專(zhuān)利名稱(chēng)：轉(zhuǎn)AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高青蒿中青蒿素含量的方法，特別是一種轉(zhuǎn)AaffRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。
背景技術(shù)：
青蒿(Artemisia annua L.)是菊科蒿屬的一年生草本植物。青蒿素(artemisinin)是從其地上部分分離的一種含有過(guò)氧橋結(jié)構(gòu)的倍半職內(nèi)酯化合物,是目前世界上公認(rèn)的最有效的治療瘧疾的藥物，特別是對(duì)于腦型瘧疾和抗氯喹瘧疾具有速效和低毒的特點(diǎn)。目前，世界衛(wèi)生組織推薦的最有效的治療瘧疾的方法就是青蒿素聯(lián)合療法(ACTs)。另外，隨著對(duì)青蒿素藥理研究的逐步深入，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)青蒿素及其衍生物還具有抗炎、抗血吸蟲(chóng)、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié)的功能?？梢?jiàn)青蒿素是一種極具潛力的天然藥物。 目前青蒿素的主要來(lái)源是從青蒿植株的地上部分提取，然而青蒿中青蒿素的含量非常低，不同種植環(huán)境和種植品種中其平均含量在青蒿葉片干重的0.01 1%，使得這種藥物的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)受到了限制。由于青蒿素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，人工合成難度大，產(chǎn)量低，成本高，不具有可行性。有人嘗試用組織培養(yǎng)和細(xì)胞工程的方法來(lái)生產(chǎn)青蒿素，然而青蒿素在愈傷組織中含量低于干重的0. 1%，在芽中最高也只有干重的0. 16%，而大多數(shù)研究在根中沒(méi)有檢測(cè)到青蒿素。因此利用組織培養(yǎng)及細(xì)胞工程來(lái)生產(chǎn)青蒿素的可行性也不高。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，Ma等2009年在《Plant & Cell Physiology》(植物和細(xì)胞生理學(xué))發(fā)表了題為 “Isolation and Characterization of AaffRKYI, anArtemisia annua Transcription Factor that Regulates the Amorpha—4， 11—dieneSynthase Gene, a Key Gene of Artemisinin Biosynthesis”(“調(diào)控青蒿素生物合成關(guān)鍵酶ADS的WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子AaWRKYl的分離和克隆”)的論文，報(bào)道通過(guò)酵母單雜和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)初步的驗(yàn)證了 AaWRKYl能夠和ADS的啟動(dòng)子結(jié)合，并通過(guò)構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)青蒿，發(fā)現(xiàn)青蒿中青蒿素合成途徑中的酶的表達(dá)都增加了。這說(shuō)明AaWRKYl在青蒿素的合成中具有重要的作用?，F(xiàn)有技術(shù)中青蒿WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子AaWRKYl能夠調(diào)控青蒿素合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶ADS，是青蒿素代謝工程的重要元件。采用基因工程手段，用AaWRKYl基因轉(zhuǎn)化青蒿，將打破青蒿素生物合成的限速瓶頸，獲得青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)模化生產(chǎn)青蒿素提供一條新途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種轉(zhuǎn)AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法。本發(fā)明建立了穩(wěn)定提高青蒿中青蒿素含量的方法，為青蒿素的規(guī)模化生廣提供了聞廣、穩(wěn)定的新藥源。本發(fā)明的目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種轉(zhuǎn)AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括如下步驟
步驟一，采用基因克隆方法獲得青蒿WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子AaWRKYl基因；步驟二，把所述AaWRKYl基因連結(jié)于表達(dá)調(diào)控序列，構(gòu)建含AaWRKYl基因的植物表達(dá)載體；步驟三，將所述含AaWRKYl基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含所述AaWRKYl基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株；步驟四，利用所述構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的整合外源目的基因AaWRKYl基因的轉(zhuǎn)基因青蒿植株；步驟五，對(duì)所述轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量進(jìn)行HPLC-ELSD測(cè)定，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。