專利名稱：一種檢測(cè)h5型禽流感病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測(cè)H5型禽流感病毒DNA或RNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
對(duì)基因(DNA)及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(RNA)的高靈敏性、高特異性、簡(jiǎn)單、快速的檢測(cè)，對(duì)于疾病的早期診斷和治療以及在在衛(wèi)生防疫、環(huán)境監(jiān)測(cè)、檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域都具有十分重要的意義。以往在這方面較為準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)方法有熒光標(biāo)記法、放射性標(biāo)記等方法，這些方法都需要復(fù)雜的操作和特殊的設(shè)備，應(yīng)用范圍很窄。1993年P(guān)E公司的Dr. Kary B. Mullis發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction),簡(jiǎn)稱PCR。隨后PCR技術(shù)大規(guī)模的應(yīng)用于生物科研和臨床治療中，對(duì)DNA的檢測(cè)進(jìn)入了新的時(shí)代，Dr. Mullis為此還獲得了1993年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。雖然PCR方法具有快速、靈敏、準(zhǔn)確性高、操作較簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但由 于其反應(yīng)進(jìn)行和產(chǎn)品DNA的檢測(cè)需要特殊的儀器，PCR技術(shù)的使用一直被限定在專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和醫(yī)院里。2001年日本榮研化學(xué)株式會(huì)社研制出了一種新型DNA擴(kuò)增方式，環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)(LAMP)可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)DNA的高效快速擴(kuò)增，該方法反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，DNA擴(kuò)增效率高，因此在核酸檢測(cè)方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。但是對(duì)LAMP擴(kuò)增制備的DNA產(chǎn)物使用常規(guī)的檢測(cè)方法，如電泳法，熒光染料法等，均無(wú)法排除LAMP擴(kuò)增所帶來(lái)的假陽(yáng)性問(wèn)題，而且需要特殊的儀器，因此限制了 LAMP技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用。禽流感，全名鳥(niǎo)禽類流行性感冒，是由病毒引起的動(dòng)物傳染病，通常只感染鳥(niǎo)類，少見(jiàn)情況會(huì)感染豬。禽流感病毒高度針對(duì)特定物種，但在罕有情況下會(huì)跨越物種障礙感染人。自從1997年在香港發(fā)現(xiàn)人類也會(huì)感染禽流感之后，此病癥引起全世界衛(wèi)生組織的高度
關(guān)注。其后，本病一直在亞洲區(qū)零星爆發(fā)，但在2003年12月開(kāi)始，禽流感在東亞多國(guó)-
主要在越南、韓國(guó)、泰國(guó)——嚴(yán)重爆發(fā)，并造成越南多名病人喪生。直到2005年中，疫癥不但未有平息的跡象，而且還不斷擴(kuò)散?，F(xiàn)時(shí)遠(yuǎn)至東歐多個(gè)國(guó)家亦有案例。根據(jù)核蛋白的抗原性分類，禽流感病毒則屬甲型流感病毒，甲型流感病毒是根據(jù)位于其套膜上的血凝素及神經(jīng)氨酸酶的抗原性分為若干亞型，血凝素(H)有16個(gè)亞型；神經(jīng)氨酸酶(N)有9個(gè)亞型。所有的這些亞型都可以感染鳥(niǎo)，在禽類中高致病性的屬于H5、H7亞型。典型的雞禽流感病毒是H7N7，造成1983年、1984年在美國(guó)東部大流行的是H5N2。目前東南亞地區(qū)出現(xiàn)的人類感染是H5N1型。1997年發(fā)現(xiàn)的H5N1型毒株被認(rèn)定是當(dāng)時(shí)流行性感冒的病源。1999年，香港出現(xiàn)過(guò)H9N2型禽流感的人類感染，2003年，荷蘭出現(xiàn)過(guò)H7N7型禽流感的人類感染；2006年I月，美國(guó)出現(xiàn)H3N2。H5N1型禽流感病毒是1996年首次在中國(guó)廣東的家鵝中明確發(fā)現(xiàn)。H5N1型禽流感病毒主要感染鳥(niǎo)類并導(dǎo)致禽流感。1997年在香港傳播時(shí)，很多農(nóng)場(chǎng)的雞受感染后都即時(shí)死亡，并引發(fā)首次報(bào)告了 H5N1型禽流感病毒感染人類的病例，使一名幼稚園學(xué)生死亡。截至2005年11月25日，全世界已向世界衛(wèi)生組織報(bào)告132例人感染病例，其中68例死亡，死亡率超過(guò)50% ;這些確診的報(bào)告病例全部發(fā)生在東南亞地區(qū)(印度尼西亞、越南、泰國(guó)、柬埔寨、中國(guó)大陸)。禽流感病毒H5N2型與H5N1型不同，H5N2型流感病毒的感染在禽鳥(niǎo)中常見(jiàn)，而所謂‘高病毒性’禽流感病毒系指針對(duì)禽鳥(niǎo)類，并非針對(duì)人類而言”。目前資料都顯示，H5N2禽流感不管是高病原還是低病原，國(guó)際上都認(rèn)定為禽病，不會(huì)傳染給人，但是給養(yǎng)殖業(yè)造成的損失非常巨大。目前針對(duì)H5型(H5N1型或者H5N2型)禽流感病毒缺乏簡(jiǎn)單、快速、便于使用和成本低廉的檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種用納米金顆粒檢測(cè)H5型(H5N1型或者H5N2型)禽流感病毒專有的基因片段經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，從而判定H5型 禽流感病毒的存在與否。本發(fā)明采用如下采用下述技術(shù)方案來(lái)解決上述問(wèn)題本發(fā)明試劑盒包括兩部分
