專利名稱：青蒿中青蒿素含量快速檢測技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及青蒿素快速檢測技術(shù)。具體講涉及通過索氏提取法快速從青蒿中提取青蒿素，并用高效液相色譜技術(shù)(HPLC)對青蒿素含量進(jìn)行快速檢測的技術(shù)。涉及化學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
青蒿素是利用我國特有的植物資源青蒿研制成功的一種全新的抗瘧有效單體。由于其結(jié)構(gòu)獨(dú)特，抗瘧機(jī)理特別，對抗氯喹的惡性瘧和腦性瘧有特效，且有高效低毒的特點(diǎn)，而被WHO稱為“世界上目前唯一有效的痕疾治療藥物”。青蒿素是一種白色針狀晶體，分子式為C15H22O515 1976年通過化學(xué)反應(yīng)、光譜數(shù)據(jù)和X射線單晶衍射方法證明其為一種含有過氧基的新型倍半萜內(nèi)酯。由于其具有特殊的過氧基團(tuán)，它對熱不穩(wěn)定，易受濕、熱和還原物質(zhì)的影響而分解。青蒿素是種具有過氧鍵和內(nèi)酯環(huán)的倍半萜內(nèi)酯，由于其不具有共扼結(jié)構(gòu)，且化學(xué)性質(zhì)不活潑，給定量測定帶來一定困難。但自從青蒿素發(fā)現(xiàn)以來，經(jīng)過科研工作者的不懈努力，已經(jīng)發(fā)展出了一系列基于青蒿素各項(xiàng)物理化學(xué)性質(zhì)的分析測定方法。但檢測方法要與一定的分離提取方法相聯(lián)系，才能有效地應(yīng)用在研究、生產(chǎn)工作中。由傳統(tǒng)的薄層色譜法、紫外分光光度法以及柱前衍生化-HPLC檢測法向直接HPLC法檢測過渡勢在必行。青蒿素有多個(gè)手性碳原子，使得合成步驟非常復(fù)雜，產(chǎn)率低、成本高，很難應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。所以目前藥用青蒿素主要從青蒿植株中提取。因此，準(zhǔn)確定量測定青蒿素含量，對于青蒿品種選育、青蒿素生產(chǎn)以及藥理藥效研究都有重要的意義。不同栽培條件和地理環(huán)境青蒿素含量差別很大，青蒿素生產(chǎn)企業(yè)收購農(nóng)戶青蒿時(shí)，需測定青蒿素含量，才能確定收購價(jià)格。青蒿干葉中提取青蒿素一般提取時(shí)間較長，需24h以上，檢測方法也不成熟。由于收購時(shí)間比較集中，農(nóng)戶送來青蒿需等2-3周才能得到檢測結(jié)果，在生產(chǎn)上極為不便，限制了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，本發(fā)明研究的青蒿素含量快速檢測技術(shù)在青蒿素產(chǎn)業(yè)化開發(fā)中也具有重要價(jià)值和應(yīng)用意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是建立青蒿素高效液相色譜(HPLC)快速檢測技術(shù)。本發(fā)明的內(nèi)容包括以青蒿為原料，通過索氏提取法快速提取青蒿素，確定高效液相色譜技術(shù)的色譜條件，建立青蒿素快速檢測技術(shù)體系。本發(fā)明建立的青蒿素快速檢測技術(shù)體系，檢測時(shí)間短(Ih)，結(jié)果可靠，是適于青蒿素生產(chǎn)企業(yè)檢測原料中青蒿素含量的成熟技術(shù)。(I)從青蒿中提取青蒿素的索氏提取條件為:95%乙醇于65°C _85°C水浴，索氏提取提取時(shí)間為 0.1-0.3h，0.3-0.5h，0.5_lh，l_2h，2_4h，4_8h。(2)HPLC 檢測色譜條件為:色譜柱:Agilent Eclipse XDB C8 柱(5 μ m,
4.6X 150mm);流動相為以下配方選基一:乙睛:醋酸緩沖液=25: 75;乙睛:醋酸緩沖液=30: 70 ;乙睛:醋酸緩沖液=35: 65 ;溫度:25-35°C ;流速:l-2mL/min ;波長:220nm。本發(fā)明解決技術(shù)問題的方案分以下四個(gè)步驟完成:(I)青蒿中青蒿素索氏提取:稱取IOOg青蒿鮮樣，研碎，將樣品裝入濾紙?zhí)淄仓?，把套筒小心地插入索氏提取器中，?00mL95%乙醇加入600mL平底燒瓶中，加入幾粒沸石。水浴加熱 65°C _85°C，連續(xù)提取 0.l_24h，分別在 0.1-0.3h,0.3-0.5h,0.5-lh, l-2h,2-4h，4-8h，收集提取液，并以鹽酸中和。(2)樣品提純:提取液加熱至70°C后經(jīng)2% (w/v)活性炭脫色，攪拌30min，靜置后以3000r/min離心IOmin后收集上清液,再用1/5體積的10%三氯乙酸除蛋白，以3000r/min離心去除變性蛋白，上清液真空蒸發(fā)濃縮。濃縮后的殘?jiān)?00mL70%乙醇沉淀，3000r/min離心后取上清液真空濃縮至30mL。(3)HPLC檢測:樣品處理方法:1 %醋酸水溶液99mL，加入Iml濃縮液，攪拌混勻后，取不同提取時(shí)間的提取液20yL做HPLC分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線為:以峰面積(Y)與對照標(biāo)準(zhǔn)品濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為I = 2395.3x-l.3591，R = 0.987，根據(jù)回歸方程