優(yōu)選的，在所述步驟四中，所述轉(zhuǎn)化包括以下步驟外植體的預(yù)培養(yǎng)；農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)；抗性再生植株的篩選。 優(yōu)選的，所述預(yù)培養(yǎng)包括以下步驟青蒿種子用75%乙醇浸泡lmin,再用20%NaC10浸泡20min,無(wú)菌水沖洗3 4次,用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分,接種于無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基中，25°C光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無(wú)菌苗，待苗長(zhǎng)至5cm后，剪取無(wú)菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。優(yōu)選的，所述共培養(yǎng)包括以下步驟將所述葉片外植體轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，滴加含活化的所述含AaWRKYl基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS懸液，使所述外植體與所述懸液充分接觸，28°C暗培養(yǎng)3天，以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對(duì)照。優(yōu)選的，所述篩選包括以下步驟將所述共培養(yǎng)3天的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基上于25°C光照培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，經(jīng)過(guò)2 3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽，將所述生長(zhǎng)良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根，即可獲得Kan抗性再生青蒿植株。優(yōu)選的，在所述步驟四中，所述PCR檢測(cè)包括以下步驟設(shè)計(jì)合成AaWRKYl基因的引物；進(jìn)行DNA擴(kuò)增；紫外線下觀察到目的條帶的陽(yáng)性株系即為轉(zhuǎn)基因青蒿植株。優(yōu)選的，在所述步驟五中，所述HPLC-ELSD測(cè)定包括以下條件色譜柱C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相為甲醇/K，甲醇水的體積比為70:30，柱溫301，流速I(mǎi). OmL/min，進(jìn)樣量為20 u L，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)為7，載氣壓力5bar。本發(fā)明從青蒿中克隆AaWRKYl基因，構(gòu)建含AaWRKYl基因的植物表達(dá)載體，用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將AaWRKYl基因?qū)肭噍锊⒃偕鲋仓?；PCR檢測(cè)外源目的基因AaWRKYl的整合情況，HPLC-ELSD測(cè)定青蒿中青蒿素含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因青蒿株系的青蒿素含量顯著提高，轉(zhuǎn)AaWRKYl基因青蒿中青蒿素的含量最高可達(dá)到干重的24. 59mg/g,是非轉(zhuǎn)化普通青蒿的4. 44倍，為青蒿素的規(guī)?；a(chǎn)提供了高產(chǎn)、穩(wěn)定的新藥源。


圖I為本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因青蒿株中青蒿素的含量檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I
青蒿AaWRKYl基因的克隆I. I青蒿基因組總RNA的提取取100-200mg青蒿幼嫩葉片，用液氮速凍后，迅速用研缽研碎，加入盛有ImLTRlzol (TRlzol Reagents, GIBCOBRL, USA)的 I. 5mL Eppendorf 管中，充分振蕩后，于室溫下放置5min,加200 u L氯仿，用力振蕩15sec,室溫放置2 3min后，于4°C下12, OOOrmp離心15min ;將上清液(約600 u L)吸入干凈的I. 5mL Eppendorf管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，室溫下放置IOmin后，于4°C下12，OOOrmp離心IOmin ;棄上清,加lmL75%乙醇清洗，振蕩后，于4°C下7，500rmp離心5min ;室溫干燥10 15min后溶于適量(30 40 y L)RNAase-free水中；用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。I. 2青蒿AaWRKYl基因的克隆將所獲的青蒿基因組總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈cDNA，根據(jù)所述青蒿AaWRKYl基因的編碼序列(如序列表中的序列I所示)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼框的上下游引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以所述的第一鏈cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序。