軍團菌dna提取試劑盒及提取軍團菌dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種臨床樣本及環(huán)境水樣本中軍團菌DNA提取方法及提取試劑盒。即通過疊氮鈉、Chelex-100溶液，使標本中的蛋白質變性，在蛋白酶K充分消化作用后，通過Chelex-100將非核酸有機物螯合，再離心除去Chelex顆粒，使其它雜質與DNA分離，從而將上清DNA溶解在三羥甲基氨甲烷鹽酸鹽和乙二胺四乙酸溶液中，DNA得以純化回收。本發(fā)明的方法可以在較短時間內同時提取多個樣品，正常工作時間小于60min，獲得適合后續(xù)分子生物學分析的DNA樣品。本發(fā)明方法建立的試劑盒獲得的DNA樣品純度高，且在單管操作，可有效避免因轉換而引起的污染，成本低廉，使用范圍廣泛。
【專利說明】軍團菌DNA提取試劑盒及提取軍團菌DNA的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因組DNA分離純化【技術領域】，具體是一種基因組DNA試劑盒及其用于快速從臨床標本及環(huán)境水樣本中提取軍團菌DNA的方法。
【背景技術】
[0002]軍團菌是一種兼性胞內寄生菌，是引起人類軍團菌病的重要病原體。近年來，軍團菌病在世界各地時有爆發(fā)流行，我國已將其例入14種新發(fā)傳染病之一。據(jù)國外報道，院內不明原因肺炎感染有10%是由軍團菌引起。目前已知軍團菌雖有52個種，70多個血清型。因此，軍團菌的鑒定對于軍團菌病診斷具有重大價值。
[0003]DNA的提取是分子生物學研究的基礎技術，提取的DNA的純度及結構完整性是進行細菌分子生物學研究的基礎。軍團菌的鑒定主要依靠分子分型檢測技術，主要包括傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(PCR)電泳及探針雜交檢測方法、擴增長度多態(tài)性分析(AFLP)、限制性片段長度多態(tài)性分析(RFCP)、隨機擴增多態(tài)性分析(RAPD)、限制性酶切分析、DNA測序分析等。但以上的檢測方法均需要高質量DNA的提取。目前，細菌基因組DNA提取方法常見的有堿裂解法、Chelex-1OO法、溶菌酶法、煮沸法及SDS裂解法等，而Chelex-100法、煮沸法作為一種簡單有效地快速DNA提取方法，廣泛應用于細菌DNA的提取，但常規(guī)的Chelex-1OO法、煮沸法在處理臨床標本時都具有一定的局限性。本發(fā)明對傳統(tǒng)的Chelex-100法、煮沸法加以改良，建立了一種有效地軍團菌及及其他病原菌的快速簡便、經濟適用并能滿足臨床需要的基因組DNA提取方法及提取 試劑盒。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種快速從臨床標本及環(huán)境水樣標本中獲得軍團菌基因組DNA的方法，并提供成套的軍團菌基因組DNA提取試劑盒。
[0005]為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明提供一種軍團菌DNA提取試劑盒，包括DNA提取液，所述提取液由0.1~0.3%疊氮鈉、5~10%Chelex-100溶液、8~12mM三羥甲基氨甲烷鹽酸、
0.1~0.3mM乙二胺四乙酸二鈉、100~200 μ g/ml蛋白酶K組成。
[0006]同時，本發(fā)明還提供一種提取軍團菌DNA的方法，包括以下步驟，
[0007]先配置200ml的DNA提取液:稱取三羥甲基氨甲烷鹽酸0.24g，加無菌水至100ml，混合溶解；再加濃鹽酸10 μ 1，調Ph值至8.3 ;加乙二胺四乙酸二鈉7.5mg混合溶解；再加疊氮鈉0.2g,加無菌水至200ml ;最后再加入IOg的Chelex-100溶液和40mg的蛋白酶K,充分混合后，于-20°C保存；
[0008]再提取軍團菌DNA:向濃縮處理的待提取樣品中加入50~100 μ I的DNA提取液，充分混勻，置于55°C水浴30min，100°C水浴lOmin，置于13000rpm離心3min，取上清即為提取的軍團菌基因組DNA。
[0009]本發(fā)明使用疊氮鈉、Chelex-100溶液，最大程度的使臨床標本及環(huán)境水樣標本中的蛋白質變性，在蛋白酶K充分消化作用后，利用Chelex-100除去非核酸有機物，再離心除去Chelex顆粒，使其它雜質與DNA分離。從而將上清DNA溶解在三羥甲基氨甲烷鹽酸鹽和乙二胺四乙酸溶液中，使DNA得以純化回收。
[0010]根據(jù)本發(fā)明的方法建立的試劑盒可以在60min時間內同時提取多個樣品，獲得的DNA可直接用于后續(xù)分子生物學分析，不僅可用于軍團菌基因組DNA的提取，也可用于其他病原細菌基因組DNA的提取，具有廣闊的應用前景。
[0011]本發(fā)明根據(jù)上述方法配置的DNA提取液，通過一系列優(yōu)化建立的軍團菌基因組DNA提取試劑盒，其主要優(yōu)點如下:
[0012](I)無需專門抽提蛋白質、沉淀DNA、洗滌DNA和溶解DNA，所用試劑少，提取成本低
廉
MTv ο
[0013](2)單管操作，提取過程中不需要更換基因組DNA的器皿，可有效避免交叉污染。
[0014](3)試劑盒配置簡單，操作方法簡單快速。
[0015](4)使用范圍廣泛，除軍團菌外，對其他細菌基因組DNA的提取也有很好的效果?！揪唧w實施方式】
[0016]本發(fā)明從臨床標本及環(huán)境水樣本中提取軍團菌基因組DNA為具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。
[0017]1、軍團菌DNA提取試劑盒的制備
[0018]
【權利要求】
1.一種軍團菌DNA提取試劑盒，包括DNA提取液，其特征在于:所述提取液由0.1~0.3%疊氮鈉、5~10%Chelex-100溶液、8~12mM三羥甲基氨甲烷鹽酸、0.1~0.3mM乙二胺四乙酸二鈉、100~200μ g/ml蛋白酶K組成。
2.一種提取軍團菌DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟: 先配置200ml的DNA提取液:稱取三羥甲基氨甲烷鹽酸0.24g，加無菌水至100ml，混合溶解；再加濃鹽酸10μ 1，調ph值至8.3 ;加乙二胺四乙酸二鈉7.5mg混合溶解；再加疊氮鈉0.2g,加無菌水至200ml ;最后再加入IOg的Chelex-1OO溶液和40mg的蛋白酶K,充分混合后，于_20°C保存。 再提取軍團菌DNA:向濃縮處理的待提取樣品中加入50~100 μ I的DNA提取液，充分混勻，置于55°C水浴30min，100°C水浴lOmin，置于13000rpm離心3min，取上清即為提取的軍團菌基因組DNA。`
【文檔編號】C12N15/10GK103509785SQ201210349441
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年9月18日 優(yōu)先權日:2012年9月18日
【發(fā)明者】朱慶義, 胡朝暉, 趙利偉 申請人:上海金域醫(yī)學檢驗所有限公司