專利名稱：一種檢測(cè)番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測(cè)番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒試劑盒及方法。
背景技術(shù)：
番爺黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)是引起番爺生產(chǎn)上一種毀滅性病害“番茄黃化曲葉病毒病”的重要毒源，已給我國(guó)的番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。生產(chǎn)中，帶毒番茄幼苗不僅造成絕產(chǎn)，而且是造成病害快速傳播擴(kuò)散的重要源頭，使用無毒番茄幼苗和及時(shí)快速地對(duì)番茄幼苗進(jìn)行檢測(cè)是綜合控制該病害的關(guān)鍵措施，但番茄幼苗被病毒侵染后到表現(xiàn)癥狀有14-30天的潛伏期，這個(gè)特點(diǎn)給病害的診斷和控制造成困難和問題，在番茄幼苗移栽過程中不能分辨健康苗和帶毒苗，容易造成帶毒苗進(jìn)入生產(chǎn) 溫室和大棚，使得后續(xù)病害大范圍快速擴(kuò)散。為此，必須發(fā)明一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的檢測(cè)方法用于番茄幼苗移栽前是否攜帶TYLCV的檢測(cè)。目前檢測(cè)TYLCV常見的有2種方法，一是分子生物學(xué)檢測(cè)方法，主要是利用PCR方法，但PCR檢測(cè)耗時(shí)，產(chǎn)物不便檢測(cè)，操作繁瑣，反應(yīng)需要PCR儀和特殊試劑，不適于生產(chǎn)一線使用。二是血清學(xué)檢測(cè)方法，主要是ELISA方法，但ELISA的檢測(cè)靈敏度上以及特異性不高，不適于快速準(zhǔn)確檢測(cè)。現(xiàn)有技術(shù)的不足主要有一是使用的引物不適于我國(guó)發(fā)生的TYLCV的檢測(cè)，致使檢測(cè)效率低，假陰性率高；二是沒有適用番茄幼苗檢測(cè)的方法；三是沒有明確提出取樣部位和取樣方法；四是需制備DNA，過程比較復(fù)雜，不易推廣應(yīng)用。近幾年逐漸發(fā)展起來的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop mediated isothermal amplification, LAMP)以快速高效、簡(jiǎn)便易行、靈敏特異等優(yōu)勢(shì)正在被用于病原微生物的檢測(cè)工作中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組。本發(fā)明提供的引物組，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ；所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。上述引物組由引物I、引物2、引物3和引物4組成，所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4的摩爾比具體為I :1 8 :8。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑。本發(fā)明提供的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，包括上述的引物組、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、dNTPs、硫酸鎂、甜菜堿和水。上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑還包括DNA聚合酶，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑由上述的引物組、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、dNTPs、硫酸鎂、DNA聚合酶、甜菜堿和水組成；所述引物I和所述引物2在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度均具體為0. 2 u mol/L,所述引物3和所述引物4在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度均具體為L(zhǎng) 6 y mol/L。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒。本發(fā)明提供的試劑盒，包括上述的引物組或上述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑。上述的引物組、上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑或上述試劑盒在制備檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒產(chǎn)品或在檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種制備對(duì)待測(cè)番茄幼苗進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的模板的方法。