DNA序列測(cè)定由上海invitrogen公司測(cè)序完成。測(cè)序結(jié)果表明,所克隆的序列(序列表中的序列I)與GenBank中所報(bào)道的青蒿AaWRKYl基因(GenBank的編號(hào)為FJ390842)的編碼序列在552位，576位，663位有三個(gè)無(wú)義點(diǎn)突變，但它們?cè)诎被嵝蛄猩贤耆恢?。本?shí)施例采用基因克隆方法從青蒿中獲得序列正確的調(diào)控青蒿素生物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶ADS的WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子AaWRKYl。實(shí)施例2含AaWRKYl基因的植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建2. I 中間載體 pMD18T_AaWRKYl 的構(gòu)建選用pMD18T_simple載體(Takara, Dalian)為基本元件，構(gòu)建中間載體pMD18T-AaWRKYl。具體地，通過(guò)高保真酶擴(kuò)增AaWRKYl基因前后分別引入KpnI和SacI酶切位點(diǎn)的基因全長(zhǎng)，通過(guò)連接酶連接到PMD18T載體上，由上海invitrogen公司測(cè)序確認(rèn)基因的正確性。2. 2 植物表達(dá)載體 FSN: : p35S-AaffRKYl-N0S 的構(gòu)建以所述的FSN(FSN表達(dá)載體由pCAMBIA2300表達(dá)載體上改造而得)為表達(dá)載體，將實(shí)施例I中AaWRKYl基因連入其對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)位置。具體地，KpnI和SacI雙酶切中間載體pMD18T-AaWRKYl和表達(dá)載體FSN?；厥誂aWRKYl基因片段和FSN載體大片段，連接轉(zhuǎn)化，挑取單克隆，提取質(zhì)粒做PCR檢測(cè)和酶切驗(yàn)證。本實(shí)施例將青蒿WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子AaWRKYl基因可操作性地連接于表達(dá)調(diào)控序列，形成含AaWRKYl基因的植物表達(dá)載體，該表達(dá)載體可用于通過(guò)代謝工程策略來(lái)提高青蒿中青蒿素的含量。實(shí)施例3根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)AaWRKYl基因遺傳轉(zhuǎn)化青蒿獲得轉(zhuǎn)基因青蒿植株3. I含AaWRKYl基因雙元植物表達(dá)載體根癌農(nóng)桿菌工程菌的獲得將實(shí)施例2中含AaWRKYl基因的植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌(如EHA105，為市場(chǎng)有公開(kāi)出售的生物材料，可以從澳大利亞CAMBIA公司購(gòu)得，菌株編號(hào)為Gambarl)，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證。 3. 2根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)AaWRKYl基因轉(zhuǎn)化青蒿( I)外植體的預(yù)培養(yǎng)青蒿種子用75%乙醇浸泡lmin，再用20%NaC10浸泡20min，無(wú)菌水沖洗3 4次，用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分，接種于無(wú)激素的MS(Murashige and Skoog, 1962)固體培養(yǎng)基中，25°C、16h/8h (light/dark)光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無(wú)菌苗。待苗長(zhǎng)至5cm左右后，剪取無(wú)菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。(2)農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)將所述的葉片外植體，轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(l/2MS+AS100iimol/L)中，滴加含活化好的所述含AaWRKYl基因植物雙元表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌工程菌的1/2MS懸液，使外植體與菌液充分接觸，28°C暗培養(yǎng)3天。以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對(duì)照。(3)抗性再生植株的篩選將所述的共培養(yǎng)3天的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基(MS+6-BA 0. 5mg/L+NAA 0. 05mg/L十Kan 50mg/L+Cb 500mg/L)上于 25°C、16h/8h光照培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，經(jīng)過(guò)2-3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽。