專利名稱：芘標(biāo)記的單鏈dna熒光探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水溶性熒光聚電解質(zhì)的合成方法以及利用這種聚電解質(zhì)制備檢測寡核酸序列的熒光探針的方法，屬于功能高分子技術(shù)、分析化學(xué)和生物分析化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
功能高分子是在其大分子鏈中結(jié)合了特定的功能基團(tuán)，或大分子與具有特定功能的其他材料進(jìn)行了復(fù)合，或者二者兼而有之而形成的具有某種特定功能的高分子材料，其在生物分析化學(xué)領(lǐng)域，尤其是在生物大分子檢測方面的應(yīng)用已經(jīng)引起國內(nèi)外學(xué)者的密切關(guān)注。核酸堿基序列的特異性識別是當(dāng)前國際研究熱點(diǎn)，而利用具有熒光特性的功能高分子作為熒光探針對核酸進(jìn)行特異性識別已經(jīng)取得了一些不錯(cuò)的效果。日本Saito教授將熒光基團(tuán)芘標(biāo)記到一個(gè)線性單鏈核酸上形成核酸探針，當(dāng)與堿基互補(bǔ)配對的單鏈靶核酸雜化時(shí)表現(xiàn)出較強(qiáng)熒光光譜，當(dāng)與堿基不互補(bǔ)配對的單鏈靶核酸雜化時(shí)表現(xiàn)出相對較弱的熒光光譜，由此來特異性識別核酸序列(J. Am. Chem. Soc., 2004, 126，4820)。王國杰教授曾經(jīng)報(bào)道過芘標(biāo)記HNA和RNA的線性RNA探針，當(dāng)與互補(bǔ)鏈雜化時(shí)，在熒光光譜上會出 現(xiàn)芘單體峰的增強(qiáng)及激基締合物峰的消失，根據(jù)這種明顯的熒光變化來特異識別核酸序列(ChemBioChem. , 2009, 10，1175)。另外一種熒光基團(tuán)標(biāo)記的探針是非線性的探針稱為分子信標(biāo)，其核酸結(jié)構(gòu)為發(fā)卡式且莖端兩端分別接有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，它可以提高錯(cuò)配目標(biāo)的熱識別及降低假陽性信號的風(fēng)險(xiǎn)，且在基因篩檢、生物傳感器的發(fā)展、生物芯片結(jié)構(gòu)及單核苷酸多態(tài)性的檢測方面都有很好的應(yīng)用，所以受到很多學(xué)者的廣泛關(guān)注(Angew.Chem. Int. Ed. 2009，48，856; Analyst. 2005，130，350; Langmuir. 2008，24，12138)。但是所有像以上說介紹的標(biāo)記型熒光探針都是通過共價(jià)鍵將熒光基團(tuán)連接到核酸分子鏈上，其合成操作比較復(fù)雜。近些年許多學(xué)者開始將目光轉(zhuǎn)向用接有熒光基團(tuán)的共軛聚電解質(zhì)制備熒光探針來特異性檢測核酸序列。He教授等人報(bào)道過用一種共軛聚電解質(zhì)作為檢測傳感器來檢測多鏈DNA的雜化(J. Am. Chem. Soc. , 2009, 131，3432)。Gaylord等報(bào)道了一種生物傳感器，它是由含有一種共軛聚電解質(zhì)和一種單鏈DNA的水溶液構(gòu)成，當(dāng)檢測到特征波長的發(fā)射光線時(shí)標(biāo)明含有特定序列的核酸鏈(J. Am. Chem. Soc. 2003,125， 896)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于合成一種水溶性的陽離子聚電解質(zhì)芘功能化的聚4-乙烯基吡啶，并用該聚電解質(zhì)和兩種類型的單鏈寡聚核苷酸制備復(fù)合探針來檢測目標(biāo)DNA特定的堿基序列。
