專利名稱：一種檢測h3n2型禽流感病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測H3N2型禽流感病毒DNA或RNA經(jīng)環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)擴增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領域。
背景技術(shù)：
對基因(DNA)及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA)的高靈敏性、高特異性、簡單、快速的檢測，對于疾病的早期診斷和治療以及在在衛(wèi)生防疫、環(huán)境監(jiān)測、檢驗檢疫等領域都具有十分重要的意義。以往在這方面較為準確靈敏的檢測方法有熒光標記法、放射性標記等方法，這些方法都需要復雜的操作和特殊的設備，應用范圍很窄。1993年PE公司的Dr. Kary B. Mullis發(fā)明了聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR。隨后PCR技術(shù)大規(guī)模的應用于生物科研和臨床治療中，對DNA的檢測進入了新的時代，Dr. Mullis為此還獲得了 1993年的諾貝爾化學獎。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準確性高、操作較簡單等優(yōu)點，但由于其反應進行和產(chǎn)品DNA的檢測需要特殊的儀器，PCR技術(shù)的使用一直被限定在專業(yè)的實驗室和醫(yī)院里。2001年日本榮研化學株式會社研制出了一種新型DNA擴增方式，環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)(LAMP)可以在恒溫條件下實現(xiàn)DNA的高效快速擴增，該方法反應條件簡單，DNA擴增效率高，因此在核酸檢測方面具有明顯優(yōu)勢。但是對LAMP擴增制備的DNA產(chǎn)物使用常規(guī)的檢測方法，如電泳法，熒光染料法等，均無法排除LAMP擴增所帶來的假陽性問題，而且需要特殊的儀器，因此限制了 LAMP技術(shù)的實際應用。禽流感，全名鳥禽類流行性感冒，是由病毒引起的動物傳染病，通常只感染鳥類，少見情況會感染豬。禽流感病毒高度針對特定物種，但在罕有情況下會跨越物種障礙感染人。自從1997年在香港發(fā)現(xiàn)人類也會感染禽流感之后，此病癥引起全世界衛(wèi)生組織的高度
關注。其后，本病一直在亞洲區(qū)零星爆發(fā)，但在2003年12月開始，禽流感在東亞多國-
主要在越南、韓國、泰國——嚴重爆發(fā)，并造成越南多名病人喪生。直到2005年中，疫癥不但未有平息的跡象，而且還不斷擴散?，F(xiàn)時遠至東歐多個國家亦有案例。根據(jù)核蛋白的抗原性分類，禽流感病毒則屬甲型流感病毒，甲型流感病毒是根據(jù)位于其套膜上的血凝素及神經(jīng)氨酸酶的抗原性分為若干亞型，血凝素(H)有16個亞型；神經(jīng)氨酸酶(N)有9個亞型。所有的這些亞型都可以感染鳥，在禽類中高致病性的屬于H5、H7亞型。典型的雞禽流感病毒是H7N7，造成1983年、1984年在美國東部大流行的是H5N2。目前東南亞地區(qū)出現(xiàn)的人類感染是H5N1型。1997年發(fā)現(xiàn)的H5N1型毒株被認定是當時流行性感冒的病源。1999年，香港出現(xiàn)過H9N2型禽流感的人類感染，2003年，荷蘭出現(xiàn)過H7N7型禽流感的人類感染。2006年I月，美國出現(xiàn)H3N2型禽流感病毒，目前針對H3N2型禽流感病毒缺乏簡單、快速、便于使用和成本低廉的檢測方法
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測H3N2型禽流感病毒專有的基因片段經(jīng)環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)擴增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，從而判定H3N2型禽流感病毒的存在與否。本發(fā)明采用如下采用下述技術(shù)方案來解決上述問題本發(fā)明試劑盒包括兩部分
(I)標記有可以識別H3N2型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴增待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴增待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒RNA的環(huán)介導等溫核酸擴增體系。本發(fā)明中，試劑盒的工作原理為I.納米金顆粒標記有能識別H3N2型禽流感病毒特定序列的分子探針，分子探針被固定在納米金顆粒的表面。2.待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒DNA分子或H3N2型禽流感病毒RNA經(jīng)環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)大量復制或先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過程后大量復制，H3N2型禽流感病毒的目標片段被放大109倍，產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物DNA具有多重重復序列。 3.混合納米金顆粒和環(huán)介導等溫核酸擴增體系，H3N2型禽流感病毒經(jīng)環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)以后的產(chǎn)物DNA與納米金顆粒上能識別H3N2型禽流感病毒特定序列的分子探針雜交。4.納米金顆粒沿環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體(如附圖所示)，進而引發(fā)納米金顆粒聚集處(例如溶液中、固體表面等)的顏色變化，依據(jù)顏色變化可以判斷待測樣品是否具有H3N2型禽流感病毒DNA或RNA。本發(fā)明中，納米金顆粒探針包括兩個部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別H3N2型禽流感病毒的特定序列。本發(fā)明中，待檢測樣品中環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)的擴增對象可以是H3N2型禽流感病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。本發(fā)明中，納米金顆粒探針和H3N2型禽流感病毒環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以和環(huán)介導等溫核酸擴增反應在相同反應條件下、相同反應容器中同時進行。本發(fā)明中，納米金顆粒探針和H3N2型禽流感病毒環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以發(fā)生在溶液中或者固體表面。本發(fā)明中，納米金顆粒探針與H3N2型禽流感病毒環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交引發(fā)溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計等光學儀器檢測。本發(fā)明中，分子探針是指可以識別H3N2型禽流感病毒環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質(zhì)，化學分子。本發(fā)明中，相同反應條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反應時間等。本發(fā)明的優(yōu)勢本發(fā)明試劑盒結(jié)合環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準確、成本低廉、不需要專業(yè)儀器設備的方法，可以廣泛應用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測、檢驗檢疫，生物技術(shù)等領域的高靈敏度的H3N2型禽流感病毒檢測。


圖I為標記有分子探針的納米金顆粒與H3N2型禽流感病毒經(jīng)環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)以后的產(chǎn)物DNA雜交示意圖，納米金顆粒沿柯H3N2型禽流感病毒環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體。