計(jì)算出青蒿素濃度。(4)取不同來源的青蒿干葉樣品6份，重復(fù)5次，用(1)，(2)步驟方法提取后，用
(3)步驟計(jì)算出提取0.1-0.3h ；0.3-0.5h ；l-2h ;4_8h后青蒿素含量。
具體實(shí)施例方式在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1取廣西仙草堂制藥有限責(zé)任公司基地種植的青蒿，稱取IOOg青蒿葉干樣，研碎，將樣品裝入濾紙?zhí)淄仓?，把套筒小心地插入索氏提取器中，?00mL70%乙醇加入600mL平底燒瓶中，加入幾粒沸石。水浴加熱，分別在提取0.1h, 0.3h，0.5h,lh,4h,8h, 24h收集提取液，重復(fù)3次。提取液以鹽酸中和后加熱至70°C后經(jīng)2% (w/v)活性炭脫色，攪拌30min，靜置后以3000r/min離心IOmin后收集上清液，再用1/5體積的10%三氯乙酸除蛋白，以3000r/min離心去除變性蛋白，上清液真空蒸發(fā)濃縮。濃縮后的殘?jiān)?00mL55%乙醇沉淀，3000r/min離心后取上清液真空濃縮至30mL。濃縮樣品采用以下方式處理:1%醋酸水溶液99mL，加入ImL提取液，攪拌混勻后，做HPLC分析。精密量取20ul注入液相色譜儀，記錄色譜圖；色譜條件為:色譜柱:Agilent Eclipse XDB C8柱(5 μ m, 4.6X 150mm);流動相為乙睛:醋酸緩沖液=25: 75 ;溫度:25°C ;流速:lmL/min ;波長:260nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線:以峰面積(Y)與對照品濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為I = 2395.3x-l.3591，R =0.987。根據(jù)公式計(jì)算出不同提取時(shí)間青蒿素含量占干重的比例為:提取0.1h,占0.193%；提取 0.3h,占 0.389% ;提取 0.5h,占 0.525% ;提取 Ih,占 0.633% ;提取 4h 占 0.712%，提取8h占0.792% ;提取24h占0.804%。提取0.5h后與充分提取(24h)的比值為0.653。取從重慶市酉陽農(nóng)戶青蒿種植地收集的青蒿干葉5份，湖南永州農(nóng)戶收集的青蒿干葉5份，分別提取取0.5h后，提取液提純后用HPLC檢測。通過計(jì)算得到5份樣品提取
0.5h后青蒿素含量占干重的比例分別為:0.490%,0.527%,0.387%,0.401%,0.392%,
0.486%不同來源青蒿中青蒿素含量差異極顯著。不同來源青蒿干葉中青蒿素含量提取0.5h后與充分提取(24h)的比值分別為0.660，0.642，0.655，0.661，0.634，0.654，差異不顯著，其平均值0.651，可用來作為青蒿素充分提取時(shí)含量推算。實(shí)施例2索氏提取過程按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于HPLC分析色譜條件為:色譜條件為:色譜柱=Agilent Eclipse XDB C8柱(5 μ m,4.6X 150mm);流動相為乙睛:醋酸緩沖液=30: 70 ;溫度:30°C;流速:1.5mL/min ;波長:260nm。不同來源青蒿干葉提取0.5h后青蒿素含量與充分提取的比值，差異不顯著，平均值為0.652。
權(quán)利要求
1.青蒿素含量快速檢測技術(shù)，該技術(shù)包括(I)青蒿素索氏快速提取和純化；(2)高效液相(HPLC)檢測。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于以青蒿干葉為原料采用索氏提取法提取青蒿素，提取條件為:95%乙醇水浴65°C _85°C，提取時(shí)間為0.5_lh，根據(jù)其含量與充分提取24h后含量的比值0.652,推算出青蒿干葉的青蒿素含量。
3.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于高效液相(HPLC)檢測的色譜條件為:色譜柱:Agilent Eclipse XDB C8柱(5 μ m, 4.6X 150mm);流動相為以下配方選其一:乙睛:醋酸緩沖液=25: 75 ;乙睛:醋酸緩沖液=30: 70 ;乙睛:醋酸緩沖液=35: 65 ;溫度:25-350C ;流速:l-2mL/min ;波長:220nm。
全文摘要
本發(fā)明提出一種青蒿素含量快速檢測技術(shù)。該技術(shù)是以青蒿干葉為原料，通過索氏提取法快速提取青蒿素，確定高效液相色譜技術(shù)的色譜條件，計(jì)算出提取0.5-1h青蒿素含量與充分提取后青蒿素含量比值，確定青蒿素快速檢測技術(shù)。提取條件為95％乙醇水浴65℃-85℃，提取時(shí)間為0.5-1h。提取液用活性炭脫色和三氯乙酸除蛋白后，用70％乙醇沉淀，取上清液，進(jìn)行HPLC檢測，色譜條件為色譜柱Agilent Eclipse XDB C8柱(5μm，4.6×150mm)；流動相為以下配方選基一乙睛∶醋酸緩沖液＝23∶77；乙睛∶醋酸緩沖液＝30∶70；乙睛∶醋酸緩沖液＝25∶75；溫度25-35℃；流速1-2mL/min；波長220nm。
文檔編號G01N30/02GK103197010SQ20131012529
公開日2013年7月10日 申請日期2013年4月12日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月12日
發(fā)明者張梅 申請人:張梅