本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用普通牙簽或?qū)嶒?yàn)室用普通微量液體吸頭穿刺待檢番茄葉片或葉柄，然后將牙簽或吸頭直接在環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系中輕輕攪拌即完成樣品制備。該取樣方法為直接用牙簽或吸頭，其具有簡(jiǎn)潔、快速、極低成本的特點(diǎn)。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟用上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑對(duì)待測(cè)番茄幼苗進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，確定待測(cè)番茄幼苗中是否攜帶番爺黃化曲葉病毒。上述方法中，所述檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的方法為如下I)或2):I)將所述環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入染色劑反應(yīng)，得到染色后反應(yīng)產(chǎn)物；若染色后反應(yīng)產(chǎn)物的顏色為綠色，則待測(cè)番茄幼苗攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若染色后反應(yīng)產(chǎn)物的顏色為橙色，則待測(cè)番茄幼苗不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒；2)將所述環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若反應(yīng)產(chǎn)物呈典型的連續(xù)梯狀條帶，則說明待測(cè)番茄幼苗攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若反應(yīng)產(chǎn)物無典型的連續(xù)梯狀條帶，則說明待測(cè)番茄幼苗不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒。上述染色劑為SYBR Green I，加入染色劑反應(yīng)時(shí)間為5min。上述方法中，用上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑對(duì)待測(cè)番茄幼苗進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的方法包括如下步驟I)用尖端物直接穿刺待測(cè)番茄幼苗組織；2)將經(jīng)步驟I)處理后所述尖端物的用于刺穿待測(cè)番茄幼苗組織的一端放入上述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中攪拌，去除所述尖端物，得到反應(yīng)液；3)向步驟2)得到的反應(yīng)液中添加DNA聚合酶，使其在所述反應(yīng)液中的終濃度為0. 32U/ u L ;反應(yīng)，得到環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物。上述步驟I)中的尖端物為牙簽或吸頭。上述方法中，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的溫度為63°C _65°C，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間為45分鐘-60分鐘。上述方法中，所述待測(cè)番茄苗組織為葉片或葉柄；所述葉片具體為所述待測(cè)番茄幼苗頂端數(shù)第2片葉片；所述葉柄具體為所述待測(cè)番茄幼苗頂端數(shù)第2片葉的葉柄。上述待測(cè)番茄幼苗為7周齡待測(cè)番茄幼苗。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明針對(duì)番茄幼苗，首先根據(jù)我國(guó)發(fā)生的TYLCV優(yōu)勢(shì)株系的基因組序列設(shè)計(jì)LAMP引物，通過實(shí)驗(yàn)提出了取樣部位和取樣方法，直接利用牙簽或吸頭穿刺葉片，不需提取DNA，直接進(jìn)行LAMP反應(yīng)，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)勢(shì)，克服了傳統(tǒng)技術(shù)中耗時(shí)、提取核酸、儀器要求高、步驟繁瑣等缺點(diǎn)，為番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒的檢測(cè)提供了一種便于推廣應(yīng)用的檢測(cè)方法。


圖I為L(zhǎng)AMP反應(yīng)檢測(cè)感染番茄黃化曲葉病毒番茄幼苗的結(jié)果圖2為常規(guī)方法檢測(cè)感染番茄黃化曲葉病毒番茄幼苗的結(jié)果
