專利名稱：條件表達(dá)治療蛋白的載體，包含所述載體的宿主細(xì)胞，及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療疾病和紊亂的基因治療來源，所述疾病和紊亂例如癌癥、溶酶體貯積癥、眼病、肝病或傳染病。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供免疫細(xì)胞或治療支持細(xì)胞(TSC)的工程改造以表達(dá)一種或多種治療蛋白(例如，免疫調(diào)節(jié)劑)和使用所述細(xì)胞作為治療。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明包含用于條件表達(dá)本文所公開治療蛋白(例如，免疫調(diào)節(jié)劑(immunodulator))例如IL_12、TNF_a的載體，例如腺病毒，以及使用這些載體的方法。
背景技術(shù)：
白介素12(IL_12)是參與引起很多生物過程的I型細(xì)胞因子家族成員，所述生物過程包括但不限于保護(hù)性免疫反應(yīng)和腫瘤發(fā)生的抑制(Abdi等，2006;Adorini, 1999;Adorini,2001;Adorini 等，2002;Adorini 等，1996;Akhtar 等，2004;Akiyama等，2000;Al-Mohanna 等，2002;Aliberti 等，1996;Al Iavena 等，1994;Alli 和Khar, 2004;Alzona 等，1996;Amemiya 等，2006;Araujo 等，2001;Arulanandam 等，1999;Athie 等，2000;Athie-Morales 等，2004;Bertagnolli 等，1992;Bhardwaj 等，1996;Biedermann 等，2006;Brunda 和 Gately,1994;Buchanan 等，1995;Romani 等，1997;Rothe 等，1996;Satoskar 等，2000;Schopf 等，1999;Thomas 等，2000;Tsung 等，1997 ;ffolf等，1994; Yuminamochi等,2007)。越來越多的證據(jù)提示IL-12可以是控制人類疾病(如癌癥)的有希望的靶標(biāo)。盡管事實(shí)上根據(jù)其對I型抗腫瘤NK細(xì)胞、⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞的潛在支持活性，IL-12是有希望的癌癥治療試劑(Trinchieri，2003)，但報道的患者中重組人IL-12(rhIL-12)的毒性(Atkins等，1997)與臨床應(yīng)用的有限GMP級rhIL_12來源共同妨礙基于IL-12治療方案的成功。因此，基因治療方案可代表更安全、更加可維持的治療選擇看起來是合乎情理的。確實(shí)，發(fā)現(xiàn)實(shí)施瘤內(nèi)或瘤周遞送重組病毒(Sangro等,2004; Triozzi等，2005)或基于質(zhì)粒IL-12cDNA (Heinzerling等，2005)或IL-12基因修飾的自體成纖維細(xì)胞(Kang等，2001)的I期臨床試驗(yàn)安全并良好耐受。然而，接受這些基因治療的黑素瘤或各種癌癥患者中的對象(objective)臨床反應(yīng)罕見、可變、短暫并且主要集中在治療位點(diǎn)(Heinzerling等,2005; Kang等,2001; Sangro等，2004; Triozzi等，2005)。在疾病部分或全部解決的示例中，已經(jīng)注意到癌癥浸潤淋巴細(xì)胞的頻率增加(Heinzerling等,2005; Sangro等,2004)和循環(huán)腫瘤特異Q38+T細(xì)胞的水平增高(Heinzerling等,2005),與這些患者中抗原特異T細(xì)胞的交叉激活提高一致。因?yàn)樗鎏禺怲細(xì)胞的交叉激活最好通過作為天然但調(diào)控的IL-12來源的樹突細(xì)胞(DC)來完成(Berard等，2000)，關(guān)于基于DC的IL-12基因治療的優(yōu)越的臨床前功效的近期報道引起極大的興趣(Satoh等，2002; Tatsumi等,2003; Yamanaka等,2002)。例如，顯示了腫瘤內(nèi)(1.t.)注射工程改造的DC以生產(chǎn)IL-12p70(通過重組腺病毒感染)造成廣泛反應(yīng)性腫瘤特異CD8+T細(xì)胞庫的交叉激活顯著提高，這與鼠模型中腫瘤排斥一致(Tatsumi等，2003)。鑒于原先使用基于CMV啟動子的編碼mIL_12的重組腺病毒(rAd.cIL12, (Tatsumi等，2003))，經(jīng)工程改造DC的IL-12生成是組成型的，因此，在治療結(jié)果方面沒有解決早期腫瘤損傷內(nèi)和晚期腫瘤引流淋巴結(jié)內(nèi)的所述細(xì)胞因子的所述免疫影響。因此，需要工程改造用于條件表達(dá)IL-12的DC，以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和轉(zhuǎn)基因活化時間。本發(fā)明提供用于這些細(xì)胞的有希望的治療結(jié)果。核酸序列在患者宿主細(xì)胞或合適生理環(huán)境下表達(dá)前，目前臨床前或臨床試驗(yàn)中研究的很多治療蛋白在患者中存在時沒有顯示有害的副作用。然而，一些蛋白例如腫瘤壞死因子(TNF)在正常生理組織或環(huán)境下表達(dá)時(例如，暴露于非靶標(biāo)組織)，造成有害的副作用。所述蛋白的系統(tǒng)或甚至局部施用對很多非癌癥細(xì)胞類型極其有毒，增強(qiáng)過敏和惡病質(zhì)。另外，對TNFa的長時間暴露可以產(chǎn)生與急性刺激極為不同的細(xì)胞反應(yīng)?；谶@些原因，針對癌癥的安全和有效的THFa治療仍然難以捉摸?？紤]到與通過包含感興趣核酸序列所編碼蛋白的載體組合物的基因的基因表達(dá)相關(guān)問題，仍需要用于直接注射或用于基于細(xì)胞治療的經(jīng)改善轉(zhuǎn)移載體組合物。溶酶體貯積癥(LSD)是一類可遺傳的遺傳病，能同時只被蛋白治療劑以酶替代療法的方式治療。LSD是一類49種基因遺傳病，特征為一種或多種溶酶體酶的缺乏造成溶酶體內(nèi)未消化大分子的積累。這些廢物的積累造成細(xì)胞內(nèi)溶酶體變大，產(chǎn)生細(xì)胞損傷和變性。器官和組織中積累的損傷造成物理和 /或精神狀態(tài)的進(jìn)行性退化，并且最終死亡。診斷通常在幼年完成。個體疾病的嚴(yán)重性不同，并且與缺陷基因生成的殘留酶活性量相關(guān)。LSD的發(fā)病率是5000人中約有I例(世界范圍130，000例)。嚴(yán)重性不同，并且與缺陷基因生成的殘留酶活性量相關(guān)。嚴(yán)重受影響的患者可能只活到十多歲，而較少受到嚴(yán)重影響的患者可以活到成年。酶替代療法是治療LSD的唯一可用方法。治療由靶向溶酶體和降解所積累廢物分子的活性蛋白的系統(tǒng)融合組成。LSD蛋白治療的示例包含用于法布里病(Fabry Disease)的Fabrazyme (健贊公司(Genzyme))、用于MPSII的Elaprase (希爾公司(Shire))、和用于龐培氏病(Pompe Disease)的Myozome (健贊公司)及用于高歇病(Gaucher Disease)的Cerezyme (健贊公司)。酶替代療法伴隨有某些缺點(diǎn)，例如需要翻譯后蛋白修飾、所述替代酶顯示體內(nèi)短的半衰期、和患者發(fā)展對所述替代酶的免疫反應(yīng)。因此，本領(lǐng)域仍需要酶替代療法和其替代方式以治療溶酶體貯積癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供在一個或多個啟動子控制下具有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的編碼蛋白的重組載體。在一個實(shí)施方式中，所述一個或多個啟動子是條件型。在另一個實(shí)施方式中，所述一個或多個啟動子是組成型。在另一個實(shí)施方式中，所述載體是編碼啟動子驅(qū)動的蛋白的腺病毒載體，所述啟動子能通過提供可溶小分子配體如二?；露鴹l件激活(例如，RG-115819、RG-115830或RG-115932)。這個載體能控制來自免疫細(xì)胞、TSC和來自直接注射包含治療蛋白的載體中的蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)表達(dá)。
在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于條件表達(dá)蛋白的載體，所述蛋白有一種或多種包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸的治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能，其中所述編碼基因開關(guān)的多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中，所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)編碼一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸連接到通過所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子。在一個實(shí)施方式中，所述治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN 或其亞基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF, IFN a、IFN Y、CCL3 (MIP-1a)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、CXCLl (MGSA a )、CCR7、CCL19 (MIP_3b)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IP-10)、CXCL12 (SDF-1)、CCL21 (6Ckine)、0X40L、4_1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB1、Flt3L、IFN^、TNFa、dnFADD、TGFa、PD-LlRNAi, PD-Ll 反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L, S100、CD40L、p53、存活素、p53_ 存活素融合、MAGE3、PSA 和 PSMA。 在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供用于表達(dá)有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和有包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸的IL-12功能的蛋白的載體，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)編碼有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的所述蛋白的多核苷酸，和(3)編碼有IL-12功能的蛋白的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一個多核苷酸連接到由配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子上。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述載體條件表達(dá)TNFa。在某些實(shí)施方式中，條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白功能的蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)如TNF a的所述載體例如腺病毒載體，還包含編碼信號肽的核酸序列。所述信號肽能是密碼子優(yōu)化。在其他實(shí)施方式中，所述載體還包含5’非翻譯區(qū)(UTR)、3’調(diào)節(jié)區(qū)或兩者，并且提高蛋白表達(dá)和/或總產(chǎn)率。本發(fā)明還提供生產(chǎn)細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞或TSC)群的方法，所述細(xì)胞表達(dá)有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白，通過用條件表達(dá)有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的重組載體修飾(例如轉(zhuǎn)染、電穿孔等)所述細(xì)胞，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)編碼一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)調(diào)節(jié)劑功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸連接到由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子上。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供生成細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞或TSC)群的方法，所述細(xì)胞表達(dá)有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，通過含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的重組載體修飾所述細(xì)胞，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，(2)編碼有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的所述蛋白的多核苷酸，和(3)編碼有IL-12功能的蛋白的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一個多核苷酸連接到由配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子上。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供某些方法，所述方法增加治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)如TNFa的表達(dá)，mRNA表達(dá)或蛋白表達(dá)，所述蛋白表達(dá)包含生成條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白功能的蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)和一種或多種調(diào)節(jié)序列的所述載體，其中所述一種或多種調(diào)節(jié)序列提高治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)例如TNFa的表達(dá)。本發(fā)明還提供細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞或TSC)群，所述細(xì)胞表達(dá)有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白，通過用條件表達(dá)有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的重組載體修飾(例如轉(zhuǎn)染、電穿孔等)所述細(xì)胞，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)編碼一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸連接到由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子上。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞或TSC)群，所述細(xì)胞表達(dá)有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，通過含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的重組載體修飾所述細(xì)胞，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，(2)編碼有一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸，和(3)編碼有IL-12功能的蛋白的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一個多核苷酸連接到由配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子上。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含兩個或多個本發(fā)明細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞或TSC)群的組合物，其中所述組合物中的每個細(xì)胞群表達(dá)一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)，所述蛋白與所述組合物中其他細(xì)胞群表達(dá)的一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)不同。在一個實(shí)施方式中，所述組合物包含兩個細(xì)胞群。在另一個實(shí)施方式中，所述組合物包含多于兩個細(xì)胞群。在另一個實(shí)施方式中，所述組合物包含三個細(xì)胞群。在另一個實(shí)施方式中，所述組合物包含四個細(xì)胞群。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供體外工程改造的細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC，包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)編碼有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸連接到通過所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供體外工程改造的細(xì)胞，例如免疫細(xì)胞或TSC，包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，(2)編碼有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸，和(3)編碼有IL-12功能的蛋白的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一個多核苷酸連接到通過所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子 。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供包含本發(fā)明的兩個或多個體外工程改造細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞或TSC)群的組合物，其中所述組合物中每個所述體外工程改造的細(xì)胞群包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)編碼有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸連接到通過所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子，并且其中所述組合物中每個體外工程改造的細(xì)胞群表達(dá)一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)，所述蛋白與所述組合物中其他體外工程改造的細(xì)胞群表達(dá)的一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)不同。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供含有兩個或多個體外工程改造的細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞或TSC)群的組合物，每個所述細(xì)胞群包含含有編碼基因開關(guān)的多核苷酸的載體，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，(2)編碼有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸，和(3)編碼有IL-12功能的蛋白的多核苷酸；其中(2)和(3)的至少一個多核苷酸連接到通過所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子。在一個實(shí)施方式中，所述組合物包含兩個體外工程改造的細(xì)胞群。在另一個實(shí)施方式中，所述組合物包含多于兩個體外工程改造的細(xì)胞群。在另一個實(shí)施方式中，所述組合物包含三個體外工程改造的細(xì)胞群。在另一個實(shí)施方式中，所述組合物包含四個體外工程改造的細(xì)胞群。本發(fā)明也提供包含如本文所述的細(xì)胞(例如免疫細(xì)胞或TSC)群的藥物組合物，或適于直接注射細(xì)胞群中沒有的表達(dá)載體(即直接注入)的藥物組合物。在一個實(shí)施方式中，所述編碼一種或多種有免疫調(diào)節(jié)劑功能的蛋白的多核苷酸受所述基因開關(guān)啟動子的控制，和所述編碼有IL-12功能的蛋白的多核苷酸受組成型啟動子的控制。在另一個實(shí)施方式中，編碼有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸和編碼有IL-12功能的蛋白的多核苷酸都受所述基因開關(guān)的多順反子啟動子控制。在另一個實(shí)施方式中，所述編碼有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸受所述基因開關(guān)的啟動子控制，和所述編碼有IL-12功能的蛋白的多核苷酸受與所述基因開關(guān)啟動子不同的條件啟動子控制。在另一個實(shí)施方式中，所述編碼有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸的基因調(diào)節(jié) 系統(tǒng)和有IL-12功能的的多核苷酸的基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)正交(orthogonal)。在另一個實(shí)施方式中，所述編碼每個蛋白的各多核苷酸的基因調(diào)節(jié)系統(tǒng)正交(orthogonal)。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明也提供癌癥治療，例如但不限于黑色素瘤，膠質(zhì)瘤，腎癌和前列腺癌，和本文表I中列舉的癌癥。IL-12基因療法當(dāng)用作重組cDNA載體時，顯示動物模型研究中的抗腫瘤效果(Faure等，1998; Sangro等,2005),但是當(dāng)用于基因修飾DC環(huán)境時，甚至更加如此(Satoh 等，2002; Svane 等，1999; Tatsumi 等，2003; Yamanaka等,2002)。然而，至今，實(shí)施質(zhì)?；虿《据d體的IL-12基因治療的人I期試驗(yàn)沒能在癌癥環(huán)境下實(shí)現(xiàn)持續(xù)的、對象臨床反應(yīng)(Heinzerling 等，2005; Kang 等，2001; Sangro 等，2004; Triozzi 等，2005)，如本文所述的基因治療提供有希望的治療方法。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動物中腫瘤的方法，包含如下步驟(a)向腫瘤微環(huán)境(在腫瘤周邊的區(qū)域)瘤內(nèi)給予或系統(tǒng)給予免疫細(xì)胞群、TSC群或本發(fā)明的載體(或其組合)，所述細(xì)胞群或載體被體外工程改造以條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白；和(b)向所述哺乳動物給予治療有效劑量的活化配體；從而誘導(dǎo)有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的表達(dá)和治療所述腫瘤。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動物中腫瘤的方法，包含如下步驟(a)向腫瘤微環(huán)境瘤內(nèi)給予免疫細(xì)胞群或TSC群，所述細(xì)胞群被體外工程改造以條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白；和(b)向所述哺乳動物給予治療有效劑量的活化配體；從而誘導(dǎo)有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的表達(dá)和治療所述腫瘤。