將生長(zhǎng)良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基(1/2MS+Cb 125mg/L)上培養(yǎng)至生根，從而獲得Kan抗性再生青蒿植株。3. 3轉(zhuǎn)基因青蒿植株的PCR檢測(cè) 根據(jù)目的基因所在表達(dá)盒p35S-AaWRKYl-N0S序列p35S和AaWRKYl分別設(shè)計(jì)正向引物和反向引物對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，利用所設(shè)計(jì)的PCR特異引物，能擴(kuò)增出約1.4kb的特異DNA片段。而以非轉(zhuǎn)化青蒿基因組DNA為模板時(shí)，沒(méi)有擴(kuò)增出任何片段。本實(shí)施例將所述的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含AaffRKYl基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株，利用所構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。轉(zhuǎn)基因青蒿植株的獲得為篩選獲得較高青蒿素含量的青蒿株系提供了直接素材。實(shí)施例4利用HPLC-ELSD測(cè)定轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量4. 1HPLC-ELSD條件及系統(tǒng)適用性以及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制HPLC :采用 water alliance2695 系統(tǒng)，色譜柱為 C-18 反相娃膠柱(SymmetryShield TM C18，5 y m，250 X 4. 6mm，Waters)，流動(dòng)相為甲醇水，甲醇水的體積比為70 30，柱溫30°C，流速I(mǎi). OmL/min,進(jìn)樣量10 u L，靈敏度(AUFS=L 0)，理論塔板數(shù)按青蒿素峰計(jì)算不低于2000。ELSD :采用water alliance2420系統(tǒng)，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)(gain)為7,載氣壓力5bar。精密稱(chēng)取青高素標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma公司)2. Omg用ImL甲醇完全溶解,得到2mg/mL青蒿素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，保存于一 20°C備用。本發(fā)明中流動(dòng)相為甲醇7jC，比例為70% 30%時(shí)，青蒿素的保留時(shí)間為5. lmin,峰型良好。理論塔板數(shù)按青菌素計(jì)算不低于2000。
4. 2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作將所述對(duì)照品溶液在相應(yīng)色譜條件下分別進(jìn)樣2 ii L，4ii L，6 ii L，8 ii L，10 ii L記錄圖譜及色譜參數(shù)，分別以峰面積(Y)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品含量(X，u g)進(jìn)行回歸分析。通過(guò)研究，本發(fā)明中青蒿素在4 20 Ug范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的Iog-Iog線性關(guān)系。青蒿素對(duì)照品的Iog-Iog線性回歸方程為 Y=7. 286836X+2. 033682，R2=O. 997766。4. 3樣品的制備和青蒿素含量的測(cè)定青蒿素的提取過(guò)程基于Van Nieuwerburgh et al. (2006)中報(bào)道的方法取少量新鮮的青蒿葉片(I 2g鮮重)，于50mL試管中將其浸沒(méi)在IOmL氯仿中搖蕩I分鐘，將浸出液倒入新的試管中使氯仿?lián)]發(fā)完全，取3mL無(wú)水乙醇充分溶解提取物，經(jīng)0. 22 過(guò)濾慮頭過(guò)濾后用于HPLC檢測(cè)。同時(shí)，氯仿提取后的葉片收集放入60°C烘箱進(jìn)行烘干，稱(chēng)重(計(jì)算青蒿葉片的干重)。采用HPLC-ELSD測(cè)定青蒿素含量，樣品進(jìn)樣體積為20 U L，根據(jù)峰面積代入線形回歸方程計(jì)算出樣品中的青蒿素含量(mg)，再除以樣品的青蒿葉干重(g)，從而計(jì)算出青蒿植株中青蒿素的含量。在本發(fā)明中轉(zhuǎn)AaWRKYl基因顯著提高青蒿中青蒿素含量。轉(zhuǎn)AaWRKYl基因青蒿中青蒿素的含量最高可達(dá)到干重的24. 59mg/g，是非轉(zhuǎn)化普通青蒿的4. 44倍。本實(shí)施例采用HPLC-ELSD法測(cè)定了轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量，采用轉(zhuǎn)化AaWRKYl基因的代謝工程策略獲得了青蒿素高產(chǎn)的青蒿植株，為規(guī)?；a(chǎn)青蒿素提供了一種理想方法。