專利名稱：一種利用重組基因工程菌獲得鏈霉菌胰蛋白酶酶原的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用重組基因工程菌獲得鏈霉菌胰蛋白酶酶原的方法與應用，特別是一種高產(chǎn)胰蛋白酶酶原的基因工程菌及構(gòu)建方法與應用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鏈霉菌胰蛋白酶(SGT) (E. C. 3. 4. 21. 4)是一種來源于灰色鏈霉菌的堿性絲氨酸蛋白酶，其在氨基酸編碼基因結(jié)構(gòu)上屬于pre-pro-protease類型,而通過對灰色鏈霉菌的基因組測序發(fā)現(xiàn)編碼SGT的基因SprT中，除去SGT自身信號肽和鏈霉菌活性胰蛋白酶，在其成熟酶N端還具有一段前導肽(-Ala-Pr0-Asn-Pr0-)(圖I);通過前人對鏈霉菌胰蛋白酶在灰色鏈霉菌中的分泌，純化，氨基酸測序以及相關(guān)生理生化功能的研究，發(fā)現(xiàn)在鏈霉菌氣生菌絲和營養(yǎng)菌絲分化時，鏈霉菌胞外開始出現(xiàn)活性胰蛋白酶，純化和氨基酸測序也僅 能獲得活性的胰蛋白酶的信息，而帶有前導肽的鏈霉菌胰蛋白酶酶原的活化和活化機理卻未有見到報道，并且對于鏈霉菌胰蛋白酶酶原的獲得也未有報道，因此建立獲得在N端具有野生前導肽的胰蛋白酶酶原的方法，對于鏈霉菌胰蛋白酶酶原晶體結(jié)構(gòu)的研究，以及其激活機理的研究具有至關(guān)重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)胰蛋白酶酶原(trypsinogen)的基因工程菌，其特征在于染色體上攜帶有胰蛋白酶酶原(trypsinogen)基因(pmt)。所述胰蛋白酶酶原(trypsinogen)的基因序列為SEQ ID N0:1。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種胰蛋白酶酶原基因工程菌的構(gòu)建方法。為解決上述技術(shù)問題，所采用的技術(shù)方案包括如下具體步驟，見圖I :第一步鏈霉菌胰蛋白酶酶原基因的獲得及分析首先，合成灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)胰蛋白酶基因其次，畢赤酵母(Pichia pastoris)的表達系統(tǒng)有著特殊的密碼子偏好性,如果不對類胰蛋白酶基因要表達的密碼子的進行一定的分析，畢赤酵母(Pichia pastoris)可能無法正確翻譯類胰蛋白酶基因。通過胰蛋白酶酶原基因在畢赤酵母中進行表達的密碼子適用指數(shù)(CAI)分析，發(fā)現(xiàn)在胰蛋白酶酶原基因中并無畢赤酵母無法識別及利用的稀有密碼子，其次，在類胰蛋白酶基因上下游分別加入EcoRI限制性內(nèi)切酶位點和NotI限制性內(nèi)切酶位點，進行體外擴增類胰蛋白酶基因，所得基因其核苷酸序列為SEQ ID NO: I ;第二步鏈霉菌胰蛋白酶酶原重組質(zhì)粒的構(gòu)建為了使pmt基因能在酵母中的可控高效表達，選用帶有醇氧化酶基因(AOX)的啟動子AOXI的畢赤酵母表達載體(例如pPIC9K，美國Invitrogen公司)，利用pmt基因序列5'端的EcoR I限制性內(nèi)切酶位點與3'端的Not I限制性內(nèi)切酶位點，將pmt基因克隆入載體PPIC9K。由于在AOXI強啟動子后面有一段α-因子信號肽序列，這也為類胰蛋白酶在酵母中的正確分泌表達奠定了基礎；另外，由于PPIC9K載體中含有卡那霉素、氨芐青霉素抗性基因，在篩選重組菌時較為方便。將含有pmt基因的載體與要連接的表達載體PPIC9K進行EcoRI和NotI酶切，連接得到含有pmt基因的重組質(zhì)粒pPIC9K-pmt。第三步鏈霉菌胰蛋白酶酶原基因工程菌的構(gòu)建將重組質(zhì)粒pPIC9K_pmt電擊轉(zhuǎn)化宿主畢赤酵母GS115，構(gòu)建高效表達胰蛋白酶酶原的組成型畢赤酵母重組菌株。本步驟采用的含胰蛋白酶酶原基因的重組表達質(zhì)粒pPIC9K_pmt可轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichia pastoris),成為能分泌表達外源類胰蛋白酶的功能酵母菌由于含外源基因的重組表達質(zhì)粒pPIC9K-pmt上有畢赤酵母AOX基因的部分序列，當重組表達質(zhì)粒進入酵母細胞后，通過體內(nèi)同源重組，pPIC9K-pmt可以定向整合到畢赤酵母染色體DNA上。在外源誘導 物甲醇存在的情況下，AOXI啟動子啟動外源pmt基因，信號肽指導表達產(chǎn)物進入畢赤酵母的分泌途徑，正確切割成具有生物活性的外源蛋白表達產(chǎn)物，最終將產(chǎn)物分泌至胞外。