在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動物中腫瘤的方法，包含如下步驟(a)向腫瘤微環(huán)境瘤內(nèi)給予兩個或多個免疫細(xì)胞群或TSC群，所述細(xì)胞群被體外工程改造以條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白，其中每個免疫細(xì)胞群或TSC群表達(dá)不同組的一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)；和(b)向所述哺乳動物給予治療有效劑量的一種或多種活化配體；從而誘導(dǎo)有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的表達(dá)和治療所述腫瘤。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動物中腫瘤的方法，包含如下步驟(a)向腫瘤微環(huán)境瘤內(nèi)給予免疫細(xì)胞群或TSC群，所述細(xì)胞群被體外工程改造以條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，其中至少一種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)或IL-12功能的所述蛋白受由配體激活的條件啟動子控制；和(b)向所述哺乳動物給予治療有效劑量的活化配體；從而誘導(dǎo)有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和/或有IL-12功能的蛋白的表達(dá)和治療所述腫瘤。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動物中腫瘤的方法，包含如下步驟(a)向腫瘤微環(huán)境瘤內(nèi)給予兩個或多個免疫細(xì)胞群或TSC群，所述細(xì)胞群被體外工程改造以條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，其中每個免疫細(xì)胞群或TS C群表達(dá)不同組的一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白，其中至少一種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)或IL-12功能的所述蛋白受由配體激活的條件啟動子控制；和(b)向所述哺乳動物給予治療有效劑量的一種或多種活化配體；從而誘導(dǎo)有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和/或有IL-12功能的蛋白的表達(dá)和治療所述腫瘤。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動物中疾病或紊亂的方法，包含如下步驟(a)給予所述哺乳動物修飾的細(xì)胞群，所述細(xì)胞群經(jīng)修飾以條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白；和(b)向所述哺乳動物給予治療有效劑量的活化配體；從而誘導(dǎo)有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的表達(dá)和治療所述疾病或紊亂。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動物中疾病或紊亂的方法，包含如下步驟(a)給予所述哺乳動物兩個或多個修飾細(xì)胞群，所述細(xì)胞群經(jīng)修飾以條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白，其中每個修飾細(xì)胞群表達(dá)不同組的一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)；和(b)向所述哺乳動物給予治療有效劑量的一種或多種活化配體；從而誘導(dǎo)有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的表達(dá)和治療所述疾病或紊亂。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動物中疾病或紊亂的方法，包含如下步驟(a)給予所述哺乳動物修飾細(xì)胞群，所述細(xì)胞群經(jīng)修飾以條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，其中至少一種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)或IL-12功能的所述蛋白受由配體激活的條件啟動子控制；和(b)向所述哺乳動物給予治療有效劑量的活化配體；從而誘導(dǎo)有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和/或有IL-12功能的蛋白的表達(dá)和治療所述疾病或紊亂。在另一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供治療哺乳動物中疾病或紊亂的方法，包含如下步驟(a)給予所述哺乳動物兩個或多個修飾細(xì)胞群，所述細(xì)胞群經(jīng)修飾以條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和有IL-12功能的蛋白，其中每個修飾細(xì)胞群表達(dá)不同組的一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白，其中至少一種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)或IL-12功能的所述蛋白受由配體激活的條件啟動子控制；和(b)向所述哺乳動物給予治療有效劑量的一種或多種活化配體；從而誘導(dǎo)有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和/或有IL-12功能的蛋白的表達(dá)和治療所述疾病或紊亂。本發(fā)明也提供測定基于工程改造細(xì)胞如免疫細(xì)胞或TSC的治療功效的方法，所述方法通過測量患者在開始治療前的IFNy表達(dá)水平或活性，從而生成對照水平，然后給予工程改造細(xì)胞以表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和可選有IL-12功能的蛋白的細(xì)胞，給予有效量的活化配體，和然后測量IFNy表達(dá)水平以生成測試水平，并且比較所述對照水平和測試水平以測定所述治療方案是否有效。還包含在有此需要的哺乳動物中治療腫瘤、降低腫瘤大小或防止腫瘤形成的方法，包含(a)在所述哺乳動物中給予治療有效劑量的條件表達(dá)至少一種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)如IL-12、TNF_a的載體，(b)給予所述哺乳動物治療有效劑量的一種或多種活化配體，其中所述活化配體激活有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白表達(dá)并且治療所述腫瘤。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供測定患者中基于體外工程改造細(xì)胞如免疫細(xì)胞或TSC的治療方案功效的方法，包含(a)在給予體外工程改造的細(xì)胞前，從所述有此需要的患者獲得的第一生物樣品中測量干擾素Y (IFNy)的表達(dá)水平或活性水平或兩者，從而生成對照水平；(b)給予有此需要的患者體外工程改造的細(xì)胞，所述細(xì)胞工程改造以條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白和可選有IL-12功能的蛋白；(c)給予所述有此需要的患者治療有效量的活化配體；(d)在給予體外工程改造的免疫細(xì)胞和活化配體后，從所述有此需要的患者獲得的第二生物樣品中測量IFNy的表達(dá)水平或活性水平或兩者，從而生成測試水平；和(e)比較IFN Y的所述 對照水平和測試水平，其中IFNy的表達(dá)、活性或兩者的測試水平相對于對照水平的增加指示所述治療方案對所述有此需要的患者有效。在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供在有此需要的哺乳動物中治療腫瘤、降低腫瘤大小或防止腫瘤形成的方法，包含(a)向腫瘤微環(huán)境瘤內(nèi)給予條件表達(dá)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的載體，所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)編碼一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸操作性連接到通過所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子，其中所述一種或多種治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)選自IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN 或其亞基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF, IFN a、IFN Y、IFN a1、IFN α 2、IL-15-R-a、CCL3(MIP_la)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、CXCLl (MGSA a )、CCR7、CCL19 (MIP-3b)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IP-10)、CXCL12 (SDF-1)、CCL21 (6Ckine)、0X40L、4-1BBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB1、Flt3L、IFNβ、TNF a、dnFADD、BCG、TGFa、PD-LlRNA1、PD-Ll 反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L、S100、CD40L、0X40L、p53、存活素、p53-存活素融合、MAGE3，PSA和PSMA，其中所述載體不包含在細(xì)胞內(nèi)；和(b)給予所述哺乳動物治療有效量的一種或多種活化配體；從而誘導(dǎo)一種或多種有治療蛋白(例如免疫調(diào)節(jié)劑)功能的蛋 白的表達(dá)和治療腫瘤。本發(fā)明也提供在有此需要的哺乳動物中治療疾病的方法，包含(a)給予所述哺乳動物載體以條件表達(dá)蛋白，所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)操作性連接由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子所激活啟動子的編碼一種或多種蛋白的多核苷酸，其中，所述載體不包含在細(xì)胞內(nèi)；和(b)給予所述非人的動物治療有效量的一種或多種活化配體，從而誘導(dǎo)一種或多種蛋白的表達(dá)和治療所述疾病。本發(fā)明也提供在有此需要的哺乳動物中治療溶酶體貯積癥的方法，包含(a)給予所述哺乳動物載體以條件表達(dá)一種或多種蛋白，所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)操作性連接由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子所激活啟動子的編碼一種或多種蛋白的多核苷酸，其中所述載體在體內(nèi)給予前不包含在細(xì)胞內(nèi)；和(b)給予所述哺乳動物治療有效量的一種或多種活化配體；從而誘導(dǎo)一種或多種蛋白的表達(dá)和治療所述溶酶體貯積癥。本發(fā)明也提供在有此需要的哺乳動物中治療肝病的方法，包含(a)給予所述哺乳動物載體以條件表達(dá)蛋白，所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)操作性連接由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子所激活啟動子的編碼一種或多種蛋白的多核苷酸，其中所述載體在體內(nèi)給予前不包含在細(xì)胞內(nèi)；和(b)給予所述非人的動物治療有效量的一種或多種活化配體，從而誘導(dǎo)一種或多種蛋白的表達(dá)和治療所述肝病。附圖詳細(xì)說明

圖1顯示編碼hIL-12的雙順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖。圖2顯示編碼hIL-21和hIL_15的雙順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖。
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3顯示編碼mIL-12的雙順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖。
4顯示編碼mIL-21和mIL-15的雙順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒
5顯示hIL-21的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖。
6顯示mIL-21的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒圖。
7顯示編碼hIL-12和hIL-21的三順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒
8顯示編碼mIL-12和mIL-21的三順反子轉(zhuǎn)錄物的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的質(zhì)粒
9顯示載體rAd. RheoIL12的結(jié)構(gòu)，其中刪除El和E3區(qū)且RheoSwitdi 治療系統(tǒng)(RTS)-1L-12組分取代所述El區(qū)。標(biāo)記〃IL12〃的盒代表由IRES分開的IL_12p40和IL~12p35編碼序列。圖10顯示翻譯、轉(zhuǎn)錄后、翻譯和翻譯后過程的匯總圖。圖11顯示用產(chǎn)物支點(diǎn)(pivot)表示的模塊元件。圖12顯示有開關(guān)的腺病毒相容ULTRAVECTOR旬主鏈和誘導(dǎo)型模塊合成基因的示意圖。圖13顯示包含TNFwt 5’ UTR、TNFwtUV信號肽、TNFwt UV開放閱讀框(ORF)和SV40e+pA的3’調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43318)。圖14 顯示包含 TNFwt 5’ UTR、TNFoptUV 信號肽、TNFopt UV ORF 和 SV40e+pA 的3’調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43319)。圖15 顯示包含 TNFwt 5，UTR、IL_2optUV 信號肽、TNFoptUV ORF 和 SV40e+pA 的3’調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43320)。圖16 顯示包含 5U25’ UTR、TNFwtUV 信號肽、TNFwtUV ORF 和 SV40e+pA 的 3’ 調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43321)。圖17 顯示包含 5U25’ UTR、TNFoptUV 信號肽、TNFoptUV ORF 和 SV40e+pA 的 3’ 調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43322)。圖18 顯示包含 5U25’ UTR、IL_2optUV 信號肽、TNFoptUV ORF 和 SV40e+pA 的 3’ 調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43323)。圖19 顯示包含 TNFwt 5’ UTR,TNFwtUV 信號肽、TNFwtUV ORF 和 hGH+pA 的 3’ 調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43324)。圖20 顯示包含 TNFwt 5’ UTR,TNFoptUV 信號肽、TNFoptUV ORF 和 hGH+pA 的 3’ 調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43325)。圖21 顯示包含 TNFwt 5，UTR、IL_2optUV 信號肽、TNFoptUV ORF 和 hGH+pA 的 3，調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43326)。圖22 顯示包含 5U25’ UTR、TNFwtUV 信號肽、TNFwtUV ORF 和 hGH+pA 的 3’ 調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43327)。圖23 顯示包含 5U25’ UTR、TNFwtUV 信號肽、TNFwtUV ORF 和 hGH+pA 的 3’ 調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43328)。圖24 顯示包含 5U25’ UTR、TNFwtUV 信號肽、TNFwtUV ORF 和 hGH+pA 的 3’ 調(diào)節(jié)區(qū)的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43329)。圖 25 顯示包含 TNFwt 5’ UTR, TNFwtUV 信號肽、TNFwtUV ORF 和 TNFwt3’ UTR 的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43533)。圖26顯示包含TNFwt 5’ UTR,TNF全長ORF和TNFwt 3’ UTR的調(diào)節(jié)啟動子表達(dá)系統(tǒng)的腺病毒載體圖(載體43534)。圖27顯示通過1川￡0^\\__丨丁(’1丨電:配體有可變？了3組分(_/+)誘導(dǎo)的載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后，標(biāo)準(zhǔn)化TNF α分泌蛋白水平的圖示。圖28顯示通過Rl{EOSWIin丨..K:配體有可變ΡΤ3組分(-/+)誘導(dǎo)的載體轉(zhuǎn)染CHO-Kl細(xì)胞后，標(biāo)準(zhǔn)化TNF α分泌蛋白水平的圖示。圖29顯示ΗΕΚ293細(xì)胞轉(zhuǎn)染后TNF α分泌倍數(shù)的差異。圖30顯示5U25’UTR和wtUV TNF α 5’UTR之間的蛋白分泌差異。圖31是顯示小鼠B16R)黑素瘤模型中Ad-RTS-1L_12劑量反應(yīng)研究的線形圖。小鼠在第12天以lee7; lee8; lee9; 5ee9; IeelO; 5eel0病毒顆粒(vp))劑量單一注射Ad-RTS-1L-12來治療，并且配體在第11天開始使用飼料遞送。x軸顯示腫瘤細(xì)胞接種后的天數(shù)和y軸指示腫瘤體積。劑量水平顯示抗腫瘤的實(shí)質(zhì)效果。指示了與對照相比的腫瘤下降％。圖32是顯示體重隨研究時程改變的線形圖。用I軸上％體重顯示所述改變。圖33A和33B的線形圖顯示Ad-RTS_mIL12在Lewis小鼠肺癌(LLC)模型中的抗腫瘤活性(圖33A)和安全性(圖33B)。Lewis肺癌在免疫活性C57b/6小鼠中皮下生長。當(dāng)所述腫瘤達(dá)到期望的大小時，開始所述治療。在腫瘤細(xì)胞接種后第6、9、13天，動物接受單個劑量的AdRTS-mIL12 (IelOvp)。相對于對照動物，有活化因子的Ad-RTS_mIL12顯示明顯的抗腫瘤活性。沒有注意到大的毒性。圖34A和34B的線形圖顯示小鼠黑素瘤(B16R))模型中的功效(圖34A)和安全性(圖34B)，其中動物用Ad-RTS-mIL12治療。腫瘤在C57b/6小鼠的腋下s. c發(fā)展。在細(xì)胞接種后第13天(箭頭)，瘤內(nèi)給予單個劑量的Ad-RTS-mIL12 (IelOvp)。在載體注射前24小時給予所述活化因子配體(50、100、250、500、750和1000mg/kg)，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。用百分比指示所述腫瘤生長抑制并與對照動物作比較。Ad-RTS-1L12顯示有廣泛活化因子劑量窗口的治療優(yōu)點(diǎn)。所述治療耐受良好。圖35A和35B的線形圖顯示小鼠結(jié)腸癌(CT26Luc)模型中Ad-RTS_mIL12的功效(圖35A)和安全性(圖35B)。鼠結(jié)腸腫瘤在Balb/C小鼠腋下區(qū)域皮下生長。在細(xì)胞接種后第11天和18天，動物用Ad-RTS-mIL12以lelOvp/lOOul劑量水平瘤內(nèi)(1. t.)治療兩次(箭頭)。在載體注射前24小時起始活化因子。在整個實(shí)驗(yàn)中監(jiān)控腫瘤體積和體重。Ad-RTS-mIL12治療造成相對于對照動物的顯著腫瘤生長抑制(100%)。值得注意地是，所有用Ad-RTS-mIL12加活化因子治療的動物都沒有腫瘤。圖36A和36B的線形圖顯示胰腺癌(PAN02)模型中Ad-RTS_mIL12的功效(圖36A)和安全性(圖36B)。在細(xì)胞接種后第7天和14天，皮下PAN02荷瘤小鼠用lelOvp/lOOul劑量水平的單個劑量Ad-RTS-mIL12在瘤內(nèi)(1. t.)治療(箭頭)。在載體給予前一天，向動物提供所述活化因子飼料，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。對照或單獨(dú)載體組只接受正常的嚙齒動物飼料。結(jié)果表明相對于對照動物，所述Ad-RTS-1L12顯示明顯的抗腫瘤活性(97%)。Ad-RTS_IL12治療的結(jié)果是沒有發(fā)現(xiàn)大的體重改變。圖37 是 AD-RTS-mIFN α 的載體圖。圖38 是 AD-RTS-mTNF α 的載體圖。圖39Α和39Β的線形圖顯示乳腺癌(4Τ1)模型中Ad-RTS_mIL12的功效(圖39A)和安全性(圖39B)。