專利名稱：同時鑒別9種雞呼吸道病病原體的GeXP快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時鑒別9種雞呼吸道病病原體的GeXP快速檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
H5、H7和H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體、滑液囊支原體和傳染性鼻炎是嚴重危害雞的9種主要呼吸道傳染性疾病。主要臨床表現(xiàn)為啰音、咳嗽、氣喘、伸頸、張口呼吸、甩頭和呼吸困難等癥狀。這些傳染病感染不同年齡雞群，具有較高的發(fā)病率和死亡率，其臨床癥狀卻十分相似，無法鑒別。鑒別診斷這些呼吸道疾病的傳統(tǒng)方法，主要包括病原分離鑒定和血清學(xué)試驗等，但這些方法常受臨床病料新鮮度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁瑣、費時，對多重混合感染的鑒別診斷就更為困難。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于這些呼吸 道病的檢測，并建立了多重PCR檢測技術(shù)，同時檢測幾種病原，但需幾對引物組合在一起同時競爭地擴增，引物之間會產(chǎn)生相互干擾，多增加一對引物，敏感性就越低。PCR產(chǎn)物需通過瓊脂糖電泳才可觀察結(jié)果，該電泳難以區(qū)分50bp-100bp以內(nèi)的條帶，一般只可做到2-4重PCR，難以達到高通量的檢測。多重熒光PCR—般只檢測到3重，由于探針要標記不同發(fā)光波長的熒光基團，如標記太多的熒光基團，相互會產(chǎn)生干擾，因此，也只能檢測到2-4重。由于在多重PCR反應(yīng)體系中同時存在幾對引物，使得形成復(fù)雜引物二聚體的概率大大增加，同時檢測的目的基因數(shù)量有限(多在2-4個基因)，使得多重PCR還達不到高通量快速檢測和分析的目的。GeXP 系統(tǒng)(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美國BeckmanCoulter公司研發(fā)的用于研究多基因表達定量分析的平臺，由兩部分組成用于設(shè)計引物的 GeXP expression Profiler 軟件和用于結(jié)果分析的 GenomeLabTM GeXPGeneticAnalysis System毛細管電泳儀，后者可清晰分離出相差7bp以上的相鄰擴增片段。GeXP多重PCR擴增采用熒光標記通用引物和特異性嵌合引物(即基因特異性引物5’端連接通用引物序列)相結(jié)合引發(fā)多重體系擴增。PCR反應(yīng)之初，先由反向特異性嵌合引物與原始模板結(jié)合進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，再由正向特異性嵌合引物合成cDNA的第二鏈，此后，由正、反向嵌合引物的特異性序列以cDNA為模板啟動PCR反應(yīng)，分別擴增出通用引物的互補序列；再由反應(yīng)體系中占主導(dǎo)地位的熒光標記通用引物，與其互補序列結(jié)合，引發(fā)后續(xù)擴增，通用引物與反應(yīng)體系中帶有熒光標記的堿基序列互補，PCR產(chǎn)物經(jīng)GeXP毛細管電泳分離，含有熒光標記的PCR產(chǎn)物經(jīng)GeXP檢測窗口檢測，依據(jù)檢測片段與標準分子片段(DNA SizeStandard, DSS)遷移時間計算出擴增片段的長度，熒光信號強度代表該分離片段的擴增含量。GeXP系統(tǒng)可在同一個體系里對多達40個目的基因進行有效分析。利用GeXP多重基因表達遺傳分析系統(tǒng)，建立一種能同時鑒別多種病原體的檢測方法和檢測試劑盒，關(guān)鍵是設(shè)計特異性引物，將多重引物組合，利用通用引物，把多重引物的擴增轉(zhuǎn)化為I對通用引物的擴增，從而達到高通量檢測的目的。目前，還沒有基于GeXP系統(tǒng)的同時可檢測家禽多種呼吸道傳染性疾病病原體的試劑或試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒定或輔助鑒定家禽呼吸道病病原體的GeXP快速檢測的試劑或試劑盒，含有如下十種PCR弓I物對的十種、任意九種、任意八種、任意七種、任意六種、任意五種、任意四種、任意三種、任意兩種或任一種鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的PCR引物對A，鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒的PCR引物對B，鑒定或輔助鑒定H7亞型禽流感病毒的PCR引物對C，鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的PCR引物對D，鑒定或輔助鑒定新城疫病毒的PCR引物對E，鑒定或輔助鑒定傳染性支氣管炎病毒的PCR引物對F、鑒定或輔助鑒定傳染性喉氣管炎病毒的PCR引物對G，鑒定或輔助鑒定雞毒支原體的PCR引物對H，鑒定或輔助鑒定滑液囊支原體的PCR引物對I，鑒定或輔助鑒定副雞嗜血桿菌的PCR引物對J ;所述PCR引物對A由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈·DNA組成；所述PCR引物對C由序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對D由序列表序列7所示的單鏈DNA和序列表序列8所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對E由序列表序列9所示的單鏈DNA和序列表序列10所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對F由序列表序列11所示的單鏈DNA和序列表序列12所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對G由序列表序列13所示的單鏈DNA和序列表序列14所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對H由序列表序列15所示的單鏈DNA和序列表序列16所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對I由序列表序列17所示的單鏈DNA和序列表序列18所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對J由序列表序列19所示的單鏈DNA和序列表序列20所示的單鏈DNA組成。在上述試劑或試劑盒中，所述PCR弓丨物對A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G和/或H和/或I和/或J的每條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度相問。在上述試劑或試劑盒中，所述PCR引物對A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G和/或H和/或I和/或J的每條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度均分別為ΙΟηΜ。本發(fā)明所提供的試劑或試劑盒中的引物對可檢測的病原體種類分別如下PCR引物對A可檢測16種HA亞型禽流感病毒，即Hl—H16亞型的禽流感病毒；PCR引物對B可檢測H5亞型禽流感病毒；PCR引物對C可檢測H7亞型禽流感病毒；PCR引物對D可檢測H9亞型禽流感病毒；PCR引物對E可檢測新城疫病毒；PCR引物對F可檢測傳染性支氣管炎病毒；PCR引物對G可檢測傳染性喉氣管炎病毒；PCR引物對H可檢測雞毒支原體；PCR引物對I可檢測滑液囊支原體；PCR引物對J可檢測副雞嗜血桿菌；本發(fā)明所提供的試劑或試劑盒中的引物對可檢測的病原體來源分別如下PCR引物對A可檢測禽源的禽流感病毒，PCR引物對B可檢測禽源的H5亞型禽流感病毒，PCR引物對C可檢測禽源的H7亞型禽流感病毒，PCR引物對D可檢測禽源的H9亞型禽流感病毒，PCR引物對E可檢測禽源的新城疫病毒，PCR引物對F可檢測禽源的傳染性支氣管炎病毒病毒，PCR引物對G可檢測禽源的傳染性喉氣管炎病毒，PCR弓I物對H可檢測雞、火雞源雞毒支原體；PCR引物對I可檢測雞、火雞源的滑液囊支原體，PCR引物對J可檢測禽源的副雞嗜血桿菌，所述禽源具體可為雞源或鴨源，但不限于上述病毒的上述來源。本發(fā)明保護如下引物對A-J在制備鑒定或輔助鑒定家禽呼吸道病病原體的試劑 盒中的應(yīng)用；所述PCR引物對A由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對C由序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對D由序列表序列7所示的單鏈DNA和序列表序列8所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對E由序列表序列9所示的單鏈DNA和序列表序列10所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對F由序列表序列11所示的單鏈DNA和序列表序列12所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對G由序列表序列13所示的單鏈DNA和序列表序列14所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對H由序列表序列15所示的單鏈DNA和序列表序列16所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對I由序列表序列17所示的單鏈DNA和序列表序列18所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對J由序列表序列19所示的單鏈DNA和序列表序列20所示的單鏈DNA組成；所述病原體為禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體、滑液囊支原體和/或副雞嗜血桿菌。使用本發(fā)明所提供的基于GeXP系統(tǒng)的試劑或試劑盒中的10種引物對同時檢測禽流感病毒、H5、H7和H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體、滑液囊支原體和副雞嗜血桿菌的特異性強，靈敏度為100拷貝/ μ I、100 拷貝 / μ I、100 拷貝 / μ 1、10 拷貝 / μ I、100 拷貝 / μ 1、10 拷貝 / μ I、100 拷貝 / μ I、