畢赤酵母的轉(zhuǎn)化常采用電激法或化學轉(zhuǎn)化法首先接種活化后的畢赤酵母GS115 —環(huán)于25mLYPD液體培養(yǎng)基中，28°C 30°C振蕩培養(yǎng)過夜，然后將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入IOOmLYPD (500mL三角瓶)液體培養(yǎng)基中，28°C 30°C振蕩培養(yǎng)，每隔Ih測定，培養(yǎng)直至菌體濃度0D600為I. 3 I. 5，在冰水中冷卻IOmin以上，然后在4°C環(huán)境下，8000r/min離心收集菌體，用40mL預冷的無菌水懸浮細胞，在冷水中放置lOmin，如此重復步驟4三次，即無菌水洗滌3次，用300 μ L預冷lmol/L山梨醇懸浮細胞,從而獲得受體菌。然后取50 80 μ L受體菌和5 90 μ g線性化重組表達質(zhì)粒DNA混勻，電擊(電壓1500V :電容25 μ F ;電阻200 Ω )處理，然后涂布于卡那霉素(10 μ g/mL)抗性平板篩選重組子。本發(fā)明要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種胰蛋白酶酶原基因工程菌的應用方法。為解決上述技術(shù)問題，提供如下技術(shù)方案第一步重組菌株的篩選所述重組表達質(zhì)粒pPIC9K_pmt上含有卡那霉素抗性基因，如果重組質(zhì)粒已經(jīng)整合到染色體上，重組菌株具有卡那霉素抗性，可在含有卡那霉素的平板上生長；涂布含卡那霉素G418抗性平板，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，對轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證，陽性即為產(chǎn)胰蛋白酶酶原基因工程菌。第二步菌株經(jīng)培養(yǎng)分泌胰蛋白酶酶原培養(yǎng)基組成(g/L):種子培養(yǎng)基蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化鈉5_15 ；發(fā)酵培養(yǎng)基酵母氮源基礎培養(yǎng)基12 15，生物素O. 0002 O. 0005,甲醇10 50 ;微量元素溶液，MnSO4 · 4H20100, ZnCl270, Na2MoO4 · 2H2035, H3B0360, CoCl2 · 6H20200,CuSO4 · 5H2029, NiCl2 · 6H2025, 37% 鹽酸 0. 9mL。優(yōu)選培養(yǎng)基組成(g/L ):種子培養(yǎng)基蛋白胨15g/L,酵母提取物8g/L,葡萄糖15g/L,氯化鈉10g/L ；發(fā)酵培養(yǎng)基酵母氮源基礎培養(yǎng)基12 15g/L，生物素O. 0002 O. 0005g/L,甲醇10 50g/L ;微量元素溶液，MnSO4 · 4H20100g/L, ZnCl270g/L, Na2MoO4 · 2H2035g/L, H3B0360g/L, CoCl2 · 6H20200g/L, CuSO4 · 5H2029g/L, NiCl2 · 6H2025g/L, 37% 鹽酸 0. 9mL。培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)接種一環(huán)轉(zhuǎn)化子入250mL三角瓶，裝液量50mL，培養(yǎng)溫度28°C 30°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)24h ；發(fā)酵培養(yǎng)離心，收集種子，用無菌生理鹽水洗滌兩次，按10%的接種量接入裝液量為50mL的三角瓶(500mL)中，發(fā)酵溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時間3 4天。胰蛋白酶酶原檢測方法將誘導獲得的胞外上清進行SDS-PAGE檢測，并同空白宿主菌作對比，按照理論分 子量估算鏈霉菌胰蛋白酶酶原分子量約為25kDa左右(圖3)，同空白對照相比在相應蛋白條帶處出現(xiàn)的條帶即表明鏈霉菌胰蛋白酶酶原的表達。有益效果本發(fā)明的優(yōu)點在于構(gòu)建了一株高效分泌表達胰蛋白酶酶原的畢赤酵母基因工程菌，解決了胰蛋白酶酶原無法從野生灰色鏈霉菌中獲得的問題；應用該菌種生產(chǎn)類胰蛋白酶酶原，產(chǎn)量高、工藝簡單、便于工業(yè)化應用，該菌株生產(chǎn)的目的蛋白直接分泌到胞外，提取過程簡單，產(chǎn)品純度高。本發(fā)明為生物法產(chǎn)蛋白酶酶原的研究、開發(fā)、生產(chǎn)工作奠定了基礎，特別有利于早日實現(xiàn)野生胰蛋白酶酶原晶體結(jié)構(gòu)研究的基礎問題。


圖I鏈霉囷膜蛋白酶如體組成結(jié)構(gòu)不意2產(chǎn)胰蛋白酶酶原的基因工程菌整合質(zhì)粒的構(gòu)建圖3鏈霉菌胰蛋白酶酶原的表達檢測