所述4T1腫瘤在BALB/C小鼠腋下皮下(s. c)生長。荷瘤小鼠隨機(jī)分成四組，每組5只；對照沒有治療、僅活化因子配體(L)、僅Ad-RTS-mIL12和有活化因子配體的Ad-RTS-mIL12。在三個不同時間點(diǎn)，瘤內(nèi)給予IelOv. p./100 μ I PBS劑量水平的單個Ad-RTS-mIL12注射(箭頭)。在載體注射前24小時，通過飼料給予所述活化因子配體，直到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。用平均值土SE顯示腫瘤大小(體積)和體重(%)。沒有治療的動物(對照)中，腫瘤快速生長。相對于對照，僅用活化因子配體或沒有活化因子配體的三個Ad-RTS-mIL12劑量治療分別有22%和35%的輕微腫瘤生長抑制。值得注意地是，用Ad-RTS-1L12加活化因子配體治療與沒有治療的對照動物相比，造成82%的顯著腫瘤生長抑制。在任何治療中沒有發(fā)現(xiàn)大的體重減輕。圖40是干擾素a -2a的載體圖。詳細(xì)序列說明治療蛋白 細(xì)胞因子就針對感染的炎癥反應(yīng)而言重要的細(xì)胞因子白介素I (IL-1)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號M28983 (人IL-1 α ) ； Μ15330 (人IL-1 β ) ; AF201830 (人IL-1 δ ) ；AF20 183 I (人 IL-1 ε ) ；AF20 1832 (人 IL-1 ζ ) ;AF20 1833 (人IL-1 η);ΝΜ_010554(小鼠 IL-1α);ΝΜ_008361(小鼠 IL-1β);ΝΜ_019451(小鼠L-1 δ)； □ ΝΜ_019450(小鼠 IL_lf6);ΝΜ_027163(小鼠 IL_lf8);ΝΜ_153511(小鼠IL-lf9) ;NM_204524(雞 IL-1 β ) ;NM_017019 (大鼠 IL-1 α )；和 NM_031512 (大鼠 IL-1 β )，這些序列通過引用納入本文。白介素I (IL-1)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAA59134(人IL-Ια)；AAA59 1 35 (人 I L-1 β );AAF252 I O(人 I L-1 δ );AAF252 I I (人IL-1 ε ) ； AAF25212 (人 1L-1 ζ ) ; AAF25213 (人 IL-1 n) ;NP_034684 (小鼠IL-1 a )；NP_032387(小鼠 IL-1β);ΝΡ_062324(小鼠 L-1 δ); 口 □ ΝΡ_062323(小鼠 IL-lf6);NP_081439(小鼠 IL-lf8);NP_705731 (小鼠 IL-lf9);NP_989855(雞IL-Ιβ) ;NP_058715(大鼠IL-1 a );和NP_113700 (大鼠IL-1 β )，這些序列通過引用納入本文。Laurent等，Psychiatr. Genet. 7:103 (1997)鑒定人白介素I β中的多態(tài)突變。屬于細(xì)胞因子家族的包含IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21的白介素2(IL-2)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號U25676(人)；NM_008366(小鼠)；NM_204153(雞)；和NM_053836(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。白介素2(IL_2)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAA70092 (人)；NP_032392 (小鼠);NP_989484 (雞)；和 NP_446288 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。Liu 等，Appl. Biochem. Biotechnol. 133:77 (2006)生成突變?nèi)?IL-2,和Lorberboum 等，J. Biol. Chem. 265:16311 (1990)描述嵌合 IL—2 的生成。
誘導(dǎo)天然輔助T細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞的細(xì)胞因子白介素4 (IL-4)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號M23442(人)；NM_021283(小鼠)；NM_001007079(雞)；和NM_201270(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。白介素4(IL_4)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAA59I5CK 人);ΝΡ_067258 (小鼠);NPJKnOO7O8O (雞);和 NP_%8427(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。Kawashima等，J. Med. Genet. 35:502 (1998)描述與特應(yīng)性皮炎相關(guān)的IL-4基因的多態(tài)性。白介素7(IL_7)是對B和T細(xì)胞發(fā)育重要的細(xì)胞因子。IL_7的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號J04156(人)；NM_008371(小鼠)；ΝΜ_001037833 (雞)；和NM_013110(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。白介素7(IL_7)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAA59156(人);NP_032397 (小鼠);NP_001032922 (雞);和 NP_037242(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。Feng等，Genetics 175:545(2007)鑒定出造成功能缺陷的IL-7的點(diǎn)突變。白介素9(IL_9)是由T細(xì)胞生成的細(xì)胞因子和造血細(xì)胞的調(diào)節(jié)劑。IL_9的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_000590(人)；NM_008373(小鼠)；NM_001037825(雞)；和NM_001105747 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。白介素9(IL_9)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_000581(人)；NP_ 032399(小鼠)；NP_001032914 (雞)；和 NP_001099217 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。IL-12是細(xì)胞因子，能作為活化T和NK細(xì)胞的生長因子，增強(qiáng)NK/淋巴因子激活殺傷細(xì)胞的裂解活性，并且通過使外周血單核細(xì)胞(PBMC)休止來刺激IFNy生成。IL-12的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_000882(人IL12A) ;NM_002187(人IL12B);NM_008351(小鼠 IL12a);NM_008352(小鼠 IL12b);NM_213588(雞IL12A) ;NM_213571 (雞 IL12B) ;NM_053390 (大鼠 IL12a);和 NM_022611 (大鼠 IL12b)，這些序列通過引用納入本文。白介素12(IL_12)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_000873 (人IL12A) ;NP_002178 (人 IL12B) ;NP_032377 (小鼠 ILl2a) ;NP_032378 (小鼠IL12b);NP_998753(雞 IL12A);NP_998736(雞 IL12B);NP_445842(大鼠 IL12a);和NP_072133(大鼠IL12b)，這些序列通過引用納入本文。白介素15 (IL-15)是調(diào)節(jié)T和自然殺傷細(xì)胞活化和增殖的細(xì)胞因子。IL-15的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號U14407(人)；NM_008357(小鼠)；EU334509(雞)；和AFO 15719(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。白介素15(IL_15)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAA21551(人);NP_032383(小鼠);ABY55312(雞);和 AAB94536 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。巨噬細(xì)胞生成的細(xì)胞因子白介素18(IL_18)與白介素12 —起在微生物產(chǎn)物感染后，誘導(dǎo)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫。IL-18的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號U90434(人);NM_008360 (小鼠);EU747333(雞);和AY258448 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。白介素18(IL_18)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAB50010(人);NP_032386(小鼠);ACE79188(雞);和 AAP14669 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。通過誘導(dǎo)細(xì)胞增殖對免疫系統(tǒng)細(xì)胞(包含自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞)有潛在調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子白介素21 (IL-21)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AF254069(人)；NM_021782(小鼠)；NM_001024835(雞)；和 NM_001108943 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。白介素21(IL_21)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAG29348(人)；NP_068554 (小鼠)；NP_00 IO2OOO6 (雞)；和 NP_001102413 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。白介素27(IL_27)是在調(diào)節(jié)B和T淋巴細(xì)胞活性中起重要作用的細(xì)胞因子。IL-27的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AY099296(人)；NM_145636(小鼠)；和XM_344962(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。白介素27(IL_27)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAM34498(人)；NP_663611(小鼠);和XP_344963 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。結(jié)合特異細(xì)胞表面受體(IFNAR)的干擾素蛋白組成員并且刺激巨噬細(xì)胞和自然殺傷(NK)細(xì)胞以引發(fā)抗病毒反應(yīng)的干擾素Pl(IFNBl)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號 NM_002176(人)；NM_010510(小鼠)；NM_001024836 (雞)；和 NlLOl9I27 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。干擾素M(IFNBl)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_002167(人)；ΝΡ_034640 (小鼠)；NP_00 IO2OOO7 (雞)；和 ΝΡ_062000 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。干擾素Y (IFN-y)是可溶的細(xì)胞因子，是唯一的II型干擾素，并且有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤活性。IFN-Y的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號ΝΜ_000619(人)；ΝΜ_008337(小鼠);和ΝΜ_138880 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。干擾素Y (IFN-Y)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號ΝΡ_000610(人);ΝΡ_032363(小鼠);和ΝΡ_620235(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。影響脂質(zhì)代謝、凝結(jié)、胰島素抗性和內(nèi)皮細(xì)胞功能，主要由單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞分泌的多功能促炎癥細(xì)胞因子即腫瘤壞死因子(TNFa)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號Χ02910(人)；ΝΜ_013693(小鼠)；和BC107671 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。 TNF α的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號CAA26669 (人)；ΝΡ_038721 (小鼠)；和ΑΑΙ07672(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。人TNF α (本文縮寫為hTNFa，或簡單的hTNF)是人細(xì)胞因子，以17kD可溶形式(sTNFa)和26kD膜結(jié)合形式(tmTNF a )存在，其生物活性形式由非共價結(jié)合的17kD分子三聚體構(gòu)成。例如，hTNF α結(jié)構(gòu)描述于Pennica, D.等(1984) Nature312:724-729;Davis, J. Μ.等(1987)Biochemistry 26:1322-1326;和 Jones, Ε.Y.等(1989) Nature 338:225-228。TNFa 可以結(jié)合 I 型 TNF 受體(TNFR-1)或 2 型 TNF 受體(TNFR-2)，并且參與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞、誘導(dǎo)凋亡或炎癥或抑制腫瘤發(fā)生或病毒復(fù)制。TNF/TNFR結(jié)合生成的細(xì)胞信號級聯(lián)反應(yīng)描述于例如Wajant, H.等(2003)Cell DeathDiffer. 10(I):45-65 或 Chen, G.等(2002)Science296:1634-5。全長人TNFa多肽由胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞外結(jié)構(gòu)域組成。據(jù)報道人TNFa的多肽序列是233aa的多肽序列且在本文稱為SEQ ID N0:37，其具有SEQ ID N0:37氨基酸1-35的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、SEQ ID NO: 37氨基酸36-56的跨膜結(jié)構(gòu)域、和SEQ ID NO: 37氨基酸57-233的胞外結(jié)構(gòu)域。SEQ ID N0:37是編碼SEQ ID NO: 35或36的核苷酸序列。人TNF α變體包括但不限于有下列一種或多種突變的多肽L105S、R108W、L112F、A160V、S162F、V167A、E222K、F63S、PSD84-86VNR 或 E183R。趨化因子趨化因子(C基序)配體I (XCL1，也稱為淋巴細(xì)胞趨化因子)對⑶4+和⑶8+T細(xì)胞而不是單核細(xì)胞有趨化性，并且誘導(dǎo)外周血淋巴細(xì)胞中胞內(nèi)鈣的提高。XCLl的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_002995(人)；NM_008510(小鼠)；和NM_134361 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。XCLl的氨基酸序列可獲 自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_002986(人)；NP_032536(小鼠)；和NP_599188(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。美國專利號6，022，534公開了淋巴細(xì)胞趨化因子，并且用于吸引細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞，和/或誘導(dǎo)增殖或駐留細(xì)胞。也公開了抗淋巴細(xì)胞趨化因子抗體的分離和使用的方法，以及XCLl融合蛋白。參與多形核白細(xì)胞募集和活化中急性炎癥狀態(tài)的單核因子(主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞生成的細(xì)胞因子類型)CC趨化因子配體3(CCL3)(也稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白I(MIP-1)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_002983(人)；NM_011337(小鼠)；和NM_013025(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。CCL3的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_002974(人)；NP_035467(小鼠)；和NP_037157(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。參與炎癥和哮喘的促炎細(xì)胞因子CCL5 (RANTES)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AF043341(人)；NM_013653(小鼠);和NM_031116 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。CCL5的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAC03541 (人)；NP_038681 (小鼠)；和NP_112378(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。參與在炎癥和癌癥侵入中募集巨噬細(xì)胞的趨化因子CC趨化因子配體7(CCL7)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_006273(人)；NM_013654(小鼠)；和NM_001007612(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。CCL7的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_006264(人)；NP_038682(小鼠)；和NP_001007613(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。趨化因子(CXC基序)配體9(CXCL9，也稱為MIG)是由Y干擾素誘導(dǎo)的T細(xì)胞化學(xué)引誘物。CXCL9的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_002416 (人)；NM_0108599 (小鼠)；和NM_145672(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。CXCL9的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_002407(人)；NP_032625(小鼠)；和NP_663705(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。趨化因子(C-X-C基序)配體10(CXCL10)是在免疫系統(tǒng)細(xì)胞化學(xué)趨向、T細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞粘附、抗腫瘤活性和血管生成中起作用的小細(xì)胞因子。CXCLlO的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號X02530(人)；NM_021274(小鼠)；和BC058444(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。趨化因子(C-X-C基序)配體10 (CXCLlO)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號CAA26370(人)；NP_067249(小鼠);和AAH58444(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。趨化因子(C-X-C基序)配體12(CXCL12)也稱為間質(zhì)細(xì)胞衍生因子I (SDF-1)，是屬于間分泌素(intercrine)家族的小細(xì)胞因子，其成員活化白細(xì)胞并且常由促炎刺激如LPS、TNF或ILl誘導(dǎo)。CXCL12的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_000609(人);NM_001012477(小鼠);NM_204510(雞);和 ΝΜ_001033883 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。CXCL12的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_000600(人)；NP_001012495(小鼠)；NP_989841 (雞)；和 NP_001029055 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。Hansson 等,Microbes and Infection 8:841(2006)討論了趨化因子(C-C 基序)受體7(CCR7)和趨化因子(C-C基序)配體19(CCL19，也稱為ΜΙΡ-3β)間的相互作用對產(chǎn)生初次免疫反應(yīng)關(guān)鍵。CCR7的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號ΝΜ_001838(人)；和ΝΜ_007719(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。CCR7的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號ΝΡ_001829(人)；和ΝΡ_031745(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。

