkin Trans I， 1995:967-978 .)。該方法中不僅谷氨酸脫氫酶的利用效率非常低，產(chǎn)物收率低，而且輔酶 NADH需再生，難以在工業(yè)化生產(chǎn)中應(yīng)用。轉(zhuǎn)氨酶法以2-羰基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸為氨 受體，L-谷氨酸或L-天冬氨酸為氨供體，通過轉(zhuǎn)氨化反應(yīng)制備L-草銨膦，轉(zhuǎn)化率達(dá)到75%，ee >99%(US5153355)。由于轉(zhuǎn)氨化是一個(gè)可逆反應(yīng)，存在兩個(gè)L-氨基酸和兩個(gè)α-酮酸的反應(yīng)平 衡，L-草銨膦不僅收率低，而且也增加了分離難度。生物拆分法主要包括以DL-2-氨基-4-(羥基甲基膦?；?丁酰胺為原料的L-酰胺酶拆分法，以Ν-乙酰(苯乙酰)-DL-草銨膦為原料 的?；覆鸱址?，以2-氨基-4-(羥基甲基磷?；┒‰鏋樵系碾嫠饷覆鸱址ǎ–N 103275896 A)等。生物拆分法的理論收率僅為50%。通常情況下，生物拆分法需要以衍生的 DL-草銨膦為原料，涉及無效對(duì)映體的化學(xué)消旋和循環(huán)拆分。
[0007] 相比于化學(xué)法，生物法具有立體選擇性嚴(yán)格、反應(yīng)條件溫和、收率高及產(chǎn)物易分離 純化的優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)現(xiàn)L-草銨膦工業(yè)化生產(chǎn)最具潛力的方法。開發(fā)一種簡(jiǎn)捷、高效、綠色的生 物制備方法將是今后生產(chǎn)L-草銨膦的重要突破口和發(fā)展方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 鑒于此，本發(fā)明的目的是提供一種L-草銨膦的酶-化學(xué)催化去消旋化制備方法。采 用"一鍋煮"反應(yīng)方式，以未經(jīng)衍生的DL-草銨膦為原料，利用固定化D-氨基酸氧化酶對(duì)映選 擇性催化DL-草銨膦中的D-對(duì)映體氧化脫氫為2-亞氨基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸，L-草銨 膦完全保留。利用鈀碳-甲酸銨化學(xué)催化氫轉(zhuǎn)移體系將2-亞氨基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸 原位還原為DL-草銨膦，通過生物氧化-化學(xué)還原循環(huán)實(shí)現(xiàn)DL-草銨膦的去消旋化，反應(yīng)過程 中形成的過氧化氫利用過氧化氫酶原位分解去除，從而以高的收率和高的光學(xué)純度制備L-草銨膦。
[0009] 技術(shù)路線如下：
本發(fā)明包括去消旋化步驟和L-草銨膦分離步驟，具體方法步驟如下： 1)去消旋化反應(yīng)，在lmol/L的甲酸銨溶液(pH6.5)中加入DL-草銨膦，攪拌溶解，配制的 溶液中DL-草銨膦的濃度為10~20%(w/v)。然后加入固定化D-氨基酸氧化酶、過氧化氫酶和 鈀碳，連續(xù)通入氧氣，30°C下攪拌反應(yīng)直至D-對(duì)映體反應(yīng)完全； 其中，固定化D-氨基酸氧化酶(酶活為50u/g)與DL-草銨膦的質(zhì)量比為0.1~0.2:1，過氧 化氫酶(酶活為50000u/ml)與固定化D-氨基酸氧化酶的活性比為100~200:1，鈀碳（10%)與 固定化D-氨基酸氧化酶的質(zhì)量比為1~2:1，攪拌反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為12~24h。
[0010] 反應(yīng)過程監(jiān)測(cè)和L-草銨膦光學(xué)純度采用手性液相色譜法測(cè)定。手性液相色譜柱： Crownpak CR(+)(4.0X150mm，5μηι)，流動(dòng)相：高氯酸溶液(pHl · 5 )，流速:0 · 5ml /min，檢測(cè)： UV210nm。對(duì)映體色譜峰定位采用標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。L-草銨膦的光學(xué)純度用對(duì)映體過量值(ee)表 不。
[0011] 2)L-草銨膦分離，經(jīng)步驟1)反應(yīng)后的反應(yīng)液過濾去除固定化D-氨基酸氧化酶和鈀 碳，再將濾液用28%氨水調(diào)節(jié)pH至8.0，80°C下減壓濃縮至體積為濾液的1/5，冰浴冷卻，析出 固體，烘干得L-草銨膦。
[0012] 與現(xiàn)有的L-草銨膦制備方法相比，本發(fā)明提出的酶-化學(xué)催化去消旋制備方法具 有以下優(yōu)點(diǎn)：1)工藝簡(jiǎn)單。雙酶反應(yīng)和化學(xué)催化氫轉(zhuǎn)移反應(yīng)在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行。高濃 度DL-草銨膦不經(jīng)衍生，直接作為固定化D-氨基酸氧化酶的反應(yīng)底物。中間產(chǎn)物2-亞氨基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸不經(jīng)分離，直接原位轉(zhuǎn)化為DL-草銨膦，用于連續(xù)轉(zhuǎn)化。反應(yīng)過程 中產(chǎn)生的過氧化氫利用過氧化氫酶原位分解，最大程度減小了過氧化氫對(duì)D-氨基酸氧化酶 活性的的抑制作用和對(duì)2-亞氨基-4-(羥基甲基膦?；?丁酸的分解作用。2)分離過程簡(jiǎn)單。 產(chǎn)物流中僅含L-草銨膦和少量的副產(chǎn)物4-(羥基甲基膦?；?-2-丁酮酸和3-(羥基甲基膦 ?；?-丙酸，只需采用簡(jiǎn)單的濃縮、結(jié)晶方法即可以高的收率和高的光學(xué)純度實(shí)現(xiàn)L-草銨 膦的分離。3)成本低廉。固定化D-氨基酸氧化酶和Pd-C催化劑均為多相催化劑，可回收重