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中番茄黃化曲葉病毒記載在如下文章中北京地區(qū)番茄黃化曲葉病毒病的鑒定及防治對(duì)策討論，周濤，師迎春，陳笑瑜，范在豐，植物保護(hù)，2010年第2期，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、北京市植物保護(hù)站獲得。實(shí)施例I、檢測(cè)番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒的試劑盒制備I、引物的設(shè)計(jì)根據(jù)我國(guó)發(fā)生的番茄黃化曲葉病毒優(yōu)勢(shì)株系的核酸序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下TYLCV-C-F3: 5，-AACGCCATTCTCTGCTTGA-3’(序列 I)TYLCV-C-B3: 5，-GAGCCACTGTTCGCAAGT-3，(序列 2 ) TYLCV-C-FIP: 5，-ACTACCTCCACATCAACTGCAAGGAGCAGTGATGAGTTCCC-3，(序列 3 )TYLCV-C-BIP: 5，-ATGAGCAGCCACAGTCTAGGTGGTTCAACACAAGATAGCCA-3’(序列 4)2、番茄黃化曲葉病毒檢測(cè)反應(yīng)液及試劑盒的制備反應(yīng)液為24 u L，其中加入的引物及終濃度分別為TYLCV-C-F3和TYLCV-C-B3各為0. 2u mol/L ；TYLCV-C-FIP和TYLCV-C-BIP各為I. 6 y mol/L ;其他成分及終濃度分別為甜菜喊 5mol/L ；dNTPslOmmol/L ； I 倍的 Thermopol buffer (含 MgSO4 2mmol/L, New EnglandBiolabs Inc,目錄號(hào) B9004S) ；MgS04 50mmol/L 和水。番茄黃化曲葉病毒檢測(cè)試劑盒包括4條引物或上述反應(yīng)液。實(shí)施例2、檢測(cè)番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒的試劑盒的應(yīng)用一、檢測(cè)番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒的試劑盒的LAMP反應(yīng)I、取樣及LAMP反應(yīng)在育苗盤內(nèi)隨機(jī)取7周齡(3-4片葉)的編號(hào)1-3感染病毒番茄幼苗(且葉片黃化、卷曲、植株矮化)和編號(hào)4不感染病毒的番茄幼苗(無葉片黃化、卷曲、植株矮化等癥狀)，用牙簽(也可以用吸頭)直接穿刺番茄幼苗頂端數(shù)第2片葉片(也可以為頂端數(shù)第2片葉的葉柄)，然后將牙簽放入裝有上述一的2的反應(yīng)液的小管內(nèi)，輕輕攪拌3次，將牙簽取出后，再分別向管中補(bǔ)充Bst DNA聚合酶(8~111)1111，共計(jì)25111反應(yīng)體系?？傮w系為25 ii L，其中 Bst DNA 聚合酶 I y L (終濃度為 0. 32U/ u L, New EnglandBiolabs Inc,目錄號(hào)M0275S)，加入的引物及終濃度分別為TYLCV-C-F3和TYLCV-C-B3各為0. 2u mol/L ；TYLCV-C-FIP和TYLCV-C-BIP各為I. 6 y mol/L ;其他成分及終濃度分別為甜菜喊5mol/L、dNTPsl0mmol/L、I 倍的 Thermopol buffer (含MgSO4 2mmol/L) >MgSO4 50mmoI /L和水。反應(yīng)條件63°C恒溫水浴鍋反應(yīng)45min，得到LAMP產(chǎn)物。2、鑒定I)直接用肉眼觀察顏色變化加熒光染料直接判別結(jié)果反應(yīng)結(jié)束后，將上述LAMP產(chǎn)物放置冰上(0°C) 10分鐘，短暫離心后向產(chǎn)物中加入I U I SYBR Green I (Invitrog en, S7563,按體積比1:10000稀釋使用)，5min后觀察結(jié)果。若反應(yīng)管顏色為綠色，則說明待測(cè)番茄幼苗攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若反應(yīng)管顏色為橙色，則說明待測(cè)番茄幼苗不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒；結(jié)果如圖IA所示，從左到右依次為編號(hào)1-3感染病毒番茄幼苗、編號(hào)4不感染病毒番茄幼苗、空白對(duì)照，可以看出，編號(hào)為1-3的感染病毒番茄幼苗反應(yīng)管顏色為綠色，說明攜帶番茄黃化曲葉病毒；編號(hào)為4的不感染病毒番茄幼苗反應(yīng)管顏色為橙色，說明不攜帶番茄黃化曲葉病毒。2)電泳檢測(cè)分別取5 U L LAMP產(chǎn)物經(jīng)2 %瓊脂糖凝膠在0. 5 X TBE緩沖液和160V電壓條件下電泳30min，在0. g/mL的溴化乙錠(EB)中染色lOmin，染色后于凝膠成像系統(tǒng)中觀察。若反應(yīng)產(chǎn)物有明亮的呈彌散狀的核酸泳帶且呈典型的連續(xù)梯狀，則說明待測(cè)煙粉虱攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若反應(yīng)產(chǎn)物無明亮的呈彌散狀的核酸泳帶且呈典型的連續(xù)梯狀，則說明待測(cè)煙粉虱不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒；結(jié)果如圖IB所不，1-5依次為編號(hào)1-3感染病毒番爺幼苗、編號(hào)4不感染病毒番爺幼苗、空白對(duì)照，可以看出，編號(hào)為1-3的番茄幼苗反應(yīng)產(chǎn)物呈典型的連續(xù)梯狀泳帶，說明攜帶番茄黃化曲葉病毒;編號(hào)為4的番茄幼苗反應(yīng)產(chǎn)物不呈典型的連續(xù)梯狀泳帶，說明不攜帶番茄黃化曲葉病毒。