CCL19的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號ΝΜ_006274 (人)；和ΝΜ_011888(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。CCL19的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號ΝΡ_006265 (人)；和ΝΡ_036018(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。CC趨化因子配體21(CCL21)是對⑶4+而不是⑶8+T細(xì)胞達(dá)到其穩(wěn)定狀態(tài)“設(shè)定點(diǎn)”必需的已充分確立CCR7配體，并且干擾CCL21表達(dá)可能改變對自身免疫的易感性，其多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AB002409(人)；NM_011335(小鼠CCL21a) ;NM_011124(小鼠CCL21b);和NM_023052 (小鼠CCL21c);這些序列通過引用納入本文。CCL21的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號BAA21817(人)；NP_035465(小鼠CCL21a) ;NP_035254(小鼠CCL21b);和NP_075539(小鼠CCL21c)，這些序列通過引用納入本文。白介素8(IL_8)是趨化因子，也稱為嗜中性粒細(xì)胞活化肽I或SCYB8，是數(shù)種細(xì)胞響應(yīng)炎性刺激而分泌的組織衍生肽。美國專利號6，133，426和6，177，980公開了人源化抗IL-8抗體的氨基酸和多核苷酸序列。人IL-8的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_000584,其序列通過弓I用納入本文。人IL-8的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_000575，其序列通過引用納入本文。
生長因子粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)是用作白細(xì)胞生長因子的細(xì)胞因子，刺激干細(xì)胞生成粒細(xì)胞(嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞)和單核細(xì)胞。GM-CSF的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號M11734(人)；NM_009969(小鼠)；EU520303(雞)；NM_001037660(大鼠 Csf 2ra);和 NM_133555 (大鼠 Csf2rb)，這些序列通過引用納入本文。粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號 AAA52122(人);NP_034099 (小鼠);ACBl 1534(雞);ΝΡ_001032749 (大鼠 Csf2ra);和NP_598239 (Csf2rb)，這些序列通過弓I用納入本文?？梢杂米髟煅杉?xì)胞或祖細(xì)胞或兩者的生長因子受體的FMS相關(guān)酪氨酸激酶配體(FLT3/FLK2配體，F(xiàn)lt3L)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號U04806 (人)；和NM_013520(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。FLT3/FLK2配體 (Flt3L)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAA17999 (人);和NP_038548(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。轉(zhuǎn)化生長因子a (TGFa)在一些人類癌癥中上調(diào)，能在培養(yǎng)細(xì)胞中可逆賦予轉(zhuǎn)化表型，其多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號ΝΜ_001099691(人)；ΝΜ_031199(小鼠)；ΝΜ_001001614(雞)；和ΝΜ_012671 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。TGFa的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號ΝΡ_001093161(人);ΝΡ_112476 (小鼠);ΝΡ_001001614 (雞);和 ΝΡ_036803 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。佐劑β防御素是參與針對很多革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌、真菌和病毒的先天免疫反應(yīng)的抗微生物肽。β防御素的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號Χ92744(人hBD-1);AJ000152(人 hBD_2);AF217245(人 β 防御素-3);AJ314835(人 β 防御素-4);ΑΒ089180(人 hBD_5);AY122466(人防御素 β 106, DEFB106);AF540979(人β 防御素 107，DEFB107) ;AF529416(人 β 防御素，DEFB108) ; DQ012014 (人 β 防
御素 110，DEFBl10)御素 112，DEFBl12)御素 I14，DEFBl14)
DQ012015(人 β 防御素 111，DEFB111);DQ012016(人 β防
DQ012017(人 β 防御素 113，DEFB113);DQ012018(人 β防
;DQ012019(人 β 防御素 115，DEFB115);DQ012020(人 β防御素 116，DEFB116);DQ012021 (人 β 防御素 117，DEFBl17);ΝΜ_007843(小鼠防御素β I) ;ΝΜ_010030(小鼠防御素β 2，Defb2) ;ΝΜ_013756(小鼠防御素 β 3，Defb3) ;ΝΜ_019728(小鼠防御素 β 4，Defb4) ; ΝΜ_030734 (小鼠防御素 β 5，Defb5) ;ΝΜ_054074(小鼠防御素 β 6，Defb6) ; ΝΜ_139220 (小鼠防御素β 7) ;ΝΜ_153108(小鼠防御素 β 8，Defb8) ;NM_139219(小鼠防御素 β 9，Defb9);和NM_139225(小鼠防御素β IO1DefblO);這些序列通過引用納入本文。β防御素的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號CAA63405(人hBD-1);CAB65126(人 hBD_2);AAF73853(人 β 防御素 _3);CAC85520(人 β 防御素-4);BAC10630(人 hBD_5);AAM93908(人防御素 β 106，DEFB106);AAN33115(人
β 防御素 107，DEFB107) ;AAQ09525(人 β 防御素，DEFB108) ; ΑΑΥ59750 (人 β防御素 110, DEFBl10); AAY59751 (λ β 防御素 111, DEFBl11)；AAY59752 (λ β 防
御素 112, DEFBl12); AAY59753 (λ β 防御素 113, DEFBl13)；AAY59754 (λ β 防
御素 114, DEFBl14); AAY59755 (λ β 防御素 115, DEFBl15)；AAY59756 (λ β 防
御素 116, DEFBl16); AAY59757 (λ β 防御素 117, DEFBl17)；NP_031869(小鼠防御素β1) ;NP_034160(小鼠防御素P2，Defb2) ;NP_038784(小鼠防御素β 3, Defb3) ;NP_062702(小鼠防御素 β 4, Defb4) ; NP_109659 (小鼠防御素 β 5，Defb5) ;NP473415 (小鼠防御素 β 6，Defb6) ;NP_631966 (小鼠防御素 β 7，Defb7) ; NP_694748 (小鼠防御素β 8，Defb8) ; NP_631965 (小鼠防御素β 9，Defb9);和NP_631971 (小鼠防御素β 1O1DefblO),這些序列通過引用納入本文。對于其他人和大鼠防御素肽序列，還參見美國專利號 5，242，902。高遷移率族蛋白I(HMGBl)是用作細(xì)胞因子的非組蛋白染色體蛋白，調(diào)節(jié)對壞死性細(xì)胞死亡和癌癥、病原體侵入、外傷和敗血癥的局部和系統(tǒng)反應(yīng)。HMGBl蛋白的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_002128(人)；NM_010439(小鼠)；NM_204902(雞)；和NM_012963(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。高遷移率族蛋白1 (HMGBl)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_002119(人)；NP_034569 (小鼠)；NP"0233(雞)；和 NPJ37O95 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。吞噬SlOO蛋白調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和募集炎癥細(xì)胞到組織損傷位點(diǎn)，其是對先天免疫重要的損傷相關(guān)分子模式(DAMP)分子的成員。參見Foell等，J. LeukocyteBiol. 81:1 (2006)。SlOO蛋白的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號BC014392 (人S100A1);BC002829(人 S100A2);BC012893(人 S100A3);BC016300 (人 S100A4);Z18954 (人S100D) ; BC001431 (人 S100A6) ; BC034687 (人 S100A7) ; BC005928 (人 S100A8) ; BC047681 (人S100A9) ;BC015973 (人 S100A10) ;D38583 (人 clagizzarin) ;NM_011309 (小鼠SlOOal);NM_009115(小鼠 SlOOb);NM_013650 (小鼠 S100a8);NM_009114 (小鼠S100a9);NM_011310(小鼠 S100a3);NM_011311(小鼠 S100a4);和 NM_011312(小鼠S100a5),這些序列通過引用納入本文。SlOO蛋白的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAH14392(人S100A1) ;AAH02829 (λ S 1OOA2) ;AAH12893 (人 S1OOA3);AAH163OO(人S100A4) ;CAA79479 (ASlOOD) ; AAH01431 (人 S100A6) ; AAH34687 (人 S100A7) ;AAH05928(人S100A8) ;AAH47681 (人 S1O0A9) ;AAHI 5973 (人 S100A1O) ; BAAO7597 (人clagizzarin);NP_035439 (小鼠 SlOOal);NP_033141(小鼠 SlOOb);NP_038678 (小鼠S100a8) ;NP_033140(小鼠 S100a9) ; NP_035440 (小鼠 S100a3) ; NP_035441 (小鼠 S100a4);和NP_035442(小鼠S100a5)，這些序列通過引用納入本文。植物多糖甘露聚糖是甘露糖的多聚物，用于產(chǎn)生免疫反應(yīng)。美國專利號5，807，559公開了可以用于針對腫瘤相關(guān)糖結(jié)構(gòu)或針對在傳染劑和/或感染宿主細(xì)胞上表達(dá)的糖結(jié)構(gòu)生成T細(xì)胞免疫的甘露聚糖免疫偶聯(lián)物美國專利號5，773，425公開了使用甘露聚糖減輕癥狀和/或治愈病毒疾病和增強(qiáng)免疫反應(yīng)?？ń槊?BCG)是活的減毒分枝桿菌(Mycobacterium)種,用作防止嚴(yán)重和致死結(jié)核的疫苗。美國專利號7，393，541公開了生成佐劑疫苗以在哺乳動物對象中產(chǎn)生針對分枝桿菌的體內(nèi)T細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)。也參見Hubbard和Collins, Infect. Tmmun. 59(2) :570。美國專利號5，292，513公開了用熱滅活BCG在需要增強(qiáng)殺菌和抗病毒活性的患者體內(nèi)激發(fā)巨噬細(xì)胞。BCG完整的基因組序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NC_008769(牛分支桿菌(M. bovis) BCG巴斯德種1173P2的完整基因組)。細(xì)菌脂多糖(LPS)是誘導(dǎo)革蘭氏陰性菌感染后強(qiáng)免疫反應(yīng)的內(nèi)毒素。美國專利號4，148，877公開了來自細(xì)菌培養(yǎng)的LPS分餾和使用所述組分作為藥物誘導(dǎo)對細(xì)菌感染的抗性。美國專利號5，292，513公開了在需要增強(qiáng)殺菌和抗病毒活性的患者體內(nèi)用LPS激發(fā)巨噬細(xì)胞。共刺激分子(陽性)0X40配體(0X40L)屬于腫瘤壞死因子(配體) 超家族成員4 (Tnfsf4)，在樹突細(xì)胞上表達(dá)并且促進(jìn)Th2細(xì)胞的分化。0X40配體的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號X79929(人)；U12763(小鼠);和AF037067 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。0X40配體的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號CAA56284(人)；AAA21871 (小鼠)；和AAC67236(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。4-1BB配體(4-1BBL)屬于腫瘤壞死因子(配體)超家族成員9 (Tnf sf9)，是2型跨膜糖蛋白并在活化T淋巴細(xì)胞上表達(dá)。4-1BBL的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_003811(人);NM_009404(小鼠);和AY332409 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。4-1BB配體(4-1BBL)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_003802(人)；NP_033430(小鼠);和AAQ01228 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。所述CD40蛋白屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員5，在調(diào)節(jié)廣泛免疫和炎癥反應(yīng)中重要，所述反應(yīng)包含T細(xì)胞依賴的免疫球蛋白類別轉(zhuǎn)換、記憶B細(xì)胞發(fā)育和和生發(fā)中心的形成。⑶40蛋白的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號X60592 (人)；NM_170701 (小鼠)；NM_204665(雞)；和NM_134360 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。⑶40蛋白的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號CAA43045(人)；NP_733802(小鼠)；和NP_989996 (雞)；和NP_599187 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。⑶40L (⑶40配體，或⑶154)主要在活化T細(xì)胞上表達(dá)，并且是TNF超家族分子的成員。其結(jié)合抗原呈遞細(xì)胞上的⑶40。⑶40L起共刺激分子的作用，并且在抗原呈遞細(xì)胞上誘導(dǎo)與T細(xì)胞受體刺激my MHC分子有關(guān)的抗原呈遞細(xì)胞活化。CD40L有三個結(jié)合伴侶⑶40、α5β1整聯(lián)蛋白和a IIbii 3。所述⑶40L序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號ΝΜ_000074 和 ΜΡ_000065 (人)和 ΝΜ_011616 和 ΝΡ_035746 (小鼠)。糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體家族成員相關(guān)蛋白(GITR)能通過T細(xì)胞刺激來誘發(fā)有效的腫瘤免疫。給予抗GITR單克隆抗體(mAb)能引起有效的腫瘤特異性免疫并在不引起明顯的自體免疫疾病情況下消除已建立的腫瘤。見Ko等，J. Exp.Med. 7:885(2005)。美國專利號 6，503，184Β1 公開了抗 GITR 抗體。GITR配體(GITRL)的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號ΑΥ358868 (人)；和ΑΥ359852(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。GITR配體(GITRL)的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號AAQ89227 (人)；和AAQ55265(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)(HVEM)結(jié)合配體(HSVgD)(也稱為p30)或LIGHT是參與T細(xì)胞共刺激的TNF家族成員。LIGHT有兩個受體，皰疹病毒進(jìn)入介質(zhì)(HVEM)和淋巴毒素β受體(LT- β R)。作為HVEM的配體，HSVgD通過用作T細(xì)胞的共刺激因子來活化T細(xì)胞，引起T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌。LIGHT的多核苷酸和氨基酸序列見美國專利號7，118，742。美國專利5，654，174描述了羧基末端殘基缺失的變體gD蛋白。⑶70是結(jié)合⑶27的細(xì)胞因子。其在T細(xì)胞活化中起作用。誘導(dǎo)共刺激T細(xì)胞增殖和提高溶細(xì)胞性T細(xì)胞的產(chǎn)生。CD70的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_001252(人);NM_011617(小鼠);和NM_001106878 (大鼠)，這些序列通過引用納入本文。⑶70的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_001243(人)；NP_035747(小鼠)；和NP_001100348(大鼠)，這些序列通過引用納入本文。ICOS-L是T細(xì)胞特異細(xì)胞表面受體ICOS的配體，并且用作T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌的共刺激信號。ICOS-L也誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和向漿細(xì)胞分化。ICOS-L在調(diào)節(jié)對炎性病癥的局部組織反應(yīng)和通過共刺激記憶T細(xì)胞功能調(diào)節(jié)第二免疫反應(yīng)中起重要作用。ICOS-L的多核苷酸序列可獲自公共 數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_015259 (人)；和NM_015790 (小鼠)，這些序列通過引用納入本文。ICOS-L的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_056074 (人)；和NP_056605(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。PD-Ll (也稱為⑶274)蛋白在活化的單核細(xì)胞、T和B細(xì)胞中表達(dá)。用IFNy處理后單核細(xì)胞中I3D-Ll上調(diào)，和用IFNy與其他活化因子一起處理后樹突細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞中ro-Ll上調(diào)。PD-Ll蛋白的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_014143 (人)■’和NM_021893(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。PD-Ll蛋白的氨基酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NP_054862 (人)；和NP_068693(小鼠)，這些序列通過引用納入本文。共刺激分子(陰性)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)4(CTLA4)是免疫球蛋白超家族的成員，并且是活化T細(xì)胞中表達(dá)的共刺激分子。美國專利號7，034, 121和6，984，720公開了針對CTLA4抗體的制備和使用方法。美國專利號6，984，720也公開了抗CTLA4抗體的重和輕鏈的氨基酸序列。PD-1分子是結(jié)合ro-1配體(ro-Ll)的免疫球蛋白基因超家族的成員。通過ro-Ll結(jié)合T細(xì)胞上的ro-1受體傳送共刺激信號到細(xì)胞，防止所述細(xì)胞通過細(xì)胞周期過程并且增加τ細(xì)胞增殖。抑制ro-Li和有抗ro-Li抗體的τ細(xì)胞受體之間的相互作用造成免疫反應(yīng)的下調(diào)，稱為免疫細(xì)胞無能(immune cellenergy)。美國專利號7，029，674公開了抗F1D-Ll抗體的制備和序列。PD-L2主要稱為ro-1配體(或人同源物ro⑶I)。然而，報道ro-12參與共刺激信號，對采用ro⑶I非依賴性方式的τ淋巴細(xì)胞增殖和IFNy生成重要。與ro⑶I的相互作用通過阻斷細(xì)胞周期進(jìn)展來抑制T細(xì)胞增殖，和細(xì)胞因子生成。Yamazaki等，J. ofImmunol. 169:5538(2002)和 Ansari 等，J. Exp. Med. 198:63(2003)描述了抗 PD-L2 單克隆抗體的制備。逆向免疫抑制劑(耐受性抑制劑)轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)是通過與兩個跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(I型和II型)之一的相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的多功能蛋白。