本發(fā)明特點(diǎn)在于共軛聚電解質(zhì)聚4-乙烯基吡啶的合成方法容易操作，用其制備DNA復(fù)合探針的原理也很簡單，且探針的檢測原理與其他報(bào)道過的探針原理有所創(chuàng)新，是根據(jù)熒光基團(tuán)芘嵌插到核酸雙鏈結(jié)構(gòu)與否的熒光變化來檢測DNA的。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明利用芘甲醇和三溴化磷的置換反應(yīng)來制備芘甲溴，并將之按1:10的單體摩爾比接枝到聚4-乙烯基吡啶上，再用溴代正丁烷質(zhì)子化，得到具有水溶性的陽離子聚電解質(zhì)目標(biāo)產(chǎn)物。該產(chǎn)物分別于直鏈和發(fā)卡式結(jié)構(gòu)的單鏈DNA作用形成新型的復(fù)合DNA熒光探針。本發(fā)明的芘標(biāo)記的聚4-乙烯基吡啶聚電解質(zhì)的合成及其在DNA探針制備中的應(yīng)用的具體步驟包括
(1)熒光基團(tuán)芘甲溴分子的制備
冰點(diǎn)溫度下將芘甲醇溶于三氯甲烷中，將摩爾量是芘甲醇的1/2倍的三溴化磷加入 該溶液，冰浴攪拌12個(gè)小時(shí)，然后加入飽和碳酸氫鈉水溶液至中性，分層，取有機(jī)層進(jìn)行蒸餾，重結(jié)晶，并干燥得到芘甲溴；
(2)將芘甲溴接枝到聚4-乙烯基吡啶上
將聚4-乙烯基吡啶溶于三氯甲烷中，再加入適當(dāng)摩爾量的芘甲溴，68°C下攪拌、回流24小時(shí)，然后將反應(yīng)液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥后得到中間產(chǎn)物；
(3)用溴代正丁烷進(jìn)一步接枝到中間產(chǎn)物
將中間產(chǎn)物溶于乙醇，并加入5倍于聚4-乙烯基吡啶單體摩爾量的溴代正丁烷，85°C下攪拌、回流24個(gè)小時(shí)，然后將反應(yīng)液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥得到產(chǎn)物陽離子聚電解質(zhì)。(4) DNA復(fù)合探針的制備
用緩沖溶液PBS (10 mM, pH = 7. 4)溶解適量步驟(3)中聚電解質(zhì)，再用相同緩沖溶液分別溶解適量單鏈DNAl和單鏈DNA3溶液，將聚電解質(zhì)溶液和兩種DNA溶液分別混配成兩種DNA探針，直鏈型和發(fā)卡型探針。(5) DNA雜交樣品的配制
用緩沖溶液PBS (10 mM, pH = 7. 4)溶解單鏈DNA2和DNAt，分別取一定量的DNA2和DNAt加入兩種探針溶液中配成雜交樣品，將樣品先90°C熱處理15min，再在40°C條件下保溫 30min。所述步驟(3)所合成的聚電解質(zhì)的結(jié)構(gòu)式為
十 H2—Cj^CH2-C^
Q O
Nr-Nr-
IorI Br
CH2O
II
ch2
WAJ CH3
其中m/n的值可以在1/100到1/10之間的任意數(shù)值。
所述步驟(4)和(5)中所用DNA序列分別為DNA1 5 ' -GCA CATACA TTC TAC TTG-3 ' , DNA2 5 ' -CGT GTA TGT AAG ATG AAC-3 ' , DNA3 5’-GCACAAACAAGTAGAATGTATGTGC-3' , DNAt 5/ -TTT TTT TTT TTT TTT TTT-3'。其中DNA3是發(fā)卡式結(jié)構(gòu)，其余均為直鏈結(jié)構(gòu)，且DNA2與DNAl完全互補(bǔ)，DNA2與DNA3部分互補(bǔ)，DNAt不與任何其他DNA互補(bǔ)。所述步驟(4)和(5)中所有探針及雜交樣品最終的聚電解質(zhì)濃度均為2. O X 10 7M，所有DNA濃度均為I. O X 1(Γ6 M，而實(shí)際上DNA 的濃度在1.0 X 1(T7 M到I. O X 1(Γ5M之間都可以實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)DNA的檢測。本發(fā)明的主要特點(diǎn)如下