具體實施例本發(fā)明試劑盒包括2管溶液，一管中是標記有可以識別H3N2型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒溶液50 iil，一管中是250 可以擴增待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴增待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒RNA的環(huán)介導等溫核酸擴增體系。納米金顆粒溶液中含有直徑為20 nm的納米金顆粒，濃度為I. 2 nM，納米金顆粒表 面標記有疏基修飾的DNA探針。環(huán)介導等溫核酸擴增體系成分如下0. 2 UMF3和B3引物，1.6 ii M FIP和BIP引物，0. 4 M betaine (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO), 10 mM MgS04, I. 4 mM dNTPs,IX ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 80 U Bst DNApolymerase (New England Biolabs), 6. 25 U AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen, Carlsbad,CA)。巰基修飾的DNA探針序列
5，-TAGAGAAGGCCAATCCAAAAAAAAAAA-SH-3，。H3N2型禽流感病毒的F3弓丨物序列
5’-AGCCAATGACCTCTGTTACC-3’ 。H3N2型禽流感病毒的B3弓丨物序列
5，-CAGGGAATTTCAACGATT-3，。H3N2型禽流感病毒的FIP引物序列
5’-ATGAAGAATTGAAACACCTATTGAGCAGGATAAACCATTT-3’ 。H3N2型禽流感病毒的BIP引物序列
5’-GAGAAAATACAGATCATCCCCAAAGACTCTTGGTCAGA-3’ 。操作過程如下1.向裝有環(huán)介導等溫核酸擴增體系的管中加入10 U I提取的核酸或者混合樣品。2.將裝有混合物的管放入60° C的水浴中30分鐘。3.再向步驟2中的管中加入納米金顆粒溶液，此時混合后的溶液為紅色。4. 60° C水浴反應15分鐘。觀察反應后管中溶液的顏色，溶液保持紅色不變則不含有H3N2型禽流感病毒感染特異性RNA或H3N2型禽流感病毒DNA ;如果溶液變?yōu)闇\紫色，則判定樣本中含有H3N2型禽流感病毒感染特異性的RNA或H3N2型禽流感病毒DNA。
權(quán)利要求
1.一種用納米金顆粒檢測H3N2型禽流感病毒經(jīng)環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)擴增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下部分(I)標記有可以識別H3N2型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴增待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴增待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒RNA的環(huán)介導等溫核酸擴增體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，該試劑盒的工作原理為(I)用環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)擴增待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后用環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)擴增待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒RNA ； (2)納米金顆粒探針與環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交；(3)雜交引發(fā)納米金顆粒聚集，導致納米金顆粒聚集處顏色改變，以此判斷待檢測樣品是否含有H3N2型禽流感病毒DNA或RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，納米金顆粒探針包括兩個部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識別H3N2型禽流感病毒的特定序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2，待檢測樣品中環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)的擴增對象可以是H3N2型禽流感病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和H3N2型禽流感病毒環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以和環(huán)介導等溫核酸擴增反應在相同反應條件下、相同反應容器中同時進行。
6.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和H3N2型禽流感病毒環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以發(fā)生在溶液中或者固體表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針與H3N2型禽流感病毒環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交引發(fā)溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計等光學儀器檢測。
8.根據(jù)權(quán)利要求3，分子探針是指可以識別H3N2型禽流感病毒環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)產(chǎn)物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質(zhì)，化學分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求4，相同反應條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反應時間等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測H3N2型禽流感病毒DNA經(jīng)環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)擴增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測技術(shù)領域。本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導等溫核酸擴增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測的靈敏度，是一種操作簡單、快速、準確、不需要專業(yè)儀器設備的方法，可以廣泛應用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測、檢驗檢疫，生物技術(shù)等領域的高靈敏度的H3N2型禽流感病毒檢測。本發(fā)明試劑盒包括兩部分(1)標記有可以識別H3N2型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴增待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒DNA或先經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄過程后再擴增待檢測樣品中的H3N2型禽流感病毒RNA的環(huán)介導等溫核酸擴增體系。
文檔編號C12Q1/70GK102851401SQ20121035759
公開日2013年1月2日 申請日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:天津朝?？萍加邢薰?br>