見Chen等，Science28:1335(1993)。II型TGF受體(TGFR2)磷酸化和活化I型受體，I型受體自體磷酸化，然后結(jié)合和活化SMAD轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)物。Lynch MA等，CancerRes. 58:4227 (1998)描述了與人卵巢癌有關(guān)的II型轉(zhuǎn)化生長因子β受體基因(TGFBR2)的突變。Brand等，J. Biol. Chem. 268:11500-11503 (1993)描述了預(yù)測的絲氨酸/蘇氨酸激酶胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的缺失(TGF0R2cDNA H2-3FF的核苷酸1172-2036，獲自公共數(shù)據(jù)庫登錄號M85079且氨基酸序列獲自登錄號AAA61164)損害所有三個TGF-β (1、2和3)依賴性基因表達(dá)。TGF-β在大部分人類癌癥中生成，并且抑制腫瘤抗原特異性細(xì)胞免疫。Foster等，J.1mmunother. 31:500(2008)描述了在細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞中顯性陰性TGF β R2的表達(dá)能產(chǎn)生對TGF-β抑制效果的抗性。TGF^在誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化中與TGFa協(xié)同作用。其也用作陰性自分泌生長因子。TGF^活化和信號傳遞的失調(diào)可以造成凋亡。Ziyadeh等，Proc. Natl. Acad. Sc1. 97:8015 (2000)描述了給予抗TGFii抗體能在db/db小鼠中防止腎功能不全和腎小球硬化癥，所述小鼠是發(fā)展出明顯腎病的II型糖尿病的模型。生成和使用TGFii單克隆抗體的方法描述于美國專利號 6，419,928。Barcellos-Hoff 等，Am J. Pathol. 147:5(1995)也描述了生成 TGF3 抗體的方法。TGFβ融合蛋白構(gòu)建物的氨基酸和核苷酸序列描述于美國專利號6，756, 215。IL-1O是由活化的Th2細(xì)胞、B細(xì)胞、角化細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞生成的細(xì)胞因子。IL-1O抑制很多細(xì)胞因子的合成，包含由活化的巨噬細(xì)胞和輔助T細(xì)胞生成的IFN- Y、IL-2、IL-3、TNF和GM-CSF。IL-10用于促進(jìn)活化人B細(xì)胞的生長和分化、抑制Thl反應(yīng)以防止移植體排斥和T細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫疾病。O’Farrell等，EMBO J. 17:1006(1998);Kanbayashi 等，Cell Immunol. 171:153(1996);Fukushima 等，Br. J. Ophthalmol. 90:1535(2006);和 van Lent 等，Ann. Rheum. Dis. 66:334 (2007)描述了抗ILlO抗體的制備。美國專利號7，326，567公開了 IL-10抗體的多核苷酸序列。美國專利號5，837，232公開了用抗IL-10抗體治療B細(xì)胞介導(dǎo)的自體免疫紊亂的方法。細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子(SOCS)家族蛋白形成調(diào)節(jié)細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的經(jīng)典負(fù)反饋系統(tǒng)的一部分。 Alexander等Cell 98:597(1999)描述了細(xì)胞因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制因子I (S0CS1)是干擾素-Y信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要抑制劑，并且防止此細(xì)胞因子潛在的致死新生兒的作用。Hilton 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA95:114(1999)討論了 S0CS1 參與通過 JAK/STAT3通路信號的細(xì)胞因子負(fù)調(diào)節(jié)。Ohya等，J. Biol. Chem. 272:27178 (1997)描述了 SOCS蛋白似乎是通過白介素6(IL-6)和白血病抑制因子(LIF)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要調(diào)節(jié)劑。美國專利號6，534，277討論了抗S0CS1抗體的制備和使用的方法，其中編碼S0CS1抗體的核酸序列引入到細(xì)胞，從而所述抗體通過所述細(xì)胞或其后代表達(dá)，并且然后為了治療效果，體內(nèi)給予所述重組細(xì)胞。美國專利號6，323，317和7，049，418也公開了抗S0CS1抗體。TGF-α是促有絲分裂多肽，能結(jié)合EGF受體并且與TGF-β協(xié)同作用以提高軟瓊脂中錨定不依賴性細(xì)胞增殖。Ellis等，N. Engl. J. Med. 317:158 (1987)描述了 TGF-α在黑素瘤的某些副腫瘤性表現(xiàn)中起作用。美國專利號4，742，003和Xian等，The J. ofHistochem. &Cytochem. 47:949 (1999)描述抗 TGF-α 抗體的制備方法。腫瘤壞死因子受體(TNFRl)和Fas都包含有死亡結(jié)構(gòu)域的胞質(zhì)Fas相關(guān)蛋白(FADD)，對用于程序性細(xì)胞死亡(凋亡)和受體寡聚化的Fas和TNF誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)重要。鑒定了稱為FADD的哺乳動物蛋白，其能結(jié)合Fas受體的胞質(zhì)區(qū)或結(jié)構(gòu)域并且抑制FAS介導(dǎo)的凋亡。FADD的多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號U2423，和氨基酸序列登錄號AAA86517，這些序列通過引用納入本文。FADD片段或其編碼核酸，是功能完整天然FADD的顯性陰性抑制劑，描述于美國專利號6，562，797B1。p53(也稱為蛋白53或腫瘤蛋白53)是腫瘤抑制蛋白，在人中由TP53基因編碼。P53在多細(xì)胞生物體中重要，其調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并且因此作為預(yù)防癌癥的腫瘤抑制劑。p53的氨基酸和多核苷酸序列可獲自公共數(shù)據(jù)庫，登錄號NM_00546和NP_000537 (人)以及NM_011640 和 NP_035770 (小鼠)。生存素是凋亡家族抑制劑成員。生存素蛋白的功能是抑制半胱天冬酶活化，因此造成凋亡或程序性細(xì)胞死亡的負(fù)調(diào)節(jié)。通過破壞生存素誘導(dǎo)通路造成凋亡增加和腫瘤生長下降來顯示上述調(diào)節(jié)。所述生存素蛋白在大部分人腫瘤和胎兒組織中高表達(dá)，但是在最終分化細(xì)胞中全部缺失。因此這使得生存素成為腫瘤治療的理想靶標(biāo)，因?yàn)榘卸[瘤細(xì)胞而留下正常細(xì)胞。生存素表達(dá)也通過細(xì)胞周期嚴(yán)格調(diào)控，并且只在G2-M期表達(dá)。已知生存素通過與微管相互作用，在有絲分裂中定位在有絲分裂紡錘體上，并且可以在調(diào)節(jié)有絲分裂中起作用。生存素的調(diào)節(jié)看似與P53蛋白相連?？色@得p53的氨基酸和多核苷酸序列，登錄號 NM_001012270 和 NP_001012270 (人)以及 NM_001012273 和 NP_001012273 (小鼠)。黑色素瘤相關(guān)抗原3 (MAGE3)氨基酸序列的登錄號為P43357-1 (UniParc)。 前列腺特異性抗原(PSA)是由前列腺細(xì)胞生成的蛋白。PSA在有健康前列腺的男人血清中含量小，但是經(jīng)常在有前列腺癌和其他前列腺紊亂情況中含量提高。前列腺特異性膜抗原(PSMA)是前列腺組織和一些其他組織中發(fā)現(xiàn)的2型膜整合糖蛋白。其是前列腺癌的可能治療靶標(biāo)。序列表描述
SEQIDNO1是編碼mIL-12和m-1L21的構(gòu)建物的多核苷酸序列。
SEQIDNO2是編碼hIL-12和hIL-21的構(gòu)建物的多核苷酸序列。
SEQIDNO3是編碼mIL-21和mIL-15的構(gòu)建物的多核苷酸序列。
SEQIDNO4是編碼mIL-12的構(gòu)建物的多核苷酸序列。
SEQIDNO5是編碼hIL-21和hIL-15的構(gòu)建物的多核苷酸序列。
SEQIDNO6是編碼hIL-21的構(gòu)建物的多核苷酸序列。
SEQIDNO7是編碼mIL-21的構(gòu)建物的多核苷酸序列。
SEQIDNO8是編碼hIL-21的構(gòu)建物的多核苷酸序列。
SEQIDNO9是編碼mIL-21的多核苷酸序列。
SEQIDNO:10是mIL-21的氨基酸序列。
SEQIDNO11是編碼mIL-15的多核苷酸序列。
SEQIDNO:12是mIL-15的氨基酸序列。
SEQIDNO13是編碼mIL-12的mp40的多核苷酸序列。
SEQIDNO14是mIL-12的mp40的氨基酸序列。
SEQIDNO15是編碼mIL-12的mp35的多核苷酸序列。
SEQIDNO:16是mIL-12的mp35的氨基酸序列。
SEQIDNO17是編碼hIL-21的多核苷酸序列。
SEQIDNO:18是hIL-21的氨基酸序列。
SEQIDNO19是編碼hIL-15的多核苷酸序列。
SEQIDNO:20是hIL-15的氨基酸序列。
SEQIDNO21是編碼hIL-12的p40的多核苷酸序列。
SEQIDNO:22是hIL-12的p40的氨基酸序列。
SEQIDNO23是編碼hIL-12的p35的多核苷酸序列。
SEQIDNO:24是hIL-12的p35的氨基酸序列。
SEQIDNO25是果蠅(Drosophila)中發(fā)現(xiàn)的蛻皮激素響應(yīng)元件的核酸序列。
SEQIDNO:26是黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中發(fā)現(xiàn)的脫皮激素響應(yīng)元件的核酸序列。
SEQIDNO27是黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)中發(fā)現(xiàn)的脫皮激素響應(yīng)元件的核酸序列。
SEQIDNO28是尋靶(homing)內(nèi)切核酸酶(HE) (1-SceI)的限制性位點(diǎn)。
SEQIDNO :29 是包含人 IL-12 編碼序列:Ad-RTS-hIL-12 (SP1-RheoIL-12)的腺病毒載體DNA序列。
SEQIDNO 30是人TNF野生型5’ UTR的核酸序列。
SEQIDNO :31是5U25’ UTR的核酸序列。
SEQIDNO 32是編碼IL-2信號肽的密碼子優(yōu)化的核酸序列。
SEQIDNO 33是編碼人TNF α信號肽的野生型核酸序列。
SEQID NO 34是編碼人TNF α信號肽的密碼子優(yōu)化的核苷酸序列。
SEQIDNO 35是編碼人TNF α的野生型核酸序列。
SEQIDNO 36是編碼人TNF α的密碼子優(yōu)化的核酸序列。
SEQIDΝ0:37是人TNFa的氨基酸序列。
SEQIDNO 38是包含編碼SV40聚腺苷酸化信號的核苷酸序列的3’調(diào)節(jié)區(qū)的核酸序列。
SEQIDNO39是包含編碼人生長激素聚腺苷酸化信號的核苷酸序列的3’調(diào)節(jié)區(qū)的核酸序列。
SEQIDNO40是包含野生型人TNF α 3’ UTR的核酸序列。
SEQIDNO41是人TNF α 3’ UTR A-C突變體的核酸序列。
SEQIDNO42是人GAST 5’ UTR的核酸序列。
SEQIDNO:43是合成3’調(diào)節(jié)區(qū)的核酸序列。
SEQIDNO44是人GAPDH 5’ UTR的核酸序列。
SEQIDNO45是編碼胰島素SP的野生型核酸序列。
SEQIDNO46是編碼人FGF-19信號肽的野生型核酸序列。
SEQIDNO47是載體43318的核酸序列。
SEQIDNO48是載體43319的核酸序列。
SEQIDNO49是載體43320的核酸序列。
SEQIDNO50是載體43321的核酸序列。
SEQIDNO51是載體43322的核酸序列。
SEQIDNO52是載體43323的核酸序列。
SEQIDNO53是載體43324的核酸序列。
SEQIDNO54是載體43325的核酸序列。
SEQIDNO55是載體43326的核酸序列。
SEQIDNO56是載體43327的核酸序列。
SEQIDNO57是載體43328的核酸序列。
SEQIDNO58是載體43329的核酸序列。
SEQIDNO59是載體43533的核酸序列。
SEQIDNO60是載體43534的核酸序列。
SEQIDNO61是載體 VVN2823 (Ad-RTS-hIL-12)
SEQIDNO:62是載體 VVN2539 (Ad-RTS-mIL-12)發(fā)明詳述定義除非另外定義，本文使用的所有專業(yè)術(shù)語、符號和其它科學(xué)術(shù)語或?qū)Ｓ性~匯旨在具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員通常所理解的含義。在一些情況中，本文出于闡明和/或便于引用和理解對具有常規(guī)理解含義的術(shù)語加以限定，本文中包括此類限定不應(yīng)理解為表示與本領(lǐng)域常規(guī)理解有顯著差異。分子生物學(xué)術(shù)語和/或方法和/或方案的一般理解定義參見 Rieger 等，Glossary of Genetics: Classicaland Molecular (遺傳學(xué)詞匯經(jīng)典和分子)，第5版，紐約施普林格出版公司(Springer-Verlag), 1991; Lewin, Genes V (基因V),紐約的牛津大學(xué)出版社(Oxford University Press)，1994; Sambrook 等，MolecularCloning, A LaboratoryManual (分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊)(第 3 版，2OOl)和 Ausubel 等，CurrentProtocoIs in Molecular Biology (新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南)(1994)。除非另有說明，涉及使用市售可得試劑盒和/或試劑的過程通常按生產(chǎn)商的指南和/或方案和/或參數(shù)適當(dāng)進(jìn)行。

用于本發(fā)明目的的術(shù)語“分離”定義從其原始環(huán)境(天然存在的環(huán)境)移除的生物材料(細(xì)胞、核酸或蛋白)。例如，植物或動物的天然狀態(tài)中出現(xiàn)的多核苷酸沒有被分離，然而與其天然存在的相鄰核酸分開的相同多核苷酸視作“分離”。術(shù)語“純化”用于不需要材料以顯示絕對純度形式下出現(xiàn)的生物材料，排除其他化合物的出現(xiàn)。這更確切是相對的定義。“核酸”，〃核酸分子〃，〃寡核苷酸〃，〃核苷酸〃和〃多核苷酸〃互換使用，并且指核糖核苷(腺苷、鳥苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脫氧核糖核苷(脫氧腺苷、脫氧鳥苷、脫氧胸苷或脫氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或其采用單鏈形式或雙鏈螺旋的任何磷酸酯類似物，如硫代磷酸酯和硫酯，?？梢允请p鏈DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋。術(shù)語核酸分子且特別是DNA或RNA分子，僅僅指分子的一級和二級結(jié)構(gòu)，不限定任何特定三級形式。因此，該術(shù)語包含雙鏈DNA，尤其是線狀或環(huán)狀DNA分子(如限制性片段)、質(zhì)粒、超螺旋DNA和染色體中發(fā)現(xiàn)的雙鏈DNA等。當(dāng)討論特定雙鏈DNA分子的結(jié)構(gòu)時，本文可以按常規(guī)慣例描述序列，僅在沿非轉(zhuǎn)錄的DNA鏈的5’到3’方向上給出序列(即具有mRNA同源序列的鏈)?！爸亟MDNA分子”是經(jīng)過分子生物學(xué)操作的DNA分子。DNA包含但不限于cDNA、基因組DNA、質(zhì)粒DNA、合成DNA和半合成DNA。
用于多核苷酸序列的術(shù)語“片段”指相對于參照核酸長度減少的核苷酸序列，在所述共有部分包含與參照核酸相同的核苷酸序列。根據(jù)本發(fā)明的這種核酸片段可以是合適地包含在其作為組分的更大多核苷酸中。這種片段包含寡核苷酸或另外由寡核苷酸組成，所述寡核苷酸長度為至少 6、8、9、10、12、15、18、20、21、22、23、24、25、30、39、40、42、45、48、50、51、54、57、60、63、66、70、75、78、80、90、100、105、120、135、150、200、300、500、720、900、1000、1500、2000、3000、4000、5000或本發(fā)明所述核酸的更多連續(xù)核苷酸。本文使用的“分離核酸片段”指單或雙鏈的RNA或DNA聚合物，可選包含合成、非天然或改變的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的經(jīng)分離核酸片段可包含一個或多個區(qū)段的cDNA、基因組DNA或合成DNA?！盎颉敝赴幋a功能分子的核苷酸的多核苷酸，所述功能分子包含只由轉(zhuǎn)錄生成的功能分子(例如生物活性RNA種類)或由轉(zhuǎn)錄和翻譯生成的功能分子(例如多肽)。術(shù)語“基因”包含cDNA和基因組DNA核酸?！盎颉币仓副磉_(dá)特定RNA、蛋白或多肽的核酸片段，包含所述編碼序列之前(5’非編碼序列)和之后(3’非編碼序列)的調(diào)節(jié)序列?！疤烊换颉敝缸匀淮嬖谇揖哂凶陨碚{(diào)控序列的基因?！扒逗匣颉敝阜翘烊换虻娜魏位颍匀恢袥]有一起發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)和/或編碼序列。因此，嵌合基因可以包含來自不同來源的調(diào)節(jié)序列和編碼序列，或來自相同來源但是與天然發(fā)現(xiàn)方式不同排列的調(diào)節(jié)序列和編碼序列。嵌合基因可以包含來自不同來源的編碼序列和/或來自不同來源的調(diào)節(jié)序列?！皟?nèi)源基因”指在生物體基因組中天然定位的天然基因。“外源”基因或“異源”基因指在宿主生物體內(nèi)未正常發(fā)現(xiàn)，但是通過基因轉(zhuǎn)移引入宿主生物體的基因。外源基因能包含插入到非天然生物體的天然基因或嵌合基因。“轉(zhuǎn)基因”是通過轉(zhuǎn)化過程引入到基因組的基因。例如，白介素12(IL-12)基因編碼IL-12蛋白。IL-12是35_kD亞基(p35)和40_kD亞基(p40)通過二硫鍵連接產(chǎn)生全功能IL-12p70的異二聚體。所述IL-12基因編碼p35和p40亞基?！爱愒碊NA”指不 是天然定位到所述細(xì)胞或細(xì)胞染色體位點(diǎn)的DNA。異源DNA可以包含對細(xì)胞外源的基因。術(shù)語“基因組”包含染色體以及線粒體、葉綠體和病毒DNA或RNA。當(dāng)單鏈形式的核酸分子在合適的溫度和溶液離子強(qiáng)度條件下可與其它核酸分子(如cDNA、基因組DNA或RNA)退火時，該核酸分子與所述其它核酸分子是“可雜交的”。雜交和洗漆條件熟知且不例于Sambrook等，MolecularCloning:A Laboratory Manual (分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊)，第二版，冷泉港的冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor, 1989),特別是其中的第11章和表11. D。溫度和離子強(qiáng)度條件確定了雜交的“嚴(yán)謹(jǐn)性”?？烧{(diào)整嚴(yán)謹(jǐn)性條件以篩選適度相似的片段，如來自親緣關(guān)系遠(yuǎn)的生物體的同源序列，到高度相似的片段，如使來自親緣關(guān)系近的生物體的功能酶加倍的基因。對同源核酸的初級篩選而言，能使用對應(yīng)Tm 55。的低嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件，例如5X SSC、0. 1%SDS、0. 25%牛奶且沒有甲酰胺；或30%甲酰胺、5X SSC、0. 5%SDS。中等嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件對應(yīng)更高Tm，例如40%甲酰胺，有5X或6XSSC。高嚴(yán)謹(jǐn)性雜交條件對應(yīng)最高Tm，例如50%甲酰胺，有5X或6XSSC。雜交需要包含互補(bǔ)序列的兩個核酸，盡管根據(jù)所述雜交的嚴(yán)謹(jǐn)性，可以有堿基之間的錯配。術(shù)語“互補(bǔ)”用于描述能夠彼此雜交的核苷酸堿基間的關(guān)系。例如，當(dāng)涉及DNA時，腺嘌呤與胸腺嘧啶互補(bǔ)，胞嘧啶與鳥嘌呤互補(bǔ)。因此，本發(fā)明也包含分離的核酸片段，所述片段與本文公開或使用的全部序列以及那些基本相似的核酸序列互補(bǔ)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，多核苷酸通過使用包含在Tm 55° C雜交步驟的雜交條件和使用上述條件來檢測。在其他實(shí)施方式中，Tm是60° C、63° C或65° C。雜交后的洗滌也決定了嚴(yán)謹(jǐn)條件。一組條件使用一系列的洗滌，始于6XSSC、O. 5%SDS室溫15分鐘(min)，然后用2X SSC,O. 5%SDS于45°C重復(fù)洗滌30min，再用O. 2XSSC,O. 5%SDS于50°C洗滌30min并重復(fù)兩次。一組嚴(yán)謹(jǐn)條件使用更高的溫度洗滌，其中洗滌同上，除了最后兩次用O. 2X SSC、0. 5%SDS洗滌30min的溫度升高到60°C。另一組高嚴(yán)謹(jǐn)條件在O.1X SSC,O. 1%SDS中65°C進(jìn)行最后兩次洗滌。雜交核酸的合適嚴(yán)謹(jǐn)性取決于核酸的長度和互補(bǔ)的程度，這是本領(lǐng)域熟知的變量。兩個核苷酸序列之間相似性或同源性的程度越高，有這些序列的核酸雜交體的Tm值越高。核酸雜交的相對穩(wěn)定性(對應(yīng)更高Tm)按下列順序降低RNA:RNA、DNA:RNA, DNAiDNA0對于長度多于100個核苷酸的雜交體，已經(jīng)推導(dǎo)出計算Tm的方程(見Sambrook等，同上,9. 50-0. 51)。對更短核酸(如寡核苷酸)的雜交而言，錯配的位置變得更加重要，且寡核苷酸的長度決定其特異性(見Sambrook等，同上，11. 7-11. 8)。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，通過使用雜交條件測定多核苷酸，所述條件包含少于500mM鹽和至少37° C的雜交步驟，以及在溫度至少63° C的2X SSPE中的洗滌步驟。在另一個實(shí)施方式中，雜交條件包含用于雜交步驟的小于200mM鹽和至少37°C。在另一個實(shí)施方式中，雜交條件包含用于雜交和洗滌步驟的2 X SSPE和63 °C。在另一個實(shí)施方式中，可雜交核酸的長度至少約10個核苷酸。優(yōu)選可雜交核酸的最短長度是至少約15個核苷酸；例如，至少約20個核苷酸；例如，至少約30個核苷酸。另外，技術(shù)人員會認(rèn)識到，根據(jù)諸如探針長度等因素，必要時可以調(diào)整溫度和洗滌溶液鹽濃度。術(shù)語“探針 ”指單鏈核酸分子，所述分子能與互補(bǔ)單鏈靶標(biāo)核酸堿基配對以形成雙鏈分子。