聚電解質(zhì)芘標(biāo)記的聚4-乙烯基吡啶的合成方法簡單，其與直鏈或發(fā)卡式DNA通過親疏水作用及靜電作用結(jié)合形成復(fù)合探針，此時(shí)堿基對芘分子的熒光產(chǎn)生一定的淬滅作用。當(dāng)加入互補(bǔ)的目標(biāo)單鏈DNA時(shí)，會產(chǎn)生進(jìn)一步的明顯熒光淬滅；而當(dāng)加入不互補(bǔ)的目標(biāo)單鏈DNA時(shí)，熒光強(qiáng)度不會發(fā)生相當(dāng)?shù)慕档停覀兛梢杂纱藖頇z測相應(yīng)的DNA堿基序列。本發(fā)明的方法較之很多報(bào)道過的方法相對更簡單，且不失靈敏性，且相對比較快速，準(zhǔn)確度高，在功能高分子領(lǐng)域及生物傳感方面都具有很好的參考價(jià)值。


圖I為芘標(biāo)記的聚4-乙烯基吡啶聚電解質(zhì)的合成路線。圖2為芘標(biāo)記的聚4-乙烯基吡啶聚電解質(zhì)的1H NMR。圖3為發(fā)明實(shí)例2所制備樣品的熒光光譜。a.直鏈探針系列熒光譜圖。b.直鏈探針系列在377nm處熒光強(qiáng)度柱狀圖。c.發(fā)卡式探針系列熒光譜圖。d.發(fā)卡式探針系列在377nm處熒光強(qiáng)度柱狀圖。圖4為DNA探針的制備及檢測原理示意圖。a.直鏈探針原理圖。b.發(fā)卡式探針原理圖。圖5為發(fā)明實(shí)例3所制備樣品的圓二色譜圖。a.直鏈結(jié)構(gòu)的圓二色譜圖。b.發(fā)卡式結(jié)構(gòu)的圓二色譜圖
圖6為發(fā)明實(shí)例4所制備樣品的KI熒光淬滅圖。a.直鏈探針系列熒光淬滅圖。b.直鏈探針系列在377nm處熒光強(qiáng)度柱狀圖。c.發(fā)卡式探針系列熒光淬滅圖。d.發(fā)卡式探針系列在377nm處熒光強(qiáng)度柱狀圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例I :
冰點(diǎn)溫度下將6mmol花甲醇溶于150mL三氯甲燒中，將3mmol三溴化磷加入該溶液，冰浴攪拌12個(gè)小時(shí)，然后加入飽和碳酸氫鈉水溶液至中性，分層，取有機(jī)層進(jìn)行蒸餾，重結(jié)晶，并干燥得到花甲溴。將12mmol聚4-乙烯基卩比唳溶于IOmL三氯甲燒中，再加入I. 2mmol芘甲溴，68°C下攪拌、回流24小時(shí)，然后將反應(yīng)液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥后得到中間產(chǎn)物。將5mmol中間產(chǎn)物溶于SmL乙醇中，并加入14mol溴代正丁烷，85°C下攪拌、回流24個(gè)小時(shí)，然后將反應(yīng)液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥得到產(chǎn)物陽離子聚電解質(zhì)(P4VP-Py-Bu)。實(shí)施例2
(I)配制樣品用PBS (10 mM, pH = 7. 4)緩沖液去配制各個(gè)樣品溶液，分別為如圖 3 中所標(biāo)注的 l)P4VP-Py-Bu，2)P4VP-Py-Bu/ssDNAl，3)P4VP-Py-Bu/ssDNA2，
4)P4VP-Py-Bu/ssDNAl + ssDNA2, 5)P4VP-Py-Bu/ssDNAl + ssDNAt, 6)P4VP-Py-Bu/ ssDNA2+ssDNAt，3’)P4VP_Py-Bu/ssDNA3，4’)P4VP_Py-Bu/ssDNA2+ssDNA3，6’)P4VP-Py-Bu/ssDNA3+ssDNAt共9個(gè)樣品，每個(gè)樣品溶液中的聚電解質(zhì)最終濃度為2. OX 10_7M，每種DNA濃度都為I. OXlO-6M0(2)熱處理樣品將(I)中所配好的樣品放入90°C烘干箱中熱處理15分鐘，然后迅速移至到40°C的烘干箱熱處理30分鐘。