具體實施例方式實施例I :胰蛋白酶酶原基因的獲得胰蛋白酶酶原(Trypsinogen)的基因來源于灰色鏈霉菌(Streptomyces griseus)中含胰蛋白酶酶原基因的編碼序列(GenBank Accession No. M64471 )，其中第628位到第1307位是編碼pmt的基因。在對基因進行密碼子偏好性等分析后，在其5'端及3'端分別加上EcoRI和NotI酶切位點，SprT基因其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1，采用化學法進行全合成。實施例2 :含胰蛋白酶酶原基因(pmt)重組質(zhì)粒pPIC9K_pmt的構(gòu)建pmt基因體外擴增片段的和表達載體pPIC9K分別進行NotI和EcoRI雙酶切，回收后用T4連接酶進行連接。連接反應體系為(IOyL):目的基因片斷2 μ L，載體DNA2 μ L，10 X Τ4 連接酶 Bufferl μ L, T4DNA 連接酶 I μ L, ddH204 μ L。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法如下(I)無菌狀態(tài)下取感受態(tài)細胞200 μ L置于無菌的微量離心管中；(2)每管加入I 2 μ L重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30min ；(3)42°C熱休克90sec (準確)，不要搖動離心管；(4)快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，使細胞冷卻I 2min ；(5)每管加入無抗生素的普通LB培養(yǎng)液800 μ L ;
(6)用無菌鋪菌器將200 μ L菌液鋪于含氨芐青霉素的瓊脂平板,37°C平放20min直至液體被吸收，然后倒置培養(yǎng)過夜，觀察。挑選陽性轉(zhuǎn)化子，測序驗證，結(jié)果表明連接成功。實施例3 :胰蛋白酶酶原基因工程菌的構(gòu)建將表達載體pPIC9K_pmt用SalI酶切線形化。酶切體系(50 μ L體系)重組質(zhì)粒10 μ L, Buffer5 μ L, SalI3y L, ddH2032 y L0 37°C水浴 3h，用 PCR 產(chǎn)物純化試劑盒對線形化產(chǎn)物進行純化回收，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15，具體方法如下(I)接種活化后的畢赤酵母GS115 —環(huán)于25mLYPD液體培養(yǎng)基中，28°C 30°C振蕩培養(yǎng)過夜；
(2)將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入IOOmLYPD (500mL三角瓶)液體培養(yǎng)基中，28°C 30°C振蕩培養(yǎng)，每隔Ih測定，培養(yǎng)直至菌體濃度0D_為I. 3 I. 5 ;(3)在冰水中冷卻IOmin以上；(4) 40C，8000r/min離心收集菌體，用40mL預冷的無菌水懸浮細胞，在冷水中放置IOmin ；(5)重復步驟4三次，即無菌水洗滌3次；(6)用300 μ L預冷lmol/L山梨醇懸浮細胞；(7)加入10 μ L線形化質(zhì)粒，在冰水中混勻5min ；(8)放入冰預冷的無菌電轉(zhuǎn)化杯(O. 2cm)中，在1500V，電擊I 2次；(9)加入ImL預冷的lmol/L的山梨醇溶液；(10)取上述100 200 μ L涂布YNB平板(或離心涂布100 μ L)；(11)28°C 30°C倒置培養(yǎng)I 2天，挑選白色菌落。實施例4 :重組菌株的篩選I、酵母重組子的G418篩選接種轉(zhuǎn)化子于25mLYPD液體培養(yǎng)基中，28°C 30°C振蕩培養(yǎng)過夜，離心收集菌體，無菌水懸浮，取100 μ L分別涂布于含G418終濃度為O. 5、I. 0、2mg/mL的YPD平板培養(yǎng)基上，篩選轉(zhuǎn)化子。2、雙酶切驗證提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進行EcoRI和Nco I雙酶切，對產(chǎn)物進行電泳驗證。3、類胰蛋白酶酶活性測定(I)重組子和空載體pPIC9K轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GSl 15分別接種于20mLYPD液體培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)過夜(穩(wěn)定期)；(2)離心收集菌體，生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)入IOOmLMGY培養(yǎng)基(加入ImLlOO X生物素)中；30°C，200r/min 振蕩培養(yǎng) 48h ；(3)離心收集菌體，生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)入30mL麗液體培養(yǎng)基(加入300 μ L甲醇，300 μ L100X生物素)中；30°C，200r/min振蕩培養(yǎng)7天；定時進行酶活測定。胰蛋白酶酶原表達檢測方法將誘導獲得的胞外上清進行SDS-PAGE檢測，并同空白宿主菌作對比，按照理論分子量估算鏈霉菌胰蛋白酶酶原分子量約為25kDa左右，同空白對照相比在相應蛋白條帶處出現(xiàn)的條帶即表明鏈霉菌胰蛋白酶酶原的表達