100拷貝/ μ I、100拷貝/ μ I、10拷貝/ μ 1，與病毒分離和血凝抑制實驗等常規(guī)實驗方法的鑒定結(jié)果相比，符合率達100%。本發(fā)明為常見的主要雞呼吸道病及其病原體的檢測提供了簡便、高通量的檢測試劑盒和檢測體系，更符合實際的需要，應(yīng)用前景廣闊。


圖I為Η5、Η9亞型禽流感病毒cDNA混合模板的GeXP十重PCR的毛細管電泳分析圖。圖2為傳染性支氣管炎cDNA和雞毒支原體DNA混合模板的GeXP十重PCR的毛細管電泳分析圖。圖3為9種呼吸道病原的GeXP十重PCR的毛細管電泳分析圖。
圖I一3中,橫坐標為PCR擴增產(chǎn)物的堿基數(shù),縱坐標為突光信號值。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、PCR引物對的設(shè)計以GenBank公布的引物序列為參考，從NCBI上下載已知序列使用DNASTAR軟件進行序列比對，選取針對各個靶基因高度保守與特異的基因片段，由premier 5. O軟件設(shè)計了 10重特異性引物，并在引物的5’端添加GeXP通用引物(下劃線標出的序列)，引物方向均為從5’-3’端，具體如下I)、以禽流感病毒(AIV)M基因為靶基因的引物對A :AIV-Fl:AGGTGACACTATAGAATAAGCCGAGATCGCGCAGA (序列表序列 I);AIV-Rl:GTACGACTCACTATAGGGACGCTCACTGGGCACGGT (序列表序列 2)；預(yù)計擴增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為190bp ；靶序列為Genbank DQ485227 的第 88-104 和第 224-240 位。2)、以H5亞型禽流感病毒(AIV_H5)HA基因為靶基因的引物對B :AIV-H5-F1:AGGTGACACTATAGAATAGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTA (序列表序列 3)；AIV-H5-R1 :GTACGACTCACTATAGGGACACATCCATAAAGAYAGACCAGC(序列表序列 4，其中的Y為兼并堿基，代表C或T)；預(yù)計擴增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為223bp ；靶序列為Genbank DQ095615. I 的第 1485-1508 和第 1648-1670 位。3)、以H7亞型禽流感病毒(AIV_H7)HA基因為靶基因的引物對C :AIV-H7-F1: AGGTGACACTATAGAATAAGTGGAAACAAGTTGATAACAGT (序列表序列 5 序列)；AIV-H7-R1 :GTACGACTCACTATAGGGATGCCCCATTGAAASTGAA (序列表序列 6 序列，其中的S為兼并堿基，代表C或G)；預(yù)計擴增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為175bp ；靶序列為Genbank EU742995. 2 的第 616-638 和第 736-753 位。4)、以H9亞型禽流感病毒(AIV_H9)HA基因為靶基因的引物對D :
AIV-H9-F1: AGGTGACACTATAGAATAACCATTTATTCGACTGTCGCCT (序列表序列 7 序列)；AIV-H9-R1: GTACGACTCACTATAGGGACATTGGACATGGCCCAGAA (序列表序列 8 序列)；預(yù)計擴增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為116bp ；靶序列為Genbank DQ485224 的第 1609-1630 和第 1669-1687 位。5)、以新城疫病毒(NDV)F基因為靶基因的引物對E :NDV-Fl: AGGTGACACTATAGAATAAGCATTGCTGCAACCAATGA (序列表序列 9 序列)；NDV-Rl: GTACGACTCACTATAGGGAACAAACTGCTGCATCTTCCC (序列表序列 10 序列)；預(yù)計擴增產(chǎn)物長度卿目的峰位置)為126bp ； 靶序列為Genbank ABG29388 的第 469-488 和第 538-557 位。