專利名稱：一種不添加有機溶劑制備β-環(huán)狀糊精的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酶工程技術(shù)領(lǐng)域，是用重組大腸桿菌表達的環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)作用淀粉制備β -環(huán)狀糊精(β_⑶)的方法。
背景技術(shù)：
環(huán)狀糊精(CD)，又稱環(huán)聚葡萄糖，是由環(huán)繞糊精轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)作用于淀粉形成6-12個D-吡喃葡萄糖基以α-1，4-糖苷鍵連接的環(huán)狀聚合物。根據(jù)葡萄糖殘基個數(shù)的不同，CDs—般分類為 α-、β-、Υ-、δ-、ε-、ζ-及 η-CD，分別由 6、7、8、9、10、11 及 12 個葡萄糖單元組成，其中研究最多且應(yīng)用最廣的是α-、β-、Υ_⑶。目前β_⑶的應(yīng)用最廣泛，這是由于β_⑶的孔徑適中，性質(zhì)穩(wěn)定。β_環(huán)糊精是一種具有內(nèi)疏水外親水的筒狀結(jié)構(gòu)，這種獨特的分子結(jié)構(gòu)可以使它通過范德華力、疏水作用力以及主客體分子之間的空間匹配效應(yīng)，與一些電荷、極性、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相匹配的客體分子或基團形成超分子包合物，改變這些物質(zhì)的物理和化學(xué)性能，進而能被大量地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、日用消費品及化工等領(lǐng)域。因 此大規(guī)模生產(chǎn)β_⑶有重要的意義?，F(xiàn)有的β-CD的生產(chǎn)方式有化學(xué)法和酶法，化學(xué)合成方法價格昂貴、產(chǎn)率也很低，只適合科學(xué)研究。另外一種就是用酶制備，這也是世界上最為常用的方法，和化學(xué)法相比條件溫和產(chǎn)率也很高。酶法生產(chǎn)⑶，得到的是三種⑶的混合物，分別是α-、β-、Υ-⑶。傳統(tǒng)的CD制備工藝主要是有機溶劑法，利用CD與有機溶劑的包合作用促使產(chǎn)物CD從反應(yīng)液中沉淀分離出來。如果在酶轉(zhuǎn)化淀粉的過程中添加有機溶劑，則可發(fā)揮多重作用，反應(yīng)過程也變?yōu)榭煽刂七^程。這是由于α-、β-、Υ-⑶內(nèi)腔孔徑不同，可以對有機溶劑進行選擇性包合，不溶包合物的生成改變了反應(yīng)體系的平衡，會促使更多⑶的轉(zhuǎn)化生成，而且利用包合的選擇性也可以使不同的CD單獨沉淀，從而實現(xiàn)對混合產(chǎn)品的分離純化。我國用酶法制備β-CD的方法大同小異，但依然無法克服成本、周期、產(chǎn)率等方面的問題。相比日本、德國、法國等國家產(chǎn)量不高，價格較貴且純度不高，國內(nèi)環(huán)糊精的供需也多依靠進口。鑒于β -⑶在輕工業(yè)中廣泛的應(yīng)用價值，國內(nèi)對⑶的制備開發(fā)十分重視，應(yīng)用研究也不斷深入。目前的制備方法存在的缺陷是制備步驟繁多(需要兩次液化和多次調(diào)ΡΗ)，并且添加有機溶劑(環(huán)己烷)后雖然產(chǎn)率高但對環(huán)境有污染、在個別衛(wèi)生安全領(lǐng)域要求較高領(lǐng)域(食品，醫(yī)藥)的應(yīng)用會受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用重組大腸桿菌表達的環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)作用淀粉制備β -環(huán)狀糊精(β -CD)的方法，可以不添加有機溶劑。本發(fā)明的制備β_環(huán)狀糊精(β_⑶)的方法是利用重組大腸桿菌轉(zhuǎn)化表達產(chǎn)生的酶作用于木薯淀粉，具體工藝流程為
1)取底物木薯淀粉在9(TlO(TC下糊化20分鐘，將溫度降至55°C；
2)加入5-6U/g底物的環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，加入CaCl2保證整個體系CaCl2的濃度是30mmol/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5-8. O,攪拌水解20 30分鐘，攪拌至反應(yīng)液不再粘稠為止；
3)將溫度升至63 65°C攪拌反應(yīng)15 17小時；
4)反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液于100°C滅酶活15 20分鐘；
5)加入40U/gα -淀粉酶，用HCl調(diào)pH至6 6. 5，60°C下反應(yīng)I 3小時；
6)水解完全后，溫度升至100°C，加入2%(W/V)活性炭脫色2 4個小時過濾；