(3)對樣品做熒光檢測在344nm激發(fā)波長條件下，通過圖3的曲線圖及377nm處熒光強(qiáng)度柱狀圖可以明顯看出，當(dāng)DNAl或DNA3與聚電解質(zhì)作用形成熒光探針時(shí)，熒光強(qiáng)度較聚電解質(zhì)本身有所下降，而當(dāng)熒光探針中加入互補(bǔ)的目標(biāo)DNA單鏈時(shí)，熒光強(qiáng)度會進(jìn)一步出現(xiàn)明顯的下降，而加入不互補(bǔ)的DNA單鏈時(shí)，熒光強(qiáng)度變化相對較小，其原理如圖4所示，當(dāng)加入互補(bǔ)鏈時(shí)，目標(biāo)DNA與探針DNA形成雙螺旋結(jié)構(gòu),此時(shí)聚電解質(zhì)P4VP-Py-Bu中的芘分子嵌插到雙螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對中，使得堿基對芘熒光的淬滅進(jìn)一步加劇，而加入不互補(bǔ)的DNA單鏈不會形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，這樣也就沒有嵌插作用的產(chǎn)生，所以淬滅作用不會發(fā)生太大變化，由此，我們可以對目標(biāo)單鏈DNA進(jìn)行檢測。實(shí)施例3
(O配制樣品用PBS (10 mM, pH = 7. 4)緩沖液去配制各個(gè)樣品溶液，分別為如圖5中所標(biāo)注的 I) DNA1/DNA2，2) P4VP-Py-Bu + DNA1/DNA2，I’)DNA1/DNA3，2) P4VP-Py-Bu +DNA1/DNA3共4個(gè)樣品。每個(gè)樣品溶液中的聚電解質(zhì)最終濃度為2. O X 10_5M，每種DNA濃度都為 I. OXlO-4Mo(2)熱處理樣品將(I)中所配好的樣品放入90°C烘干箱中熱處理15分鐘，然后迅速移至到40°C的烘干箱熱處理30分鐘。(3)對樣品做圓二色譜測試做圓二色譜測試是為了證實(shí)芘分子確實(shí)嵌插到了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中去。如圖5所示的譜圖，加入聚電解質(zhì)P4VP-Py-Bu后的圓二色譜強(qiáng)度都明顯下降，且正譜帶出現(xiàn)藍(lán)移，負(fù)譜帶出現(xiàn)紅移，導(dǎo)致這種結(jié)果的唯一可能就是嵌插作用，因?yàn)槭Ｏ碌膬煞N可能相互作用靜電和溝壑作用都不會對雙鏈結(jié)構(gòu)產(chǎn)生如此大的作用使其圓二色譜有這樣的變化。實(shí)施例4
(O配制樣品用PBS緩沖液(10 mM, pH = 7. 4)去配制各個(gè)樣品溶液，分別為如圖3中所標(biāo)注的 I) P4VP-Py-Bu, 2 ) P4VP-Py-Bu/ssDNAl，3 ) P4VP-Py-Bu/ssDNA2，4) P4VP-Py-Bu/ssDNAl+ssDNA2，5) P4VP_Py-Bu/ssDNAl+ssDNAt，6) P4VP_Py-Bu/ssDNA2+ssDNAt，3’)P4VP-Py-Bu/ssDNA3，4’)P4VP_Py-Bu/ssDNA2+ssDNA3，6’)P4VP-Py-Bu/ssDNA3+ssDNAt 共 9個(gè)樣品，每個(gè)樣品溶液中的聚電解質(zhì)最終濃度為2. 0X10_7M，每種DNA濃度都為I. 0X10_6M。(2)熱處理樣品將(I)中所配好的樣品放入90°C烘干箱中熱處理15分鐘，然后迅速移至到40°C的烘干箱熱處理30分鐘。(3)KI淬滅實(shí)驗(yàn)用PBS緩沖液(10 mM，pH = 7. 4)配備KI溶液，濃度為O. 2M，每次取IOPL逐次加入每個(gè)樣品中，分別測其熒光強(qiáng)度(如圖6)，并由此根據(jù)依據(jù)如下公式計(jì)算淬滅常數(shù)(Ksv)
10/1 = I + Ksv [I —]
樣品1)，2)，3)，4)，5)和6)的淬滅常數(shù)分別為228，169，143，93，137和 142 Μ—1，其中樣品 4) P4VP-Py-Bu/ssDNAl+ssDNA2 的淬滅常數(shù)最小；樣品 I )，2)，3’)，4’)，
5)和 6，)的淬滅常數(shù)分別為 228，169，122，53，137，152 M'其中 4’)P4VP_Py-Bu/ssDNA2+ssDNA3的淬滅常數(shù)最小。以上結(jié)構(gòu)都是由于芘分子嵌插到了 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，I 一對芘的淬滅作用因雙螺旋結(jié)構(gòu)的保護(hù)而降低，因此該結(jié)果進(jìn)一步證明了芘分子嵌插到了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中。