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，包括如下步驟 步驟一，采用基因克隆方法獲得青蒿WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子AaWRKYl基因； 步驟二，把所述AaWRKYl基因連結(jié)于表達(dá)調(diào)控序列，構(gòu)建含AaWRKYl基因的植物表達(dá)載體； 步驟三，將所述含AaWRKYl基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化青蒿的含所述AaWRKYl基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌菌株； 步驟四，利用所述構(gòu)建的根癌農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化青蒿，獲得經(jīng)PCR檢測(cè)的整合外源目的基因AaWRKYl基因的轉(zhuǎn)基因青蒿植株； 步驟五，對(duì)所述轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素含量進(jìn)行HPLC-ELSD測(cè)定，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，在所述步驟四中，所述轉(zhuǎn)化包括以下步驟外植體的預(yù)培養(yǎng)；農(nóng)桿菌與外植體的共培養(yǎng)；抗性再生植株的篩選。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述預(yù)培養(yǎng)包括以下步驟青蒿種子用體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇浸泡lmin，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%NaC10浸泡20min,無(wú)菌水沖洗3 4次,用無(wú)菌吸水紙吸干表面水分,接種于無(wú)激素的MS固體培養(yǎng)基中，25°C光照培養(yǎng)，即可獲得青蒿無(wú)菌苗，待苗長(zhǎng)至5cm后，剪取無(wú)菌苗葉片外植體用于轉(zhuǎn)化。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述共培養(yǎng)包括以下步驟將所述葉片外植體轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，滴加含活化的所述含AaffRKYl基因植物表達(dá)載體的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS懸液，使所述外植體與所述懸液充分接觸，28°C暗培養(yǎng)3天，以滴加在不帶有目的基因的根癌農(nóng)桿菌的1/2MS液體培養(yǎng)基懸液的葉片外植體為對(duì)照。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，所述篩選包括以下步驟將所述共培養(yǎng)3天的青蒿外植體轉(zhuǎn)入到發(fā)芽篩選培養(yǎng)基上于25°C光照培養(yǎng)，每?jī)芍芾^代培養(yǎng)一次，經(jīng)過(guò)2 3次繼代后即可獲得Kan抗性叢生芽，將所述生長(zhǎng)良好的抗性叢生芽剪下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)至生根，即可獲得Kan抗性再生青蒿植株。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征在于，在所述步驟四中，所述PCR檢測(cè)包括以下步驟設(shè)計(jì)合成AaWRKYl基因的引物；進(jìn)行DNA擴(kuò)增；紫外線下觀察到目的條帶的陽(yáng)性株系即為轉(zhuǎn)基因青蒿植株。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的轉(zhuǎn)AaWRKYl基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，其特征是，在所述步驟五中，所述HPLC-ELSD測(cè)定包括以下條件色譜柱C-18反相硅膠柱，流動(dòng)相為甲醇水，甲醇水的體積比為70:30，柱溫301，流速I(mǎi). OmL/min，進(jìn)樣量為20 y L，蒸發(fā)光散射檢測(cè)器漂移管溫度40°C，放大系數(shù)為7，載氣壓力5bar。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種轉(zhuǎn)AaWRKY1基因提高青蒿中青蒿素含量的方法，包括以下步驟從青蒿中克隆青蒿中WRKY類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子AaWRKY1基因；構(gòu)建含AaWRKY1基因的植物表達(dá)載體；用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，將AaWRKY1基因轉(zhuǎn)入青蒿并再生出植株；PCR檢測(cè)外源目的基因AaWRKY1的整合情況；高效液相色譜法及蒸發(fā)光散射檢測(cè)器測(cè)定轉(zhuǎn)基因青蒿中青蒿素的含量，篩選獲得青蒿素含量提高的轉(zhuǎn)基因青蒿植株。本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)AaWRKY1基因青蒿中青蒿素的含量達(dá)到24.59mg/g DW，其含量是非轉(zhuǎn)化青蒿含量的4.44倍，從而提供了一種提高青蒿中青蒿素含量的方法，為青蒿素的規(guī)?；a(chǎn)提供了高產(chǎn)、穩(wěn)定的新藥源。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102776225SQ201210249469
公開(kāi)日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月18日
發(fā)明者唐克軒, 江偉民, 王國(guó)豐, 邱波, 陸續(xù) 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)