(I)標(biāo)記有可以識(shí)別H5型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒DNA或先經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程后再擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。本發(fā)明中，試劑盒的工作原理為1.納米金顆粒標(biāo)記有能識(shí)別H5型禽流感病毒特定序列的分子探針，分子探針被固定在納米金顆粒的表面。2.待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒DNA分子或H5型禽流感病毒RNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)大量復(fù)制或先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程后大量復(fù)制，H5型禽流感病毒的目標(biāo)片段被放大109倍，產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物DNA具有多重重復(fù)序列。3.混合納米金顆粒和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系，H5型禽流感病毒經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)以后的產(chǎn)物DNA與納米金顆粒上能識(shí)別H5型禽流感病毒特定序列的分子探針雜交。4.納米金顆粒沿環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體(如附圖所示)，進(jìn)而引發(fā)納米金顆粒聚集處(例如溶液中、固體表面等)的顏色變化，依據(jù)顏色變化可以判斷待測(cè)樣品是否具有H5型禽流感病毒DNA或RNA。本發(fā)明中，納米金顆粒探針包括兩個(gè)部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識(shí)別H5型禽流感病毒的特定序列。本發(fā)明中，待檢測(cè)樣品中環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增對(duì)象可以是H5型禽流感病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。本發(fā)明中，納米金顆粒探針和H5型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在相同反應(yīng)條件下、相同反應(yīng)容器中同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明中，納米金顆粒探針和H5型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以發(fā)生在溶液中或者固體表面。本發(fā)明中，納米金顆粒探針與H5型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交引發(fā)溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計(jì)等光學(xué)儀器檢測(cè)。
本發(fā)明中，分子探針是指可以識(shí)別H5型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質(zhì)，化學(xué)分子。本發(fā)明中，相同反應(yīng)條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反應(yīng)時(shí)間等。本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)本發(fā)明試劑盒結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測(cè)的靈敏度，是一種操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、成本低廉、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的方法，可以廣泛應(yīng)用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)、檢驗(yàn)檢疫，生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的H5型禽流感病毒檢測(cè)。


圖I為標(biāo)記有分子探針的納米金顆粒與H5型禽流感病毒經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)以后的產(chǎn)物DNA雜交示意圖，納米金顆粒沿柯H5型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA分子鏈形成聚集體。
具體實(shí)施例本發(fā)明試劑盒包括2管溶液，一管中是標(biāo)記有可以識(shí)別H5型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒溶液50 iil，一管中是250 Ul可以擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒DNA或先經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程后再擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。納米金顆粒溶液中含有直徑為20 nm的納米金顆粒，濃度為I. 2 nM，納米金顆粒表面標(biāo)記有疏基修飾的DNA探針。環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系成分如下0. 2 UMF3和B3引物，1.6 yMFIP和BIP引物，0. 4 M betaine (Sigma - Aldrich, St. Louis, MO), 10 mM MgS04, I. 4 mM dNTPs,IX ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs, Ipswich, MA), 80 U Bst DNApolymerase (New England Biolabs), 6. 25 U AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Invitrogen, Carlsbad,CA)。疏基修飾的DNA探針序列
5’-AGCTCTGCGATCTAAATAAAAAAAAAAA-SH-3’ 。H5型禽流感病毒的F3弓丨物序列