二、常規(guī)檢測(cè)將編號(hào)1-3感染病毒番茄幼苗和編號(hào)4不感染病毒的番茄幼苗進(jìn)行如下檢測(cè)，參照Lefeuvre P, Hoareau M, Delatte H, Reynaud B，Lett J-M(2007)A multiplex PCR methoddiscriminating between the TYLCV and TYLCV-Mld clades of Tomato yellow leafcurl virus. J. Virol. Methodsl44:165-168 的方法,具體步驟如下I、葉片總DNA的提取將上述LAMP方法中穿刺過的編號(hào)1-3感染病毒番茄幼苗和編號(hào)4不感染病毒的番茄幼苗，利用CTAB方法快速提取番茄葉片總DNA ;具體如下取0. Ig番茄葉片樣品，液氮中充分研磨，轉(zhuǎn)入2ml離心管后，加入65°C預(yù)熱的600ii L2%CTAB抽提緩沖液(2% CTAB,200mM Tris-HCl，140mM NaCl,40mM EDTA，I % PVP，pH8. 0)，混勻后于 65°C溫育 30min，再用600 u L氯仿抽提兩次后，上清液中加入等體積的異丙醇，取沉淀經(jīng)70 %乙醇洗滌，干燥后溶于TE中，于-20°C保存。2、PCR擴(kuò)增、克隆和序列測(cè)定根據(jù)Lefeuvre et al. (2007)報(bào)道的檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒的多重PCR引物 TYLCV-1840F :5 ' -GGTCTACGTCATCAATGAC-3 '(基因組上的位置 1840-1858)；Mld-2354R 5 ' -AGGGAGCTAAATCCAGTT-3 '(基因組上的位置 2354-2367) ;IL_2642R 5' -ACACCGATTCATTTCAAC-3'(基因組上的位置 2642-2659)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。建立25 ii L PCR反應(yīng)體系番茄葉片總DNA0. 5 U L,反應(yīng)的終濃度為PCR反應(yīng)緩沖液 I X，d NTPsO. 2mM、TYLCV-1840FI u M、Mld_2354R 0. 5 u M, IL-2642R 2 u M, Taq DNAPolymerase I. 25U, ddH20 18.75 U L。PCR反應(yīng)條件94°C變性2min，按下列條件進(jìn)行32個(gè)循環(huán)(94°C變性30S，58°C復(fù)性30S，72°C延伸30S)，72°C延伸lOmin。全部PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分離，染色后觀察條帶位置。經(jīng)電泳凝膠成像儀拍照后，結(jié)果如圖2所示，1-5依次為編號(hào)1-3感染病毒番茄幼苗、編號(hào)4不感染病毒番茄幼苗、空白對(duì)照，可以看出，僅編號(hào)1-3感染病毒番茄幼苗出現(xiàn)SOObp左右的目標(biāo)條帶，對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行克隆測(cè)序(序列如下序列5)，經(jīng)比對(duì)分析此片段與 番茄黃化曲葉病毒GenBank中登錄號(hào)JQ038238. I的第1829-2633位核苷酸完全一致，說明1-3樣品被番茄黃化曲葉病毒感染。從上述結(jié)果可以看出本發(fā)明的引物和方法正確。
權(quán)利要求
1.檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增引物組，包括引物I、引物2、引物3和引物4 ； 所述引物I、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列I、序列2、序列3和序列4。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的引物組，其特征在于所述引物組由引物I、引物2、引物3和引物4組成；所述引物I、所述引物2、所述引物3、所述引物4的摩爾比為I :1 8 :8。
3.檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，包括權(quán)利要求I或2所述的引物組、 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、dNTPs、硫酸鎂、甜菜堿和水。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑還包括DNA聚合酶，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑由權(quán)利要求I或2所述的引物組、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增緩沖液、dNTPs、硫酸鎂、DNA聚合酶、甜菜堿和水組成； 所述引物I和所述引物2在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度均為O. 2 μ mol/L, 所述引物3和所述引物4在所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中的終濃度均為I. 6 μ mol/L。
5.檢測(cè)番茄黃化曲葉病毒的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，包括權(quán)利要求I或2所述的引物組或權(quán)利要求3或4所述的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑。