實施例5 :重組菌株的培養(yǎng)種子培養(yǎng)基蛋白胨15g/L,酵母提取物8g/L,葡萄糖15g/L,氯化鈉10g/L ；發(fā)酵培養(yǎng)基酵母氮源基礎培養(yǎng)基12 15g/L，生物素O. 0002 O. 0005g/L,甲醇10 50g/L ;微量元素溶液，MnSO4 · 4H20100g/L, ZnCl270g/L, Na2MoO4 · 2H2035g/L, H3B0360g/L, CoCl2 · 6H20200g/L, CuSO4 · 5H2029g/L, NiCl2 · 6H2025g/L, 37% 鹽酸 0. 9mL。培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)接種一環(huán)轉(zhuǎn)化子入250mL三角瓶，裝液量50mL，培養(yǎng)溫度28°C 30°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)24h ；發(fā)酵培養(yǎng)離心，收集種子，用無菌生理鹽水洗滌兩次，按10%的接種量接入裝液 量為50mL的三角瓶(500mL)中，發(fā)酵溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，3 4天后，檢測發(fā)酵液中胞外總蛋白含量從原來的140 μ g/mL，提高到表達胰蛋白酶酶原時的211 μ g/mL，總蛋白含量提高到原來的I. 5倍；經(jīng)相同的純化方法得到的胰蛋白酶酶原蛋白含量為28 μ g/mL，與表達成熟胰蛋白酶時純化得到的胰蛋白酶時的15 μ g/mL相比，提高到原來的1.86倍。同直接表達成熟鏈霉菌胰蛋白酶相比，表達酶原可以降低胰蛋白酶對細胞的毒性，增加重組蛋白的產(chǎn)量，這為后續(xù)的胰蛋白酶酶原相關(guān)的基礎研究奠定了基礎雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。
權(quán)利要求
1.ー種利用重組基因工程菌獲得鏈霉菌胰蛋白酶酶原的方法，其特征在于以重組基因工程菌畢赤酵母GSl 15為種子，活化后按10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中中，控制發(fā)酵溫度300C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵3_4天，所述重組基因工程菌染色體上攜帶有胰蛋白酶酶原的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述胰蛋白酶酶原的基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO: I 所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述基因工程菌的構(gòu)建方法包括如下步驟 第一歩化學全合成鏈霉菌屬胰蛋白酶酶原基因； 第二歩將第一歩得到的類胰蛋白酶酶原基因片段與畢赤酵母常用表達載體PPIC9K雙酶切、連接，得到含有胰蛋白酶酶原基因的重組質(zhì)粒； 第三步將重組質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化宿主畢赤酵母GSl 15，構(gòu)建高效表達胰蛋白酶酶原的組成型畢赤酵母重組菌株。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用重組基因工程菌獲得鏈霉菌胰蛋白酶酶原的方法，本發(fā)明通過化學全合成胰蛋白酶酶原基因連接到畢赤酵母GS115(Pichia pastoris)染色體上，構(gòu)建了一株高效分泌表達胰蛋白酶酶原的基因工程菌，發(fā)酵3～4天后，可得到鏈霉菌胰蛋白酶酶原的表達，解決了長期無法從野生灰色鏈霉菌中獲得胰蛋白酶酶原的問題。應用該菌種生產(chǎn)胰蛋白酶酶原，產(chǎn)量高、工藝簡單、便于基礎中進行鏈霉菌晶體結(jié)構(gòu)研究及其激活機理研究之用。
文檔編號C12R1/84GK102851269SQ201210274589
公開日2013年1月2日 申請日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者陳堅, 令楨明, 堵國成, 康振, 李江華 申請人:江南大學