本文使用的術(shù)語“寡核苷酸”指與基因組DNA分子、cDNA分子、質(zhì)粒DNA或mRNA分子可雜交的短核酸。寡核苷酸能用如32P核苷酸或共價連接有標(biāo)記如生物素的核苷酸來標(biāo)記。標(biāo)記的寡核苷酸能用作檢測核酸出現(xiàn)的探針。寡核苷酸(二者其一可以被標(biāo)記)能用作PCR引物以用于克隆全長或核酸片段，用于DNA測序，或檢測核酸的出現(xiàn)。寡核苷酸也能用于與DNA分子形成三螺旋。通常，寡核苷酸優(yōu)選在核酸合成器上合成制備。因此，寡核苷酸能用非天然產(chǎn)生的磷酸酯類似物鍵例如硫酯鍵等制備?！耙铩敝腹押塑账?，所述寡核苷酸與靶標(biāo)核酸序列雜交以生成能用作合適條件下DNA合成起始位點(diǎn)的雙鏈核酸區(qū)。這種引物可用于聚合酶鏈反應(yīng)或DNA測序?！熬酆厦告湻磻?yīng)”縮寫為PCR，指酶學(xué)擴(kuò)增特異核酸序列的體外方法。PCR涉及重復(fù)系列的溫度循環(huán)，每個循環(huán)包含三個階段變性模板核酸以分離靶標(biāo)分子的鏈，退火單鏈PCR寡核苷酸引物到模板核酸，和通過DNA聚合酶延伸退火引物。PCR提供檢測靶標(biāo)分子出現(xiàn)的方法，并且在定量或半定量條件下，測定核酸的起始庫中靶標(biāo)分子的相對量?！澳孓D(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)”縮寫為RT-PCR且指一種體外方法，所述方法用于酶促生成靶標(biāo)cDNA分子或來自一個或多個RNA分子的分子，然后如上述酶促擴(kuò)增一個或多個靶標(biāo)cDNA分子內(nèi)的一種或多種特異核酸序列。RT-PCR提供檢測靶標(biāo)分子出現(xiàn)的方法，并且在定量或半定量條件下，測定核酸的起始庫中靶標(biāo)分子的相對量。DNA “編碼序列”或“編碼區(qū)”指某一雙鏈DNA序列，所述序列當(dāng)置于合適調(diào)節(jié)序列控制下時在細(xì)胞中、離體、體外或體內(nèi)編碼多肽并且能被轉(zhuǎn)錄和翻譯成多肽。“合適的調(diào)控序列”指位于編碼序列上游(5，非編碼序列)、之內(nèi)或下游(3’非編碼序列)的核苷酸序列，其影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性，或翻譯。調(diào)控序列可包含啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、聚腺苷酸識別序列、RNA加工位點(diǎn)、效應(yīng)器結(jié)合位點(diǎn)和莖環(huán)結(jié)構(gòu)。編碼序列的邊界由5’(氨基)末端的起始密碼子和3’(羧基)末端的翻譯終止密碼子確定。編碼序列包括但不限于，原核序列、來自mRNA的cDNA、基因組DNA序列和甚至合成DNA序列。如果所述編碼序列意在用于真核細(xì)胞中的表達(dá)，聚腺苷酸化信號和轉(zhuǎn)錄終止序列常位于該編碼序列的3’?！伴_放閱讀框”縮寫為0RF，指包含翻譯起始信號或起始密碼子如ATG或AUG和終止密碼子并且能潛在翻譯成多肽序列的某一核酸序列(DNA、cDNA或RNA)長度。本文使用術(shù)語“頭對頭”描述彼此相關(guān)的兩個多核苷酸序列的方向。當(dāng)一個多核苷酸的編碼鏈的5’末端Btt鄰另一多核苷酸的編碼鏈的5’末端時,兩個多核苷酸以頭對頭方向放置，其中每個多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向遠(yuǎn)離另一多核苷酸的5’末端前進(jìn)。術(shù)語“頭對頭”可以縮寫為(5，)_(5’)，并且也可以由符號(一一)或(3’ 一 5’ 5’ 一 3’)指示。本文使用術(shù)語“尾對尾”描述彼此相關(guān)的兩個多核苷酸序列的方向。當(dāng)一個多核苷酸的編碼鏈的3’末端毗鄰另一多核苷酸的編碼鏈的3’末端時，兩個多核苷酸以尾對尾方向放置，其中每個多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向朝向另一多核苷酸前進(jìn)。術(shù)語“尾對尾”可以縮寫為(3’)_(3’)，并且也可以由符號(一一)或(3’ 一3’ 5’ 一3’)指示。 本文使用術(shù)語“頭對尾”描述彼此相關(guān)的兩個多核苷酸序列的方向。當(dāng)一個多核苷酸的編碼鏈的5’末端毗鄰另一多核苷酸的編碼鏈的3’末端時，兩個多核苷酸以頭對尾方向放置，其中每個多核苷酸的轉(zhuǎn)錄方向以與另一多核苷酸相同的方向前進(jìn)。術(shù)語“頭對尾”可以縮寫為(5，)_(3’)，并且也可以由符號(一一)或(5，—3’ 5’ 一3’)指示。術(shù)語“下游”指位于參照核苷酸序列3’的核苷酸序列。特別地，下游核苷酸序列通常指轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)后的序列。例如，基因的翻譯起始密碼子位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的下游。術(shù)語“上游”指位于參照核苷酸序列5’的核苷酸序列。特別地，上游核苷酸序列通常涉及位于編碼序列或轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的5’端的序列。例如,大部分啟動子位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游。術(shù)語“限制性內(nèi)切核酸酶”和“限制性酶”互換使用，指在雙鏈DNA內(nèi)結(jié)合和剪切特異核苷酸序列的酶。〃同源重組〃指插入外源DNA序列到另一個DNA分子中，例如插入載體到染色體中。優(yōu)選地，所述載體靶向同源組合的特定染色體位點(diǎn)。對特異同源重組而言，所述載體會包含足夠長的與染色體序列同源區(qū)域以使載體與染色體互補(bǔ)結(jié)合并納入其中。更長的同源區(qū)域和更高的序列相似性程度可以增加同源重組的效率。本領(lǐng)域已知的數(shù)個方法可以用于根據(jù)本發(fā)明擴(kuò)增多核苷酸。一旦建立合適宿主系統(tǒng)和生長條件，重組表達(dá)載體能大量增殖和制備。本文所述能使用的表達(dá)載體包括但不限于下列載體或其衍生物人或動物病毒例如疫苗病毒或腺病毒；昆蟲病毒例如桿狀病毒；酵母載體；噬菌體載體(例如λ )，和質(zhì)粒和粘粒DNA載體等等。
“載體”指用于克隆和/或轉(zhuǎn)移核酸到宿主細(xì)胞的任何載劑。載體可以是連接另一 DNA區(qū)段的復(fù)制子，以實(shí)現(xiàn)所連接區(qū)段的復(fù)制?！皬?fù)制子”指用作體內(nèi)DNA自主復(fù)制單位的任何遺傳元件(例如質(zhì)粒、噬菌體、粘粒、染色體、病毒)，即能夠在其自身控制下進(jìn)行復(fù)制。術(shù)語“載體”包含體外、離體或體內(nèi)引入核酸到細(xì)胞的病毒和非病毒載劑?？墒褂帽绢I(lǐng)域已知的大量載體來操縱核酸，將響應(yīng)元件和啟動子納入基因等?？赡艿妮d體包括例如質(zhì)粒和修飾的病毒，包括例如噬菌體如λ衍生物，或質(zhì)粒如pBR322或pUC質(zhì)粒衍生物，或Bluescript載體。本發(fā)明使用的載體的另一個示例是ULTRAVECTORI 生成系統(tǒng)(Production System)(弗吉尼亞州布萊克斯堡(Blacksburg)的英創(chuàng)松公司(Intrexon)),如TO 2007/038276中描述。例如，將對應(yīng)響應(yīng)元件和啟動子的DNA片段插入到合適載體能通過連接合適DNA片段到有互補(bǔ)粘性末端的選定載體來完成?；蛘?，DNA分子的末端可以酶學(xué)修飾或任何位點(diǎn)可以通過連接核苷酸序列(接頭)到DNA末端來生成。這種載體可以工程改造成包含選擇標(biāo)記基因，能選擇整合標(biāo)記到細(xì)胞基因組的細(xì)胞。這種標(biāo)記能鑒定和/或選擇整合和表達(dá)標(biāo)記所編碼蛋白的宿主細(xì)胞。病毒載體且特別是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，用于細(xì)胞和活體動物對象中的各種基因遞送應(yīng)用。能使用的病毒載體包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒、桿狀病毒、疫苗病毒、單純皰疹病毒、愛波斯坦-巴爾病毒、腺病毒、雙生病毒(geminivirus)和花椰菜花葉病毒載體。非病毒載體包括質(zhì)粒、脂質(zhì)體、帶電脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑(cytofectin))、DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物和生物聚合物。除了核酸之外，載體還可包含一個或多個調(diào)控區(qū)，和/或用于選擇、測量和監(jiān)測核酸轉(zhuǎn)移結(jié)果(轉(zhuǎn)移到哪個組織、表達(dá)持續(xù)時間等)的選擇性標(biāo)記物。術(shù)語“質(zhì)?！敝竿ǔ］d有 不是細(xì)胞中樞代謝(central metabolism)—部分但常采用環(huán)狀雙鏈DNA分子形式的基因的染色體外元件。這些元件可以是自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列、線性、環(huán)狀或超螺旋的單鏈或雙鏈DNA或RNA，源自任何來源，其中大量核苷酸序列已連接或重組入能夠?qū)⑦x定基因產(chǎn)物的啟動子片段和DNA序列與合適的3’未翻譯序列引入細(xì)胞的獨(dú)特結(jié)構(gòu)?！寺≥d體〃指“復(fù)制子”，是順序復(fù)制和包含復(fù)制起點(diǎn)的單位長度的核酸(優(yōu)選DNA)例如質(zhì)粒、噬菌體或粘粒，其可以連接另一個核酸區(qū)段，從而產(chǎn)生所述連接區(qū)段的復(fù)制?？寺≥d體能在一種細(xì)胞類型中復(fù)制并且在另一種中表達(dá)(“穿梭載體”)?？寺≥d體可以包含用于細(xì)胞選擇的一個或多個序列，所述細(xì)胞包含所述載體和/或一個或多個插入感興趣序列的多克隆位點(diǎn)。術(shù)語“表達(dá)載體”指設(shè)計成能表達(dá)所插入核酸序列的載體、質(zhì)粒或載劑。克隆基因，如插入的核酸序列，通常置于對照元件(如啟動子、最小啟動子、增強(qiáng)子等)的控制下。用于驅(qū)動需要宿主細(xì)胞中核酸表達(dá)的起始控制區(qū)或啟動子有多個，并且為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉。能驅(qū)動這些基因表達(dá)的幾乎任何啟動子能用于表達(dá)載體，包括但不限于病毒啟動子、細(xì)菌啟動子、動物啟動子、哺乳動物啟動子、合成啟動子、組成型啟動子、組織特異性啟動子、發(fā)病或疾病相關(guān)啟動子、發(fā)育特異性啟動子、誘導(dǎo)型啟動子、光調(diào)節(jié)啟動子；CYC1、HIS3、GAL1、GAL4、GALIO、ADHl、PGK、PH05、GAPDH、ADC UTRPU URA3、LEU2、ENO、TP1、堿性磷酸酶啟動子(用于釀酒酵母(Saccharomyces)中的表達(dá))；A0X1啟動子(用于畢赤酵母(Pichia)中的表達(dá))；β -內(nèi)酰胺酶、lac、ara、tet、trp、1PL、IPR、T7、tac和trc啟動子(用于大腸桿菌(Escherichiacoli)中的表達(dá))；光調(diào)節(jié)、種子特異性、花粉特異性、卵巢特異性、花椰菜花葉病毒35S、CMV 35S最小、木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)、葉綠素a/b結(jié)合蛋白、核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶、苗特異性、根特異性、殼多糖酶、應(yīng)激誘導(dǎo)型、水稻東格魯桿狀病毒、植物超-啟動子、馬鈴薯亮氨酸氨基肽酶、硝酸還原酶、甘露堿合酶、膽脂堿合酶、泛素、玉米醇溶蛋白和花色苷啟動子(用于植物細(xì)胞中的表達(dá))；本領(lǐng)域已知的動物和哺乳動物啟動子，包括但不限于，SV40早期(SV40e)啟動子區(qū)、包含于勞氏(Rous)肉瘤病毒(RSV)的3’長末端重復(fù)序列(LTR)的啟動子、ElA的啟動子或腺病毒(Ad)的主要晚期啟動子(MLP)基因、巨細(xì)胞病毒(CMV)早期啟動子、單純皰疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)啟動子、桿狀病毒IEl啟動子、延伸因子I a (EFl)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、泛素(Ubc)啟動子、白蛋白啟動子、小鼠金屬硫蛋白-L啟動子調(diào)節(jié)序列和轉(zhuǎn)錄控制區(qū)、遍在啟動子(HPRT、波形蛋白、α-肌動蛋白、微管蛋白等)、中間纖維啟動子(人結(jié)蛋白、神經(jīng)絲、角蛋白、GFAP等)、治療基因啟動子(MDR、CFTR或因子VIII型等)、發(fā)病或疾病相關(guān)啟動子、和顯示組織特異性并用于轉(zhuǎn)基因動物的啟動子例如胰腺腺泡細(xì)胞中有活性的彈性蛋白酶I基因控制區(qū)；胰腺β細(xì)胞中有活性的胰島素基因控制區(qū)，淋巴細(xì)胞中有活性的免疫球蛋白基因控制區(qū)，睪丸、乳腺、淋巴和肥大細(xì)胞中有活性的小鼠乳腺腫瘤病毒控制區(qū)；白蛋白基因、肝中有活性的Apo Al和Apo AII控制區(qū)、肝中有活性的甲胎蛋白基因控制區(qū)、肝中有活性的α 抗胰蛋白酶基因控制區(qū)、骨髓細(xì)胞中有活性的β珠蛋白基因控制區(qū)、腦內(nèi)少突細(xì)胞中有活性的髓磷脂堿性蛋白基因控制區(qū)、骨骼肌中有活性的肌球蛋白輕鏈2基因控制區(qū)和下丘腦中有活性的促性腺激素釋放激素基因控制區(qū)、丙酮酸激酶啟動子、絨毛蛋白啟動子、脂肪酸結(jié)合腸蛋白啟動子、平滑肌細(xì)胞α-肌動蛋白啟動子等。另外，這些表達(dá)序列可以通過加入增強(qiáng)子或調(diào)節(jié)序列等調(diào)控。載體可以通過本領(lǐng)域已知的方式引入所需的宿主細(xì)胞，例如轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、D EAE右旋糖苷、磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染(溶酶體融合)、利用基因槍、或 DNA 載體轉(zhuǎn)運(yùn)子(參見例如，Wu 等，J. Biol. Chem. 267:963(1992) ;Wu 等，J. Biol.Chem. 263:1462114624(1988);和 Hartmut 等，加拿大專利申請?zhí)?2，012，311)。根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸也能通過脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體內(nèi)引入。在過去的十年中，越來越多使用脂質(zhì)體以體外包封和轉(zhuǎn)染核酸。設(shè)計成限制脂質(zhì)體所介導(dǎo)轉(zhuǎn)染遭遇的困難和危險的合成陽離子脂質(zhì)，能用于制備脂質(zhì)體以體內(nèi)轉(zhuǎn)染編碼標(biāo)記的基因(Feigner等，Proc. Natl.Acad. Sc1. USA. 84:7413(1987) ;Mackey 等，Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 85:8027(1988)；和Ulmer等，Science 259:1745(1993))。使用陽離子脂質(zhì)促進(jìn)帶負(fù)電核酸的包封,也促進(jìn)與帶負(fù)電細(xì)胞膜的融合(Feigner等，Science 337:387(1989))。用于轉(zhuǎn)移核酸的尤其有用的脂質(zhì)化合物和組合物如W095/18863、W096/17823和US5，459，127所述。使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染體內(nèi)引入異源基因到特定器官有某些實(shí)用優(yōu)點(diǎn)。分子靶向脂質(zhì)體到特定細(xì)胞代表一個優(yōu)勢方面。顯然，指向特定細(xì)胞類型的轉(zhuǎn)染會在有細(xì)胞異質(zhì)性的組織例如胰腺、肝、腎和腦中特別優(yōu)選。脂質(zhì)可以化學(xué)偶聯(lián)到另一個分子以用于靶向目的(Mackey等，1988，同上)。靶定的肽(例如激素或神經(jīng)遞質(zhì))和蛋白(例如抗體)或非肽分子可以化學(xué)偶聯(lián)到脂質(zhì)體。其他分子也用于輔助體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)染，例如陽離子寡肽(例如W095/21931)，源自DNA結(jié)合蛋白的肽(例如W096/25508)或陽離子聚合物(例如W095/21931)。也可將載體作為裸露DNA質(zhì)粒體內(nèi)引入(參見美國專利號5，693，622、5，589，466和5，580，859)。也能使用受體介導(dǎo)的DNA遞送方法(Curiel等，Hum. GeneTher. 3:147 (1992);和 Wu 等，J. Biol. Chem. 262:4429 (1987))。術(shù)語“轉(zhuǎn)染”指細(xì)胞攝入外源或異源RNA或DNA。當(dāng)這種RNA或DNA引入到細(xì)胞內(nèi)時，細(xì)胞被外源或異源RNA或DNA“轉(zhuǎn)染”。當(dāng)轉(zhuǎn)染的RNA或DNA影響表型改變時，細(xì)胞被外源或異源RNA或DNA “轉(zhuǎn)化”。轉(zhuǎn)化RNA或DNA能整合(共價連接)到染色體DNA中構(gòu)成所述細(xì)胞的基因組?！稗D(zhuǎn)化”指將核酸片段轉(zhuǎn)移到宿主生物的基因組中，引起遺傳上穩(wěn)定的遺傳。包含轉(zhuǎn)化核酸片段的宿主生物稱為“轉(zhuǎn)基因”或“重組”或“轉(zhuǎn)化”生物。另外，包含根據(jù)本發(fā)明多核苷酸的重組載體可以包含細(xì)胞宿主中的一個或多個復(fù)制啟點(diǎn)，其試圖擴(kuò)增或表達(dá)標(biāo)記或選擇標(biāo)記。術(shù)語“選擇標(biāo)記”指能基于標(biāo)記基因效果來選擇的鑒定因子，通常是抗生素或化學(xué)抗性基因，所述效果即耐受抗生素、耐受除草劑、比色標(biāo)記物、酶、熒光標(biāo)記物等，其中所述效果用于追蹤感興趣核酸的遺傳和/或鑒定遺傳所述感興趣核酸的細(xì)胞或生物。本領(lǐng)域已知并使用的可選擇標(biāo)記基因的例子包括提供耐受氨芐青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、潮霉素、雙丙氨磷除草劑、磺酰胺等的基因；和可用作表型標(biāo)記物的基因，即花色素苷調(diào)節(jié)基因、異戊烯轉(zhuǎn)移酶基因等。 術(shù)語“報道基因”指編碼能基于報道基因效果分辨的鑒定因子的核酸，其中所述效果用于追蹤感興趣核酸的遺傳，鑒定遺傳有感興趣核酸的細(xì)胞或生物，和/或測量基因表達(dá)誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域已知并使用的報道基因的例子包含螢光素酶(Luc)、綠色熒光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(LacZ)、β -葡糖醛酸酶(Gus)等。選擇標(biāo)記基因也視作報道基因?！皢幼印焙汀皢幼有蛄小被Q使用，并且指能控制編碼序列或功能RNA表達(dá)的DNA序列。通常，編碼序列位于啟動子序列的3’。啟動子可整體來自于天然基因，或由來自不同天然啟動子的不同元件所組成，或甚至包含合成的DNA片段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，不同的啟動子可指導(dǎo)不同組織或細(xì)胞類型中的基因表達(dá)，或在不同發(fā)育階段，或響應(yīng)不同的環(huán)境或生理條件反應(yīng)。在多數(shù)時候引起大部分細(xì)胞類型中基因表達(dá)的啟動子通常稱作“組成型啟動子”。引起基因在特定細(xì)胞類型中表達(dá)的啟動子通常稱為“細(xì)胞特異啟動子”或“組織特異啟動子”。引起基因在特定發(fā)育或細(xì)胞分化的階段中表達(dá)的啟動子通常稱為“發(fā)育特異啟動子”或“細(xì)胞分化特異啟動子”。用誘導(dǎo)啟動子的試劑、生物分子、化學(xué)、配體、光等接觸或處理細(xì)胞后，誘導(dǎo)并引起基因表達(dá)的啟動子通常稱為“誘導(dǎo)型啟動子”或“調(diào)節(jié)啟動子”。還應(yīng)認(rèn)識到，由于多數(shù)情況下調(diào)控序列的精確界限未完全確定，不同長度的DNA片段可有相同的啟動子活性。本發(fā)明的任何載體中，載體可選包含本文公開的啟動子。在一個實(shí)施方式中，所述啟動子是列于本文表I的啟動子。本發(fā)明的任何載體中，載體可選包含組織特異啟動子。在一個實(shí)施方式中，所述組織特異啟動子是本文公開的組織特異啟動子。在另一個實(shí)施方式中，所述組織特異啟動子是列于本文表2的組織特異啟動子。通常啟動子序列的3’末端界限為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)且向上游(5’方向)延伸，以包括起始高于背景的可檢測轉(zhuǎn)錄水平所需的最小數(shù)目堿基或元件。啟動子序列內(nèi)部可找到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(易通過例如核酸酶SI作圖確定)，以及負(fù)責(zé)RNA聚合酶結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(共有序列)?！ㄖ委熼_關(guān)啟動子〃("TSP")指控制基因開關(guān)組分表達(dá)的啟動子。基因開關(guān)和其各種組分在本文其他地方詳細(xì)描述。在某些實(shí)施方式中，TSP是組成型，即持續(xù)活性。組成型TSP可以是組成型普遍存在(即通常在任何組織或細(xì)胞中有功能，而不需要額外因子或調(diào)節(jié)物)或者組成型組織或細(xì)胞特異(即通常在特定細(xì)胞種類或細(xì)胞類型中有功能，而不需要額外因子或調(diào)節(jié)物)。在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的TSP在與疾病、紊亂或病癥相關(guān)的條件下活化。在涉及兩個或多個TSP的某些本發(fā)明實(shí)施方式中，所述啟動子可以是組成型和可活化啟動子的組合。本文使用的"在與疾病、紊亂或病癥相關(guān)的條件下活化的啟動子〃包括但不限于疾病特異啟動子，響應(yīng)特定生理、發(fā)育、分化或病理條件的啟動子、響應(yīng)特定生物分子的啟動子、和對所述疾病、紊亂或病癥相關(guān)特定組織或細(xì)胞類型(如腫瘤組織或惡性細(xì)胞)特異的啟動子。TSP能包含天然產(chǎn)生的啟動子序列、衍生自天然產(chǎn)生啟動子的修飾序列、或合成序列(例如將響應(yīng)元件插入最小啟動子序列以改變所述啟動子的反應(yīng))。當(dāng)RNA聚合酶將編碼序列轉(zhuǎn)錄成mRNA，然后反式RNA剪接(如果編碼序列包含內(nèi)含子)和翻譯成由編碼序列編碼的蛋白時，編碼序列是在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列“控制下”。“轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列”指提供宿主細(xì)胞中編碼序列表達(dá)的DNA調(diào)節(jié)序列，例如啟動子、增強(qiáng)子、終止子等。