7)溫度降至40°C,減壓蒸懼至原體積的1/5后，降溫至5°C,IOOOOrpm離心IOmin,下層固體即為β-環(huán)糊精。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的具有以下優(yōu)點 I.不需要靜置液化，一步液化后就進行環(huán)化反應(yīng)，簡化了工序。2.不需要頻繁調(diào)動pH值，過程中pH比較穩(wěn)定。3.不添加有機溶劑，對環(huán)境的污染小并且在一些特殊要求領(lǐng)域(食品，醫(yī)藥等)可得到廣泛的應(yīng)用。4.生產(chǎn)出來的β-⑶產(chǎn)率均在26%以上，且純度較高，用分光光度機法測量純度均在95%以上。


圖I是分光光度計法測定β -⑶含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2是本發(fā)明的β -環(huán)狀糊精(β -⑶)的制備流程圖。
具體實施例方式實施例I :
稱取木薯淀粉15g至250ml的錐形瓶中，100°C下糊化20分鐘；溫度降至55°C，取環(huán)化活性5U/g底物的CGT酶量加入到淀粉漿液中，并加入CaCl2保證體系中CaCl2的濃度為30mmol/L，用NaOH調(diào)pH為7. 5攪拌水解20分鐘，攪拌到體系不再粘稠為止；溫度升至63°C攪拌反應(yīng)15個小時；將反應(yīng)液于100°C中15分鐘滅酶活后，加入40U/g α -淀粉酶，用HCl調(diào)pH為6. 5，60°C反應(yīng)I小時水解剩余的淀粉，然后溫度升至100°C后加入2g活性炭脫色2個小時。溫度降至40°C減壓蒸餾至原體積的1/5。溫度降至5°C，IOOOOrpm離心10分鐘棄去液體，余下的固體即是粗制β_⑶，質(zhì)量是3.951g，產(chǎn)率為26. 34%。實施例2
稱取木薯淀粉15g至250ml的錐形瓶中，100°C下糊化20分鐘；溫度降至55°C，取環(huán)化活性6U/g底物的CGT酶量加入到淀粉漿液中，并加入CaCl2保證體系中CaCl2的濃度為30mmol/L，用NaOH調(diào)pH為8. O攪拌水解20分鐘，攪拌到體系不再粘稠為止；溫度升至64°C攪拌反應(yīng)17個小時；將反應(yīng)液于100°C中15分鐘滅酶活后，加入40U/ga-淀粉酶，pH用HCl調(diào)到6. 0，60°C反應(yīng)2小時水解剩余的淀粉，然后溫度升至100°C后加入2g活性炭脫色3個小時。溫度降至40°C減壓蒸餾至原體積的1/5。溫度降至5°C，IOOOOrpm離心10分鐘棄去液體，余下的固體即是粗制β_⑶，質(zhì)量是3.963g，產(chǎn)率為26.42%。實施例3:
稱取木薯淀粉15g至250ml的錐形瓶中，95°C下糊化20分鐘；溫度降至55°C，取環(huán)化活性5U/g底物的CGT酶量加入到淀粉漿液中，并加入CaCl2保證體系中CaCl2的濃度為30mmol/L，用NaOH調(diào)pH為7. 6攪拌水解30分鐘，攪拌到體系不再粘稠為止；溫度升至65°C攪拌反應(yīng)16個小時；將反應(yīng)液于100°C中15分鐘滅酶活后，加入40U/ga-淀粉酶，pH用HCl調(diào)到6. 5，60°C反應(yīng)3小時水解剩余的淀粉，然后溫度升至100°C后加入2g活性炭脫色3個小時。溫度降至40°C減壓蒸餾至原體積的1/5。溫度降至5°C，IOOOOrpm離心10分鐘 棄去液體，余下的固體即是粗制β -⑶，質(zhì)量是3. 942g，產(chǎn)率為26. 28%。
權(quán)利要求
1.ー種不添加有機溶劑制備3 -環(huán)狀糊精的方法，其特征是按以下步驟進行 1)取底物木薯淀粉在9(Tl00°C下糊化20分鐘，將溫度降至55°C； 2)加入5-6U/g底物的環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，加入CaCl2保證整個體系CaCl2的濃度是30mmol/L，用NaOH調(diào)pH至7. 5-8. 0，攪拌水解20 30分鐘，攪拌至反應(yīng)液不再粘稠為止； 3)將溫度升至63 65°C攪拌反應(yīng)15 17小時； 4)反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液于100°C滅酶活15 20分鐘； 5)加入40U/ga -淀粉酶，用HCl調(diào)pH至6 6. 5，60°C下反應(yīng)I 3小時； 6)水解完全后，溫度升至100°C，加入2%(W/V)活性炭脫色2 4個小時過濾； 7)溫度降至40°C,減壓蒸懼至原體積的1/5后，降溫至5°C,IOOOOrpm離心IOmin,下層固體即為￠-環(huán)糊精。
全文摘要
本發(fā)明是一種不添加有機溶劑制備β-環(huán)狀糊精的方法。用重組大腸桿菌表達的環(huán)狀糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGT酶)作用于淀粉底物生產(chǎn)β-CD，整個反應(yīng)的體系液化和環(huán)化都是維持pH8.0，液化的時間為20分鐘-30分鐘，環(huán)化反應(yīng)的時間為15-17個小時。反應(yīng)體系中不涉及有機溶劑，對環(huán)境的污染很低，并且在個別要求較高領(lǐng)域可得到很好的利用。
文檔編號C12P19/18GK102796785SQ201210333949
公開日2012年11月28日 申請日期2012年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月11日
發(fā)明者黃遵錫, 宋拓, 李俊俊, 唐湘華, 許波, 楊云娟, 周峻沛 申請人:云南師范大學(xué)