權(quán)利要求
1.一種芘標(biāo)記的單鏈DNA熒光探針，其特征是該探針具有水溶性，可與互補(bǔ)的目標(biāo)DNA形成雙螺旋結(jié)果，不可與不互補(bǔ)的DNA形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求I所述的單鏈DNA熒光探針，其特征是該探針由單鏈DNA與一種帶有熒光基團(tuán)的陽離子聚電解質(zhì)通過靜電作用和疏水作用互相吸附而得到，技術(shù)手段簡單。
3.如權(quán)利要求2中所述的一種陽離子聚電解質(zhì)，其特征是所述陽離子聚電解質(zhì)接枝有熒光基團(tuán)芘，具有水溶性，且是陽離子性的聚合物。
4.一種如權(quán)利要求3中所述的一種陽離子聚電解質(zhì)的制備方法，其步驟包括 (1)熒光基團(tuán)芘甲溴分子的制備 冰點(diǎn)溫度下將芘甲醇溶于三氯甲烷中，將摩爾量是芘甲醇的1/2倍的三溴化磷加入該溶液，冰浴攪拌12個(gè)小時(shí)，然后加入飽和碳酸氫鈉水溶液至中性，分層，取有機(jī)層進(jìn)行蒸餾，重結(jié)晶，并干燥得到芘甲溴； (2)將芘甲溴接枝到聚4-乙烯基吡啶上 將聚4-乙烯基吡啶溶于三氯甲烷中，再加入1/10于聚4-乙烯基吡啶單體摩爾量的芘甲溴，68°C下攪拌、回流24小時(shí)，然后將反應(yīng)液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥后得到中間產(chǎn)物； (3)用溴代正丁烷進(jìn)一步接枝到中間產(chǎn)物 將中間產(chǎn)物溶于乙醇，并加入5倍于聚4-乙烯基吡啶單體摩爾量的溴代正丁烷，85°C下攪拌、回流24個(gè)小時(shí)，然后將反應(yīng)液緩慢滴加入四氫呋喃中得到沉淀，過濾，洗滌，干燥得到產(chǎn)物陽離子聚電解質(zhì)。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的步驟(2)是將芘按1:10的比例接枝于吡啶上，比例不能太大。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征是所述的步驟(3)是用溴代正丁烷將中間產(chǎn)物季銨化，為了得到具有水溶性的聚陽離子產(chǎn)物。
7.—種如權(quán)利要求I或2所述的芘標(biāo)記的單鏈DNA熒光探針的制備方法，其制備步驟是將芘接枝聚4-乙烯基吡啶陽離子和一種DNA單鏈共同溶于緩沖液中，形成復(fù)合探針。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征是陽離子濃度可以在2X10_8M到2X10_6M之間，單鏈DNA濃度在I. OX IQ-7M到I. OX 1(Γ5Μ之間，緩沖液為磷酸鹽緩沖液，pH = 7. 4。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光基團(tuán)芘接枝的聚4-乙烯基吡啶陽離子聚電解質(zhì)的合成，并由此制備單鏈DNA復(fù)合熒光探針的方法。芘接枝聚4-乙烯基吡啶陽離子聚電解質(zhì)的合成步驟(1)用芘甲醇和三溴化磷制備芘甲溴；(2)將芘甲溴按一定的單體摩爾比接枝到聚4-乙烯基吡啶上；(3)將步驟(2)的產(chǎn)物用溴代正丁烷季氨化得到水溶性陽離子聚電解質(zhì)。該聚電解質(zhì)與單鏈核酸在緩沖液中通過靜電及疏水作用互相吸附形成復(fù)合探針，實(shí)驗(yàn)中通過熒光變化來檢測目標(biāo)單鏈DNA堿基與探針DNA是否互補(bǔ)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是合成路線簡單，容易操作，成本低，且探針對DNA的特異性識別快速、靈敏。
文檔編號C12N15/10GK102864143SQ20121036385
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月26日
發(fā)明者王國杰, 張瑞辰, 楊領(lǐng)葉, 趙敏, 董杰 申請人:北京科技大學(xué)