在真核細(xì)胞中，聚腺苷酸化信號是控制序列。術(shù)語“響應(yīng)元件”是一種或多種順式作用的DNA元件，它能夠通過與轉(zhuǎn)錄因子的DNA-結(jié)合結(jié)構(gòu)域相互作用介導(dǎo)賦予啟動子反應(yīng)性。這種DNA元件可以是回文序列(完美或不完美)或者由可變數(shù)量的核苷酸分隔的序列基序或半位點(diǎn)(half sites)組成。半位點(diǎn)可以類似或者相同，并排列成正向或反向重復(fù)序列或者形成單個半位點(diǎn)或相鄰半位點(diǎn)串聯(lián)形成的多聚體。所述響應(yīng)元件可以根據(jù)要整合響應(yīng)元件的細(xì)胞或生物的性質(zhì)，包含從不同生物分離的最小啟動子。有或沒有配體時，轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合響應(yīng)元件的DNA序列以啟動或抑制受該響應(yīng)元件調(diào)控的下游基因的轉(zhuǎn)錄。天然脫皮激素受體的響應(yīng)元件的 DNA 序列的示例包含RRGG/TTCANTGAC/ACYY(SEQ ID NO:25)(見 Cherbas 等，GenesDev. 5:120(1991)) ;AGGTCAN(n)AGGTCA,其中 Ν(η)是一個或多個間隔子核苷酸(SEQ IDNO: 26)(見D’Avino 等，Mol. Cell. Endocrinol. 113:1(1995));和 GGGTTGAATGAATTT (SEQ IDNO: 27)(見 Antoniewski 等，Mo1. Cell Biol. 14:4465 (1994))。術(shù)語“操作性連接”表示單一核酸片段上結(jié)合核酸序列，從而彼此影響功能。例如，當(dāng)啟動子能夠影響編碼序列的表達(dá)(即編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)時，啟動子操作性連接于編碼序列。編碼序列以有義或反義方向操作性連接于調(diào)控序列。本文所用的術(shù)語“表達(dá)”指源自核酸或多核苷酸的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定累積。表達(dá)也可以指mRNA翻譯形成蛋白質(zhì)或多肽。術(shù)語“盒”、“表達(dá)盒”和“基因表達(dá)盒”指能夠在特定限制位點(diǎn)或者通過同源重組插入核酸或多核苷酸的DNA區(qū)段。該DNA區(qū)段包括編碼感興趣多肽的多核苷酸，盒和限制位點(diǎn)設(shè)計成能夠確保盒插入適當(dāng)讀碼框進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯?！稗D(zhuǎn)化盒”指包含編碼感興趣多肽的多核苷酸并具有除有利于特定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的多核苷酸之外元件的特定載體。本發(fā)明的盒、表達(dá)盒、基因表達(dá)盒和轉(zhuǎn)化盒也可以包含使宿主細(xì)胞中編碼感興趣多肽的多核苷酸表達(dá)增強(qiáng)的元件。這些元件包括但不限于啟動子、最小啟動子、增強(qiáng)子、響應(yīng)元件、終止子序列、聚腺苷酸化序列等 。就本發(fā)明的目的而言，術(shù)語“基因開關(guān)”指啟動子相關(guān)的響應(yīng)元件和基于配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)的組合，所述系統(tǒng)在一個或多個配體出現(xiàn)時，調(diào)節(jié)整合響應(yīng)元件和啟動子的基因表達(dá)。術(shù)語“編碼基因開關(guān)的多核苷酸”指啟動子相關(guān)的響應(yīng)元件和編碼基于配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)的多核苷酸的組合，所述系統(tǒng)在一個或多個配體出現(xiàn)時，調(diào)節(jié)整合響應(yīng)元件和啟動子的基因表達(dá)。本發(fā)明的治療開關(guān)啟動子可以是任何用于治療、改善或預(yù)防特定疾病、紊亂或病癥的啟動子。示例包括但不限于，只在特定疾病、紊亂或病癥中顯示表達(dá)增加的基因的啟動子和顯示特定細(xì)胞條件(例如增殖、凋亡、pH改變、氧化狀態(tài)、氧含量)下表達(dá)增加的基因的啟動子。在基因開關(guān)包含多于一個轉(zhuǎn)錄因子序列的一些實(shí)施方式中，通過聯(lián)合疾病或病癥特異性啟動子和組織或細(xì)胞類型特異性啟動子以限定表達(dá)治療產(chǎn)物的組織，來提高治療方法的特異性。因此，組織或細(xì)胞類型特異性啟動子包含在治療開關(guān)啟動子定義中。作為疾病特異性啟動子的示例,治療癌癥的有用啟動子包含癌基因的啟動子。癌基因種類的示例包括但不限于，生長因子、生長因子受體、蛋白激酶、程序性細(xì)胞死亡調(diào)節(jié)物和轉(zhuǎn)錄因子。癌基因的特定示例包括但不限于sis、erbB、erb B_2、ras、abl、myc和bcl_2和TERT。其他癌癥相關(guān)基因的示例包含在腫瘤細(xì)胞中過量表達(dá)的腫瘤相關(guān)抗原基因和其他基因(例如MAGE-1、癌胚抗原、酪蛋白酶、前列腺特異抗原、前列腺特異膜抗原、p53、MUC-l、MUC-2、MUC-4、HER-2/neu、T/Tn、MART-l、gpl00、GM2、Tn、sTn 和 Thompson-Friedenreich 抗原(TF))。為本領(lǐng)域已知并且用作本發(fā)明治療開關(guān)啟動子的啟動子序列和其他調(diào)節(jié)元件(例如增強(qiáng)子)的示例，以及每個啟動子相關(guān)的疾病/紊亂(表I)或組織特異性(表2)，在表I和2所列參考文獻(xiàn)中公開。這些參考文獻(xiàn)中公開的啟動子序列通過引用全文納入本文。編碼表I所列任何蛋白的多核苷酸也可以使用本發(fā)明載體和非治療啟動子的啟動子來表達(dá)。表I
權(quán)利要求
1.一種條件表達(dá)有一種或多種具有治療蛋白功能的蛋白的載體，所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含(I)操作性連接啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和(2)編碼一種或多種有治療蛋白功能的蛋白的多核苷酸，所述多核苷酸操作性連接到通過所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子。
2.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述治療蛋白選自下組促血紅細(xì)胞生長素、生長素釋放肽、骨保護(hù)素、RANKL, RANKL誘餌(decoy)、TNF-a拮抗劑、IL-1拮抗劑、G-CSF、GM-CSF、IFN- a、IFN- y、血管他汀、內(nèi)皮他汀、TNF- a、PP1DCY-LSRL0C、P -葡糖苷酸酶、IL-12、a-半乳糖苷酶A、芳香基硫酸酯酶A、a-葡糖苷酶、b_葡糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、CLN6蛋白、青少年相關(guān)CLN3、N-磺氨基葡糖磺基水解酶(sulfoglucosaminesulfohyrolase) (SGSH)、a_N_乙酰氨葡萄糖苷酶、乙酰-輔酶A-氨基葡糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶、N-乙?；咸前?6-硫酸酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶(iduronidase)、芳香基硫酸酯酶B、酸性鞘磷脂酶、艾杜糖醒酸硫酸酯酶(iuduronate sulfatase)和血衆(zhòng)銅藍(lán)蛋白。
3.如權(quán)利要求1所述的載體，其特征在于，所述治療蛋白是一種或多種選自下組的免疫調(diào)節(jié)劑IL-1> IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-1OR DN 或其亞基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFNa、IFNP、IFNa1、IFNa 2、IL-15-R-a、CCL3 (MIP-1a)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、CXCLl (MGSA a )、CCR7、CCL19 (MIP-3b)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IP-10)、CXCL12 (SDF-1)、CCL21 (6Ckine)、0X40L、4-lBBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB1、Flt3L、IFNP、TNF a、dnFADD、BCG、TGF a、PD-LlRNA1、PD-L1 反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L、S100、CD40L、p53、存活素、p53-存活素融合、MAGE3、PSA和PSMA。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項所述的載體，其特征在于，所述載體選自下組質(zhì)粒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒、桿狀病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、腺病毒、雙生病毒(geminivirus)、花椰菜花葉病毒、脂質(zhì)體、帶電脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、DNA-蛋白復(fù)合物和生物聚合物。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項所述的載體,其特征在于,所述載體是腺病毒載體。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項所述的載體，其特征在于，所述載體還包含編碼有IL-12功能的蛋白的多核苷酸。
7.如權(quán)利要求6所述的載體，其特征在于，所述編碼所述一種或多種有免疫調(diào)節(jié)劑功能蛋白的多核苷酸和編碼所述有IL-12功能蛋白的所述多核苷酸受所述基因開關(guān)調(diào)節(jié)的啟動子控制。
8.如權(quán)利要求1-7中任一項所述的載體，其特征在于，所述基因開關(guān)是基于蛻皮激素受:體(EcR)的基因開關(guān)。
9.如權(quán)利要求1-8中任一項所述的載體，其特征在于，所述編碼基因開關(guān)的多核苷酸包含在第一啟動子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和在第二啟動子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中由所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白相互作用形成作為配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的蛋白復(fù)合物。
10.如權(quán)利要求1-9中任一項所述的載體，其特征在于，所述編碼基因開關(guān)的多核苷酸包含在啟動子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中由所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白相互作用形成作為配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的蛋白復(fù)合物。
11.如權(quán)利要求10所述的載體，其特征在于，所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列通過EMCV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)連接。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項所述的載體，其特征在于，所述編碼一種或多種有治療蛋白功能的蛋白的多核苷酸編碼人類蛋白。
13.如權(quán)利要求5-12中任一項所述的載體，其特征在于，所述編碼有IL-12功能的蛋白的多核苷酸編碼人IL-12。
14.如權(quán)利要求3-13中任一項所述的載體，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑是TNFa。
15.如權(quán)利要求14所述的載體，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑是人TNFa。
16.如權(quán)利要求3-15中任一項所述的載體，其特征在于，所述免疫調(diào)節(jié)劑包含與SEQID NO: 37 (人 TNFa )至少 80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%相同的氨基酸序列。
17.如權(quán)利要求1-16中任一項所述的載體，其特征在于，所述編碼一種或多種有治療蛋白功能的蛋白的多核苷酸是密碼子優(yōu)化的。
18.如權(quán)利要求17所述的載體，其特征在于，所述編碼一種或多種有治療蛋白功能的蛋白的多核苷酸還包含編碼信號肽的核酸序列。
19.如權(quán)利要求18所述的載體，其特征在于，所述編碼信號肽的核酸序列是密碼子優(yōu)化的。
20.如權(quán)利要求19所述的載體，其特征在于，所述信號肽選自下組=TNFOptUV和IL-2optUV0
21.如權(quán)利要求18-20中任一項所述的載體，其特征在于，所述信號肽與野生型TNFa信號肽基因編碼的肽序列相比誘導(dǎo)提高的TNFa蛋白分泌。
22.如權(quán)利要求1-21中任一項所述的載體，其特征在于，所述載體還包含5’非翻譯區(qū)(UTR)。
23.如權(quán)利要求22所述的載體，其特征在于，所述5’UTR衍生自TNF野生型或5U2。
24.如權(quán)利要求22或23所述的載體，其特征在于，所述5’UTR誘導(dǎo)提高的編碼TNF a的1^嫩水平、了即0蛋白病毒表達(dá)或兩者。
25.如權(quán)利要求1-24中任一項所述的載體，其特征在于，所述載體還包含3’調(diào)節(jié)區(qū)。
26.如權(quán)利要求25所述的載體，其特征在于，所述3’調(diào)節(jié)區(qū)是衍生自SV40e或人生長激素(hGH)的聚腺苷酸化信號。
27.如權(quán)利要求25或26所述的載體，其特征在于，所述3’調(diào)節(jié)區(qū)誘導(dǎo)提高的編碼TNFa的11^嫩水平、了即0蛋白病毒表達(dá)或兩者。
28.如權(quán)利要求27所述的載體，其特征在于，所述載體包含衍生自5U2的5’UTR、密碼子優(yōu)化的IL-2信號肽(IL-2optUV)、由密碼子優(yōu)化的核酸序列編碼的TNF- a和衍生自hGH的3’調(diào)節(jié)區(qū)。
29.如權(quán)利要求1-28中任一項所述的載體，其特征在于，所述載體包含選自下組的核酸序列載體43318、載體43319、載體43320、載體43321、載體43322、載體43322、載體43323、載體 43324、載體 43325、載體 43326、載體 43327 和載體 43329。
30.如權(quán)利要求1-29中任一項所述的載體，其特征在于，所述條件表達(dá)所述治療蛋白的載體直接注射入腫瘤或腫瘤附近。
31.如權(quán)利要求1-30中任一項所述的載體，其特征在于，所述載體在體內(nèi)給予前不包含于細(xì)胞中。
32.—種生成免疫細(xì)胞群或治療支持細(xì)胞(TSC)群的方法，所述細(xì)胞表達(dá)有一種或多種治療蛋白功能的蛋白，所述方法包含用權(quán)利要求1-31中任一項所述載體修飾免疫細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是人樹突細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，所述樹突細(xì)胞是骨髓樹突細(xì)胞。
35.一種表達(dá)有一種或多種治療蛋白功能的蛋白的免疫細(xì)胞群或TSC群，所述免疫細(xì)胞或TSC群包含如權(quán)利要求1-34中任一項所述的載體。
36.如權(quán)利要求35所述的免疫細(xì)胞或TSC群，其特征在于，所述細(xì)胞是人樹突細(xì)胞。
37.一種體外工程改造的免疫細(xì)胞或TSC，所述細(xì)胞或TSC包含如權(quán)利要求1-31中任一項所述的載體。
38.如權(quán)利要求37所述的體外工程改造的免疫細(xì)胞或TSC，其特征在于，所述免疫細(xì)胞或TSC是人樹突細(xì)胞。
39.一種藥物組合物，所述組合物包含如權(quán)利要求1-31中任一項所述的載體，如權(quán)利要求35-36中任一項所述的免疫細(xì)胞群或TSC群，如權(quán)利要求37-38中任一項所述的體外工程改造的免疫細(xì)胞群或TSC群，或其組合。
40.一種組合物，所述組合物包含兩種或多種如權(quán)利要求1-31中任一項所述的載體，兩個或多個如權(quán)利要求35-36中任一項所述的免疫細(xì)胞群或TSC群，兩種或多種如權(quán)利要求37-38中任一項所述的體外工程改造的免疫細(xì)胞或TSC，或其組合。
41.如權(quán)利要求39或40所述的組合物和藥學(xué)上可接受運(yùn)載體。
42.如權(quán)利要求39-41中任一項所述的組合物，所述組合物還包含緩沖劑。
43.如權(quán)利要求42所述的組合物，其特征在于，所述緩沖劑是TRIS。
44.如權(quán)利要求39-43中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物還包含甘油。
45.如權(quán)利要求39-44中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物適于口服、玻璃體內(nèi)、腫瘤內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下給予。
46.如權(quán)利要求39-45中任一項所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞群包含至少104細(xì)胞。
47.如權(quán)利要求39-46中任一項所述的組合物，其特征在于，所述細(xì)胞群包含至少IO7細(xì)胞。
48.如權(quán)利要求39-47中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物和所述活化配體同時給予或以任何順序給予有此需要的哺乳動物時，所述組合物降低腫瘤大小或防止腫 瘤形成。
49.如權(quán)利要求39-48中任一項所述的組合物，其特征在于，所述組合物和所述活化配體同時給予或以任何順序給予有此需要的哺乳動物時，所述組合物治療腫瘤。
50.(I)如權(quán)利要求1-31中任一項所述的載體，如權(quán)利要求35-36中任一項所述的群，如權(quán)利要求35-38中任一項所述的體外工程改造的免疫細(xì)胞或TSC，或如權(quán)利要求39-49中任一項所述的組合物，和(2)藥物生產(chǎn)中治療有效量的一種或多種活化配體用于制造藥物的應(yīng)用，所述藥物用以治療有此需要的哺乳動物的疾病或紊亂。
51.如權(quán)利要求50所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疾病或紊亂是所述哺乳動物中的腫瘤。
52.如權(quán)利要求50或51所述的應(yīng)用，其特征在于，所述治療是降低所述哺乳動物中腫瘤的大小或防止腫瘤。
53.(I)如權(quán)利要求1-31中任一項所述的載體，如權(quán)利要求35-36中任一項所述的群，如權(quán)利要求35-38中任一項所述的體外工程改造的免疫細(xì)胞或TSC，或如權(quán)利要求39-49中任一項所述的藥物組合物，和(2)藥物生產(chǎn)中治療有效量的一種或多種活化配體用于制造藥物的應(yīng)用，所述藥物用于在有此需要的哺乳動物中降低、消除或控制TNFa的系統(tǒng)毒性，其中，所述配體與所述載體或組合物給予同時、或之前、或之后給予，并且其中活化配體給予的時間降低、消除或控制系統(tǒng)毒性。
54.如權(quán)利要求50-53中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，當(dāng)所述哺乳動物顯示副作用時，停止給予所述活化配體。
55.如權(quán)利要求50-54中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述配體在所述載體、所述群、所述體外工程改造的免疫細(xì)胞或TSC或者所述組合物前后小于I小時內(nèi)給予。
56.如權(quán)利要求50-55中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述配體在所述載體或所述組合物之后小于24小時內(nèi)給予。
57.如權(quán)利要求50-55中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述配體在所述載體或所述組合物之后小于48小時內(nèi)給予。
58.如權(quán)利要求50-57中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述載體不含在細(xì)胞中，并且所述載體瘤內(nèi)給予所述哺乳動物中的腫瘤微環(huán)境。
59.如權(quán)利要求58所述的應(yīng)用，其特征在于，免疫細(xì)胞或TSC不與所述載體一樣瘤內(nèi)給予。
60.如權(quán)利要求50-59中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤是良性腫瘤。
61.如權(quán)利要求50-59中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤是惡性腫瘤。
62.如權(quán)利要求50-59中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤是黑素瘤。
63.如權(quán)利要求50-59中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤是惡性黑素瘤皮膚癌。
64.如權(quán)利要求50-63中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述配體是二酰肼。
65.如權(quán)利要求50-64中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述配體選自RG-115819、RG-115932 和 RG-115830。
66.如權(quán)利要求50-63中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述配體是酰胺酮和惡二唑琳(oxadiazoline)。
67.如權(quán)利要求50-66中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于,所述配體在所述載體、免疫細(xì)胞群或TSC群、體外工程改造的免疫細(xì)胞或組合物前后小于I小時內(nèi)給予。
68.如權(quán)利要求50-66中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于,所述配體在所述載體、免疫細(xì)胞群或TSC群、體外工程改造的免疫細(xì)胞或組合物之后小于24小時內(nèi)給予。