6)、以傳染性支氣管炎病毒(IBV)N基因為靶基因的引物對F :IBV-Fl: AGGTGACACTATAGAATAGGAGGACCTGATGGTAATTTCC (序列表序列 11 序列)；IBV-Rl: GTACGACTCACTATAGGGATGCGAGARCCCTTCTTCTGCT (序列表序列 12 序列)；預(yù)計擴增產(chǎn)物長度卿目的峰位置)為239bp ；靶序列為Genbank ⑶393338. I 的第 26380-26401 和第 26561-26581 位。7)、以傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)TK基因為靶基因的引物對G :ILTV-Fl: AGGTGACACTATAGAATAGTGCAGTTTTGCTCCGAGTT (序列表序列 13 序列)；ILTV-Rl: GTACGACTCACTATAGGGAATAGACGGCAACCTCTCCAA (序列表序列 14 序列)；預(yù)計擴增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為182bp ；靶序列為Genbank HM230797. I 的第 1072-1091 和第 1197-1216 位。8)、以雞毒支原體(MG) 16rRNA基因為靶基因的引物對H MG-Fl: AGGTGACACTATAGAATACAAGGAAGCGCATGTCTAGG (序列表序列 15 序列)；MG-Rl: GTACGACTCACTATAGGGACTGGGTTTTAATTGTTTCACCG (序列表序列 16 序列)；預(yù)計擴增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為200bp ；靶序列為Genbank JN935873. I 的第 1400-1419 和第 1541-1562 位。9)、以滑液囊支原體(MS)VLHA基因為靶基因的引物對I :MS-Fl :AGGTGACACTATAGAATAGACCCTGTAGAGRCTGCTAAAA (序列表序列 17 序列，其中的R為兼并堿基，代表A或G);MS-Rl: GTACGACTCACTATAGGGAGCTTCAACTTGTCTTTTTAATGC (序列表序列 18 序列)；預(yù)計擴增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為138bp ；靶序列為Genbank ⑶084387. I 的第 384-405 和第 462-484 位。10)、以副雞嗜血桿菌HA基因為靶基因的引物對J IC-Fl :AGGTGACACTATAGAATATCTGATTATAAACCAACTAAAAGAGCA (序列表序列 19 序列)；IC-Rl :GTACGACTCACTATAGGGAGCAAGTTCTGGTAATGATGGTAAGTT (序列表序列 20 序列)；預(yù)計擴增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為156bp ；革E序列為GenbankAF491820. I 的第 388-414 和第 481-506 位。根據(jù)實際檢測的病原體的毒株不同以及GeXP系統(tǒng)如GenomeLabTM GeXPGeneticAnalysis System毛細管電泳儀的誤差,使用上述引物對A-G及GeXP通用引物對檢測獲得的實際擴增產(chǎn)物長度可在預(yù)計擴增產(chǎn)物的長度基礎(chǔ)上上下波動3bp。實施例2、PCR引物對的特異性檢測一、模板的制備I、病毒RNA提取及cDNA的獲得I)病毒RNA提取使用試劑盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 4. O (大連 TaKaRa公司，產(chǎn)品編號為DV819A)按照試劑盒說明書，分別從如下病毒毒株的雞胚尿囊液中提取RNA (以提取陰性雞胚尿囊液獲得的樣品為陰性對照樣品)禽流感病毒毒株Duck/HK/717/79-dl (H1N3 亞型)、Duck/HK/77/76 (H2N3 亞型)、Duck/HK/526/79/2B (H3N6 亞型)、Duck/HK/668/79 (H4N5 亞型)、Duck/HK/531/79 (H6N8 亞型)、Turkey/ont/6118/68 (H8N4 亞型)、Duck/Guangxi/l/00 (H9N2 亞型)、Duck/HK/147/77 (H9N6)、Duck/HK/876/80 (H10N3亞型)、Duck/HK/661/79 (H11N3 亞型)、Duck/HK/862/80 (H12N5 亞型)、Gull/MD/704/77(H13N5 亞型)文獻ZhixunXie, Yao-shan Pang, Jiabo Liu, et al. A multiplex RT-PCR fordetection of type Ainfluenza virus and differentiation of avian H5, H7, and H9hemagglutininsubtypes[J]. Molecular and Cellular Probes, 2006, 20(3-4):245-249.)