5’-GGAGTGAAGCCTCTGATT-3’ 。H5型禽流感病毒的B3引物序列
5’-TTAAAAGATTGTAGTGTAGC-3’ 。H5型禽流感病毒的FIP引物序列
5’-GGCTCCTCGGAAACCCATTGTGTGACGAATTCATCAAT-3’ 。H5型禽流感病毒的BIP引物序列
5’-GTGCCAGAATGGTCTTACATAGTAGAGAAGGCCAATCCAG-3’ 。操作過(guò)程如下1.向裝有環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系的管中加入10 U I提取的核酸或者混合樣品。2 將裝有混合物的管放入60° C的水浴中30分鐘。
3.再向步驟2中的管中加入納米金顆粒溶液，此時(shí)混合后的溶液為紅色。4. 60° C水浴反應(yīng)15分鐘。 觀察反應(yīng)后管中溶液的顏色，溶液保持紅色不變則不含有H5型(H5N1型或者H5N2型)禽流感病毒感染特異性RNA或H5型禽流感病毒DNA ;如果溶液變?yōu)闇\紫色，則判定樣本中含有H5型禽流感病毒感染特異性的RNA或H5型禽流感病毒DNA。本發(fā)明可以一次測(cè)定兩種病毒的感染狀態(tài)。
權(quán)利要求
1.一種用納米金顆粒檢測(cè)H5型(H5N1或者H5N2)禽流感病毒經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，其特征在于該試劑盒包括以下部分(1)標(biāo)記有可以識(shí)別H5型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒DNA或先經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程后再擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1，該試劑盒的工作原理為(I)用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒DNA或先經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程后用環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒RNA ； (2)納米金顆粒探針與環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交；(3)雜交引發(fā)納米金顆粒聚集，導(dǎo)致納米金顆粒聚集處顏色改變，以此判斷待檢測(cè)樣品是否含有H5型禽流感病毒DNA或RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1，納米金顆粒探針包括兩個(gè)部分，一是納米尺度的金顆粒，另一部分是固定在納米金顆粒表面的分子探針，該探針可以識(shí)別H5型禽流感病毒的特定序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2，待檢測(cè)樣品中環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)的擴(kuò)增對(duì)象可以是H5型禽流感病毒DNA、RNA或DNA和RNA的混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和H5型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)在相同反應(yīng)條件下、相同反應(yīng)容器中同時(shí)進(jìn)行。
6.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針和H5型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交可以發(fā)生在溶液中或者固體表面。
7.根據(jù)權(quán)利要求2，納米金顆粒探針與H5型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA雜交引發(fā)溶液或固體表面顏色改變，這種變化可由肉眼直接判斷，也可利用分光光度計(jì)等光學(xué)儀器檢測(cè)。
8.根據(jù)權(quán)利要求3，分子探針是指可以識(shí)別H5型禽流感病毒環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)產(chǎn)物DNA的功能分子，這些分子包括DNA，RNA, PNA，蛋白質(zhì)，化學(xué)分子。
9.根據(jù)權(quán)利要求4，相同反應(yīng)條件包括但不限于溶液組成，成分濃度，PH值，溫度，反 應(yīng)時(shí)間等。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用納米金顆粒檢測(cè)H5型(H5N1或者H5N2)禽流感病毒DNA經(jīng)環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增后產(chǎn)物DNA的試劑盒，屬于生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)和生物納米技術(shù)，提高生物分子檢測(cè)的靈敏度，是一種操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、不需要專業(yè)儀器設(shè)備的方法，可以廣泛應(yīng)用于家庭診斷、臨床診斷、傳染病控制、環(huán)境監(jiān)測(cè)、檢驗(yàn)檢疫，生物技術(shù)等領(lǐng)域的高靈敏度的H5型禽流感病毒檢測(cè)。本發(fā)明試劑盒包括兩部分(1)標(biāo)記有可以識(shí)別H5型禽流感病毒特定序列的分子探針的納米金顆粒；(2)可以擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒DNA或先經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程后再擴(kuò)增待檢測(cè)樣品中的H5型禽流感病毒RNA的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增體系。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102851402SQ201210357620
公開(kāi)日2013年1月2日 申請(qǐng)日期2012年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月24日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:天津朝?？萍加邢薰?br>