69.如權(quán)利要求50-66中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述配體在載體、免疫細(xì)胞群或TSC群、體外工程改造的免疫細(xì)胞或組合物之后小于48小時內(nèi)給予。
70.一種測定患者中基于如權(quán)利要求1-31中任一項所述的載體、如權(quán)利要求35-36中任一項所述的免疫細(xì)胞群或TSC群、如權(quán)利要求35-38中任一項所述的體外工程改造的免疫細(xì)胞、或如權(quán)利要求39-49中任一項所述的組合物的治療方案功效的方法，所述方法包含 (a)在給予所述載體、免疫細(xì)胞群或TSC群、體外工程改造的免疫細(xì)胞或組合物前，從有此需要的患者獲得的第一生物樣品中測量干擾素Y (IFN-Y)的表達(dá)水平或活性水平或兩者，從而生成對照水平； (b)給予所述患者如權(quán)利要求1-31中任一項所述的載體、如權(quán)利要求35-36中任一項所述的免疫細(xì)胞群或TSC群、如權(quán)利要求35-38中任一項所述的體外工程改造的免疫細(xì)胞、或如權(quán)利要求39-49中任一項所述的組合物； (C)給予所述患者治療有效量的活化配體； (d)在給予載體、免疫細(xì)胞群或TSC群、體外工程改造的免疫細(xì)胞和活化配體后，從所述患者獲得的第二生物樣品中測量IFNy的表達(dá)水平或活性水平或兩者，從而生成測試水平；和 (e)比較IFNY的所述對照水平和測試水平，其中IFNy的表達(dá)、活性或兩者的測試水平相對于對照水平增加指示所述治療方案對所述患者有效。
71.—種試劑盒，所述試劑盒包含(a)如權(quán)利要求1-31中任一項所述的載體、如權(quán)利要求35-36中任一項所述的免疫細(xì)胞群或TSC群、如權(quán)利要求35-38中任一項所述的體外工程改造的免疫細(xì)胞、或如權(quán)利要求39-47中任一項所述的組合物，和(b)激活所述基因開關(guān)的配體。
72.如權(quán)利要求71所述的試劑盒，其特征在于，所述配體是RG-115819、RG-115830或RG-115932。
73.一種增加TNF-a mRNA表達(dá)或TNF-a蛋白表達(dá)的方法，所述方法包含(I)生成如權(quán)利要求1-31中任一項所述的載體，其中所述免疫調(diào)節(jié)劑是TNF-a且其中所述編碼一種或多種有免疫調(diào)節(jié)劑功能的蛋白的多核苷酸還包含一個或多個調(diào)節(jié)序列，和(2)加入活化配體，其中所述一個或多個調(diào)節(jié)序列提高所述TNF- a的表達(dá)。
74.(a)條件表達(dá)蛋白的載體，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，和(b)治療有效量的一種或多種活化配體在生產(chǎn)用于治療所需哺乳動物中疾病或紊亂的藥物中的應(yīng)用， 其中，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含 (1)操作性連接到啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和 (2)編碼一種或多種蛋白的多核苷酸，操作性連接到由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子， 所述載體不包含在細(xì)胞內(nèi)；和 其中當(dāng)給予時，所述配體在所述哺乳動物中誘導(dǎo)所述一種或多種蛋白的表達(dá)和治療所述疾病。
75.如權(quán)利要求74所述的應(yīng)用，其特征在于，所述疾病選自慢性腎病、骨關(guān)節(jié)炎、腫瘤學(xué)、病毒性上呼吸道感染、貓漿細(xì)胞口腔炎、貓酸細(xì)胞性肉芽腫、貓白血病病毒感染、犬瘟熱感染、系統(tǒng)性真菌感染、心肌病、黏多糖貯積癥VII和傳染病。
76.如權(quán)利要求75所述的應(yīng)用，其特征在于，所述傳染病選自牛呼吸道疾病、豬呼吸道疾病、家禽流行性感冒、鳥類感染性支氣管炎、牛腦海綿狀病、犬利什曼病、慢性消耗性疾病、人體免疫缺陷病毒(HIV)、肝炎、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、古典豬瘟、包蟲病、流行性肺炎、FIP、口蹄疫、肺腺瘤病、梅迪維斯納病、動物乳腺炎、犬小孢子菌、Orf (動物疾病)、小反芻獸疫、痘病、鸚鵡喙羽病、狂犬病、地中海熱(布氏桿菌病)或牛傳染性流產(chǎn)或波狀熱、馬爾他熱、接觸性流產(chǎn)、傳染性流產(chǎn)、沙門菌性食物中毒、腸副傷寒樣癥狀、細(xì)菌性痢疾、假結(jié)核病、鼠疫、瘟疫熱、結(jié)核病、霍亂、利斯特菌病、鉤端螺旋體性黃疸(細(xì)螺旋體病)或鉤端螺旋體病、出血性黃疸病(出血性黃疸鉤端螺旋體)、乳品業(yè)工人發(fā)燒(牛鉤端螺旋體(L. hard jo))、回歸熱、蜱媒回歸熱、鉤端螺旋體性熱、流浪熱、饑饉熱、萊姆關(guān)節(jié)炎、Bannworth綜合癥(萊姆病)、蝶傳腦膜多神經(jīng)炎、慢性遷移性紅斑、弧菌病、大腸菌感染癥(Colibacteriosis)、大腸桿菌毒血癥、白灣病、豬腸道水腫、腸副傷寒樣癥狀(paratyphosis)、葡萄球菌食物中毒、葡萄球菌性胃腸炎、犬冠狀病毒(CCV)或犬小病毒腸炎、貓感染性腹膜炎病毒、傳染性胃腸炎(TGE)病毒、豪氏紅口病(ERMD)、感染性造血壞死病毒(MN)、豬胸膜肺炎放線桿菌(嗜血桿菌屬)、麻瘋病、鏈絲菌病、綿羊霉菌性皮炎、馬偽鼻疽、惠特莫爾氏病、Francis病、土拉菌病、兔熱病、O’ Hara病、念珠狀鏈桿菌性熱、哈佛希耳熱、流性斑、鼠咬熱(sodoku)、航運(yùn)或運(yùn)輸熱、出血性敗血癥、飼鳥病、鸚鵡熱、禽衣原體病、北美皮膚芽生菌病、芝加哥病、吉耳克里斯特氏(Gilchrist)病、貓抓熱、良性淋巴網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生、良性非細(xì)菌性淋巴結(jié)炎、桿菌性血骨病、桿菌性紫癜、寇熱、巴爾干流感、巴爾干流感、屠宰場熱(abattoir fever)、蝶傳熱、肺炎立克體病、美國蝶斑疫傷寒、蝶傳斑疹傷寒、皰疹樣立克次體病、立克次氏體痘疹熱、蚤傳斑疹傷寒、地方性斑疹傷寒、都市傷寒、癬菌病、皮膚癬菌病、癬、毛癬菌病、小孢子菌病、股癬、腳癬、申克孢子絲菌、雙態(tài)性真菌、隱球菌病和組織胞漿菌病、良性表皮猴痘、BEMP、猴皰疹病毒、乙型猿猴病毒病、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒、C型昏睡性腦炎、黃熱病、黑色嘔吐、漢坦病毒肺綜合癥、朝鮮出血熱、流行性腎病、流行性出血熱、出血性腎病腎炎、淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎、加利福尼亞腦炎/大地病毒腦炎、非洲出血熱、綠猴或南非小猿猴病、恐水病、狂犬病(Lyssa)、傳染性肝炎、流行性肝炎、流行性黃疸、麻疹、麻疹、豬和馬流感、禽疫、新堡病、梨漿蟲病、弓漿蟲病、非洲昏睡病、網(wǎng)比亞錐蟲病、非洲錐蟲病、南美錐蟲病、查加斯病、南美錐蟲病、痢疾形蟲、小袋蟲痢疾、隱孢子蟲病、賈第蟲病、皮膚利什曼病糖膠樹膠工人(Chiclero)潰瘍、鼻咽粘膜利什曼病、pianbols、粘膜皮膚利什曼病(Uta)和布巴病(buba)(在美洲)；東方市、皮膚利什曼病(在舊大陸)；巴格達(dá)癤、德里癤、包魯癤，內(nèi)臟利什曼病黑熱病、微孢子蟲病、異尖線蟲病、旋毛蟲病、血管圓線蟲蝴移行癥、嗜酸性粒細(xì)胞腦膜炎或腦膜腦炎(廣州管圓線蟲(A. cantonensis))、腹部管圓線蟲病(脊形管圓線蟲(A. costaricensis))、鉤蟲病、板口線蟲病、鉤蟲病、毛細(xì)線蟲病、馬來絲蟲病(Brugiasis)、毒蛔蟲病、食道口線蟲病、糞類圓線蟲病、毛狀腺蟲病、蛔蟲癥、裂頭絳蟲病、裂頭蝴病、牛羊棘球蝴病、棘球蝴病、尖絳蟲(Echinococcus granulosis)、囊性包蟲病、絳蟲感染、血吸蟲(Schistosoma)、EBV引起的伯奇氏淋巴瘤、勞氏逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的勞氏肉瘤、8型皰疹病毒引起的卡波濟(jì)氏肉瘤、HTLV-1逆轉(zhuǎn)錄病毒引起的成年T細(xì)胞白血病或HTLV-1I引起的多毛細(xì)胞白血病。
77.如權(quán)利要求75所述的應(yīng)用，其特征在于，所述傳染病選自下組牛呼吸疾病、豬呼吸疾病和禽流感。
78.如權(quán)利要求75所述的應(yīng)用，其特征在于，所述腫瘤選自下組骨肉瘤、白血病和淋巴瘤。
79.如權(quán)利要求74-78中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述一種或多種蛋白選自下組促血紅細(xì)胞生長素、生長素釋放肽、骨保護(hù)素、RANKL、RANKL誘餌(decoy)、TNF- a 拮抗劑、IL-1 拮抗劑、G-CSF、GM-CSF, IFN- a、IFN- y、管他汀、內(nèi)皮他汀、TNF- a、PP1DCY-LSRL0C、^ -葡糖苷酸酶和 IL-12。
80.如權(quán)利要求74-79中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述一種或多種蛋白選自下組IL-U IL-2、IL-12、IL-3、IL-4、IL-5、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10R DN 或其亞基、IL-15、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、GM-CSF、IFNa、IFNa、IFNa1、IFNa 2、IL-15-R-a、CCL3 (MIP-1a)、CCL5 (RANTES)、CCL7 (MCP3)、XCLl (淋巴細(xì)胞趨化因子)、CXCLl (MGSA a )、CCR7、CCL19 (MIP-3b)、CXCL9 (MIG)、CXCLlO (IP-10)、CXCL12 (SDF-1)、CCL21 (6Ckine)、0X40L、4-lBBL、CD40、CD70、GITRL、LIGHT、b-防御素、HMGB1、Flt3L、IFNP、TNF a、dnFADD、BCG、TGF a、PD-LlRNA1、PD-L1 反義寡核苷酸、TGFbRII DN、ICOS-L、S100、CD40L、p53、存活素、p53-存活素融合、MAGE3、PSA和PSMA。
81.(a)條件表達(dá)蛋白的載體，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，和(b)治療有效量的一種或多種活化配體在生產(chǎn)用于治療有此需要的哺乳動物中溶酶體貯積癥的藥物中的應(yīng)用， 其中，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含 (1)操作性連接到啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和 (2)編碼一種或多種蛋白的多核苷酸，操作性連接到由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子， 其中所述載體在體內(nèi)給予前不包含于細(xì)胞內(nèi)；和 其中所述配體在給予時誘導(dǎo)所述哺乳動物中一種或多種蛋白的表達(dá)和治療所述溶酶體貯積癥。
82.如權(quán)利要求81所述的應(yīng)用，其特征在于，所述溶酶體貯積癥選自下組龐培氏病/11型糖原貯積病、高歇病(I型、II型、III型)、法布里病、黏多糖貯積癥II (亨特綜合癥)、黏多糖忙積癥VI (馬-拉二氏(Maroteaux-Lamy)綜合癥)、黏多糖忙積癥1、異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良、神經(jīng)元蠟樣質(zhì)脂褐質(zhì)沉積病或CLN6病(非典型晚嬰型、遲發(fā)型變異、若年、芬蘭晚嬰型變異CLN5、詹-K=S(Jansky-Bielschowsky)病/晚嬰型CLN2/TPPl病、庫夫斯病/成年發(fā)作性NCL/CLN4病、北方癲癇/變異晚嬰型CLN8、神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥(Santavuor1-Haltia)/嬰兒CLN1/PPT病、P -甘露糖苷病)、巴-斯-沃三氏(Batten-Spielmeyer-Vogt) /青少年NCL/CLN3病、A型沙費(fèi)利波綜合癥、B型沙費(fèi)利波綜合癥、C型沙費(fèi)利波綜合癥、D型沙費(fèi)利波綜合癥、MPSI賀勒綜合癥、尼曼-匹克氏(Niemann-Pick)病(A型、B型、C型、D型)、激活因子缺乏癥/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、a -甘露糖苷病、天冬氨酰葡糖胺尿癥、膽固醇酯沉積病、慢性氨基己糖苷酶A缺乏、胱氨酸累積癥、Danon病、Farber病、巖藻苷貯積癥、半乳糖唾液酸沉積癥(Goldberg綜合癥)、GMl神經(jīng)節(jié)苷脂累積病(嬰兒、晚嬰型/少年、成年/慢性)、I細(xì)胞疾病/黏脂沉積I1、嬰兒游離唾液酸貯積病/ISSD、少年己糖胺酶A缺乏癥、Krabbe病(嬰兒發(fā)病，遲發(fā)性)、黏多醣癥(假性赫爾利多營養(yǎng)障礙綜合征/黏脂沉積IIIA、沙伊綜合癥、MPS I賀勒氏-施艾氏(Hurler-Scheie)綜合癥、莫奎歐氏癥A型/MPS IVA、莫奎歐氏癥B型MPS IVB、MPS IX透明質(zhì)酸酶缺乏、Sly綜合癥(MPS VII)、黏脂沉積I/唾液酸沉積癥、黏脂沉積IIIC，、黏脂沉積IV型)、多發(fā)性硫酸酯酶缺乏癥、致密性成骨不全癥、山霍夫氏病/成年發(fā)病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病-嬰幼兒、山霍夫氏病/GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病-青少年、Schindler病、SalIa病、嬰兒唾液酸貯積病、家族黑蒙性白癡(Tay-Sachs) /GM2神經(jīng)節(jié)苷脂累積病、Wolman病、天冬氨酰葡糖胺尿癥(Asparylglucosaminuria)和鞘脂激活蛋白原(prosaposin)。
83.如權(quán)利要求81或82所述的應(yīng)用，其特征在于，所述溶酶體貯積癥選自下組龐培氏病/11型糖原貯積病、高歇病(I型、II型、III型)、法布里病、黏多糖貯積癥II (亨特綜合癥)、黏多糖貯積癥VI (馬-拉二氏綜合癥)、黏多糖貯積癥I和異染性腦白質(zhì)營養(yǎng)不良。
84.如權(quán)利要求81-83中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述一種或多種蛋白選自a_半乳糖苷酶A、芳香基硫酸酯酶A、a-葡糖苷酶、b_葡糖苷酶、葡糖腦苷脂酶、CLN6蛋白、青少年相關(guān)CLN3、N-磺氨基葡糖磺基水解酶(sulfoglucosamine sulfohyrolase)(SGSH)、a-N-乙酰氨葡萄糖苷酶、乙酰-輔酶A-氨基葡糖苷乙?；D(zhuǎn)移酶、N-乙酰基葡糖胺-6-硫酸酯酶、a-L-艾杜糖苷酸酶(idimmidase)、芳香基硫酸酯酶B、酸性鞘磷脂酶(acid sphingomyelinase)和艾杜糖醒酸硫酸酯酶(iuduronate sulfatase)。
85.(a)條件表達(dá)蛋白的載體，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，和(b)治療有效量的一種或多種活化配體在生產(chǎn)用于治療所需哺乳動物中肝病的藥物中的應(yīng)用， 其中，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含 (1)操作性連接到啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和 (2)編碼一種或多種蛋白的多核苷酸，操作性連接到由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子， 其中所述載體在體內(nèi)給予前不包含于細(xì)胞內(nèi)；和 其中所述配體在給予時誘導(dǎo)所述哺乳動物中一種或多種蛋白的表達(dá)和治療所述肝病。
86.如權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述肝病是乙型肝炎。
87.如權(quán)利要求85所述的方法，其特征在于，所述肝病是丙型肝炎。
88.如權(quán)利要求85-87中任一項所述的方法，其特征在于，所述蛋白是IFN-α。
89.如權(quán)利要求85-87中任一項所述的方法，其特征在于，所述蛋白是血漿銅藍(lán)蛋白。
90.(a)條件表達(dá)蛋白的載體，其中所述載體包含編碼基因開關(guān)的多核苷酸，和(b)治療有效量的一種或多種活化配體在生產(chǎn)用于治療所需哺乳動物中眼部疾病的藥物中的應(yīng)用， 其中，編碼基因開關(guān)的所述多核苷酸包含 (1)操作性連接到啟動子的至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列，其中所述至少一個轉(zhuǎn)錄因子序列編碼配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子，和 (2)編碼一種或多種蛋白的多核苷酸，操作性連接到由所述配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子激活的啟動子， 其中所述載體在體內(nèi)給予前不包含于細(xì)胞內(nèi)；和其中所述配體在給予時誘導(dǎo)所述哺乳動物中一種或多種蛋白的表達(dá)和治療所述眼部疾病。
91.如權(quán)利要求90所述的應(yīng)用，其特征在于，所述眼部疾病選自青光眼、開角型青光目艮、閉角型青光眼、無虹膜性(niridic)青光眼、先天性青光眼、青少年型青光眼、晶狀體誘導(dǎo)青光眼、新生血管性青光眼、外傷后青光眼、類固醇誘導(dǎo)青光眼、Sturge-Weber綜合癥并發(fā)青光眼和色素層炎誘導(dǎo)青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑變性、黃斑變性、脈絡(luò)膜新生血管性疾病、血管裂隙和/或視網(wǎng)膜水腫、細(xì)菌性結(jié)膜炎、真菌性結(jié)膜炎、病毒性結(jié)膜炎、葡萄膜炎、角膜后沉淀物、黃斑水腫、人工晶體植入術(shù)后的炎癥反應(yīng)、葡萄膜炎綜合癥、視網(wǎng)膜血管炎、肉狀瘤病，伊爾斯病，急性視網(wǎng)膜壞死，Vogt-小柳-原田(Vogt Koyanaki Harada)綜合癥，眼弓形體病、放射視網(wǎng)膜病、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變、眼內(nèi)炎、眼部青光眼、缺血性視神經(jīng)病變、甲狀腺相關(guān)眼病，眼眶炎性假瘤，色素播散綜合癥(色素性青光眼)，鞏膜炎，表層鞏膜炎脈絡(luò)膜病、視網(wǎng)膜病變(例如，囊樣黃斑水腫、中心性漿液性脈絡(luò)膜病變和眼假組織胞漿菌病綜合癥、視網(wǎng)膜血管病、視網(wǎng)膜動脈閉塞、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜色素變性、家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變(FEVR)、特發(fā)性水螅狀脈絡(luò)膜血管病變、黃斑前膜和白內(nèi)障。
92.如權(quán)利要求90或91所述的應(yīng)用，其特征在于，所述載體玻璃體內(nèi)給予。
93.如權(quán)利要求74-92中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述哺乳動物是人或非人動物。
94.如權(quán)利要求74-93任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述載體選自下組質(zhì)粒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺相關(guān)病毒、痘病毒、桿狀病毒、痘苗病毒、單純皰疹病毒、愛潑斯坦-巴爾病毒、腺病毒、雙生病毒(geminivirus)、花椰菜花葉病毒、脂質(zhì)體、帶電脂質(zhì)(細(xì)胞轉(zhuǎn)染劑)、DNA-蛋白復(fù)合物和生物聚合物。
95.如權(quán)利要求74-94中任一項所述的應(yīng)用,其特征在于,所述載體是腺病毒載體。
96.如權(quán)利要求74-95中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述基因開關(guān)是基于EcR的基因開關(guān)。
97.如權(quán)利要求74-96中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述編碼基因開關(guān)的多核苷酸包含在第一啟動子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列，和在第二啟動子控制下的第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中由所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白相互作用形成作為配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的蛋白復(fù)合物。
98.如權(quán)利要求74-97中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述編碼基因開關(guān)的多核苷酸包含在啟動子控制下的第一轉(zhuǎn)錄因子序列和第二轉(zhuǎn)錄因子序列，其中由所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列編碼的蛋白相互作用形成作為配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的蛋白復(fù)合物。
99.如權(quán)利要求98所述的應(yīng)用，其特征在于，所述第一轉(zhuǎn)錄因子序列和所述第二轉(zhuǎn)錄因子序列通過EMCV內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)連接。
100.如權(quán)利要求74-99中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述配體是二酰肼。
101.如權(quán)利要求74-99中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述配體選自RG-115819、RG-115932 和 RG-115830。
102.如權(quán)利要求74-99中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述配體是酰胺酮和惡二唑啉(oxadiazoline)。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療領(lǐng)域。最特別地，本發(fā)明提供生成在活化配體出現(xiàn)時條件表達(dá)受基因表達(dá)調(diào)節(jié)系統(tǒng)控制的一種或多種免疫調(diào)節(jié)劑的載體的方法和用于動物中治療目的的應(yīng)用?？梢蕴峁┻@些載體通過直接注射或通過體外工程改造的細(xì)胞如樹突細(xì)胞來治療多種疾病，例如腫瘤疾病。
文檔編號C12N15/00GK103038343SQ201180025699
公開日2013年4月10日 申請日期2011年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月23日
發(fā)明者J·F·羅斯, C·C·瑞德, B·庫斯博特森, S·查達(dá), W·E·佛格勒 申請人:英特瑞克斯頓股份有限公司