；10 種新城疫病毒毒株 F48E9 株、Mukteswar 株、C30 株、V4 株、Ulster 株、Losota、GX1/00、GX2/00、GX6/02、GX7/02 (文獻陳安莉，謝芝勛，周辰瑜，等.新城疫病毒強弱毒株LAMP鑒別檢測方法的建立[J],中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41(09) :917-922. ) ;8種傳染性支氣管炎病毒毒株Massachussetts 41、Connecticut (Conn)、Arkansas (Ark) >Delaware (DE/2686/92)、PA、JMK、H52、廣西分離株GXIB/02 (文獻謝志勤，謝芝勛，呂華剛.等.30株雞傳染性支氣管炎病毒標準株與分離株SI基因的克隆及序列分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，21 (6) : 1733-1736.)。2)cDNA 的獲得將步驟I)獲得的RNA樣品分別按照如下反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ;以DEPC水作為總RNA的對照。反應(yīng)體系(20μ L) :5X Reverse Transcriptase Buffer 4 μ L, RandomPrimer(9mer)50pmol> dNTP Mixture (IOmM)2 μ L, Ribonuclease Inhibitor 20U, AMVReverseTranscriptase,模板 RNA I μ g, DEPC 水補足至 20 μ L。用反轉(zhuǎn)錄試劑Random Primer (9mer)、dNTP Mixture、Ribonuclease Inhibitor、Reverse Transcriptase XL(AMV)(均購自大連TaKaRa公司，目錄號分別為 D3802、D4030RA、D2313A、D2620)。反應(yīng)條件抽提的總RNA加完DEPC水和Random Primer (9mer)后，瞬離，70°C IOmin后立即冰浴5min。加完其余四樣后，瞬離，42°C I. 5h，置于_20°C保存。3)禽流感病毒毒株 Chicken/Guangxi/1/04 (H5N1 亞型)、Duck/HK/313/78 (H5N3亞型)和Duck/HK/47/76(H7N2亞型)分別是以cDNA形式留存的樣品，并已經(jīng)HA基因測序證實(記載上述毒株的文獻如下Zhixun Xie, Yao-shan Pang, Jiabo Liu, et al. AmultiplexRT-PCR for detection of type A influenza virus and differentiationof avianH5, H7, and H9 hemagglutinin subtypes[J]. Molecular and CellularProbes, 2006, 20(3-4):245-249)。
2、基因組DNA的提取使用血液組織細胞基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，產(chǎn)品編號DP304)，按照試劑盒說明書，分別從如下病毒毒株的雞胚尿囊液中提取病毒基因組DNA(以提取陰性雞胚尿囊液獲得的樣品為陰性對照樣品)5種傳染性喉氣管炎病毒毒株北京株、臺灣疫苗株、美國標準株、以色列疫苗 株、廣西分離株(文獻謝芝勛，謝志勤，龐耀珊.等.采用二溫氏聚合酶鏈反應(yīng)擴增雞喉氣管炎病毒TK基因的研究[J].中國獸醫(yī)科技，2000, 30(9) :5-7);分別從如下病原體毒株或菌株的培養(yǎng)物中提取基因組DNA (以提取陰性培養(yǎng)物獲得的樣品為陰性對照樣品)7種雞毒支原體毒株S6、A5969、K2221、K1501、PG31、F2F10和F-K810 (文獻羅思思，謝芝勛，鄧顯文.等.雞毒支原體強弱毒株LAMP可視化鑒別檢測方法的建立[J].中國獸醫(yī)科學(xué)2012，42(09) :943-948. ) ；5種滑液囊支原體毒株K-1415、MS-28、FMT、PMS-122和PMS-156(文獻謝志勤，謝芝勛，龐耀珊.等·應(yīng)用多重聚合酶鏈式反應(yīng)檢測雞毒支原體和雞滑液囊支原體和禽衣阿華支原體的研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2000, 32(05) :4-6) ；2種副雞嗜血桿菌菌株CVCC253和CVCC256 (購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)。3、測定核酸含量用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測定其OD值,得出其濃度與純度值,并以此控制核酸質(zhì)量。