6.權(quán)利要求I或2所述的引物組、權(quán)利要求3或4所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑、權(quán)利要求5所述試劑盒在制備檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒產(chǎn)品或在檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒中的應(yīng)用。
7.—種檢測(cè)和/或輔助檢測(cè)待測(cè)番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒的方法，包括如下步驟用權(quán)利要求3或4所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑對(duì)待測(cè)番茄幼苗進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物，確定待測(cè)番茄幼苗中是否攜帶番茄黃化曲葉病毒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于 所述檢測(cè)環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的方法為如下I)或2): 1)將所述環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物中加入染色劑反應(yīng)，得到染色后反應(yīng)產(chǎn)物；若染色后反應(yīng)產(chǎn)物的顏色為綠色，則待測(cè)番茄幼苗攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若染色后反應(yīng)產(chǎn)物的顏色為橙色，則待測(cè)番茄幼苗不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒； 2)將所述環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物電泳，若反應(yīng)產(chǎn)物呈典型的連續(xù)梯狀條帶，則說明待測(cè)番茄幼苗攜帶或候選攜帶番茄黃化曲葉病毒，若反應(yīng)產(chǎn)物無典型的連續(xù)梯狀條帶，則說明待測(cè)番茄幼苗不攜帶或候選不攜帶番茄黃化曲葉病毒。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于 所述用權(quán)利要求3或4所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑對(duì)待測(cè)番茄幼苗進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的方法包括如下步驟 1)用尖端物直接穿刺待測(cè)番茄幼苗的組織； 2)將經(jīng)步驟I)處理后所述尖端物的用于刺穿待測(cè)番茄幼苗組織的一端放入權(quán)利要求3所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增試劑中攪拌，得到反應(yīng)液； 3)向步驟2)得到的反應(yīng)液中添加DNA聚合酶，使其在所述反應(yīng)液中的終濃度為O.32U/μ L ;反應(yīng)，得到環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的溫度為63°C _65°C，所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)的時(shí)間為45分鐘-60分鐘；所述待測(cè)番茄苗組織為葉片或葉柄；所述葉片具體為所述待測(cè)番茄幼苗 頂端數(shù)第2片葉片；所述葉柄具體為所述待測(cè)番茄幼苗頂端數(shù)第2片葉的葉柄。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)番茄幼苗攜帶番茄黃化曲葉病毒試劑盒及方法。本發(fā)明提供的引物組，包括引物1、引物2、引物3和引物4；所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的核苷酸序列分別依次為序列表中的序列1、序列2、序列3和序列4。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明針對(duì)番茄幼苗是否被番茄黃化曲葉病毒侵染，根據(jù)我國(guó)發(fā)生的TYLCV優(yōu)勢(shì)株系的基因組序列設(shè)計(jì)LAMP引物，通過實(shí)驗(yàn)提出了直接利用牙簽或吸頭穿刺番茄葉片或葉柄，不需提取DNA，直接進(jìn)行LAMP反應(yīng)，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏等優(yōu)勢(shì)，克服了傳統(tǒng)技術(shù)中耗時(shí)、提取核酸、儀器要求高、步驟繁瑣等缺點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102776295SQ201210274209
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年8月3日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月3日
發(fā)明者周濤, 師迎春, 梁彥, 范在豐, 鄭建秋 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué), 北京市植物保護(hù)站