二、各引物對單重PCR的特異性檢測I、引物對A的特異性檢測I) PCR 擴增用引物對A對步驟一中I獲得的13種HA亞型禽流感病毒毒株、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的5種傳染性喉氣管炎病毒毒株、7種雞毒支原體毒株、5種滑液囊支原體毒株和2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品分別進行PCR擴增，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品以及陰性培養(yǎng)物的DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下反應(yīng)體系(20μL) :GenomeLabTM GeXP StartKit 5 X PCR Buffer (含 GeXP 通用引物對，美國貝克曼公司，PN A85017)4yL,引物對A (每條引物在反應(yīng)體系中的終濃度為 10nM)、25mM MgCl2 4 μ L(美國貝克曼公司，ΡΝ Α25395)、Thermo-Start DNAPolymerase0.7yL(美國貝克曼公司，PN A25395),模板cDNA或DNA O. 5pg-0. 5 μ g,加滅菌水至20 μ L0每個cDNA/DNA設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)程序95°C預(yù)變性IOmin ;95°C 30s，50°C 30s, 72°C lmin，10 個循環(huán)；95°C30s, 60°C 30s, 72°C lmin，10 個循環(huán)；95°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin，10 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ;4°C終止。2)毛細管電泳使用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對步驟I)的各PCR產(chǎn)物同時進行毛細管電泳檢測，操作步驟如下用甲酰胺為上樣緩沖液(美國貝克曼庫爾特公司，目錄編號608082)，DNA size standard Kit-400 Base Pairs (美國貝克曼庫爾特公司，目錄編號608098)與上樣緩沖液按體積比I: (80-160)徹底混勻，在樣品板上每孔加入39 μ L混勻好的液體，用PCR產(chǎn)物進行10-100倍稀釋，取稀釋后的產(chǎn)物I μ L加至樣品板，吹打混勻，最后在每孔滴入一滴石蠟油封閉，以免甲酰胺氧化和樣品蒸發(fā)。在緩沖液板上每孔加入2/3的緩沖液，進行毛細管電泳。毛細管電泳的條件如下毛細管升溫 溫度50°C;變性90°C，120s ;注入樣品2. OKV, 30s ;分離6. 0KV，35min。利用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)分析檢測結(jié)果。結(jié)果13種HA亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品均可擴增得到190— 192bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實，該擴增產(chǎn)物的序列為引物對A的靶序列；非禽流感病毒及陰性對照無任何擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對A的特異性很好，可特異檢出13種HA亞型(Hl—H13亞型)的禽流感病毒。另外，將引物對A的序列與H14、H15、H16亞型禽流感病毒的RNA序列進行NCBI BLASA比對，同源性很高，如引物對A的序列與H14N6 (登錄號CY005394)、H14N5 (登錄號為:CY014605)、H14N5 (登錄號為⑶052253)、H15N9 (登錄號 CY077617)、H15N6 (登錄號為⑶052261 )、H15N9 (登錄號為:CY005406)、H16N3 (登錄號為HM060055)的靶引物序列同源性均為100. 00%，說明引物對A也可檢出H14、H15、H16亞型禽流感病毒。2、引物對B的特異性檢測I) PCR 擴增 用引物對B對步驟一中I的H5亞型(H5N1和H5N3)禽流感病毒毒株的cDNA樣品分別進行PCR擴增，同時分別擴增步驟一獲得的H7N2和H9N2亞型禽流感病毒毒株、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株、7種雞毒支原體毒株、5種滑液囊支原體毒株和2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品以及陰性培養(yǎng)物的DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果2種H5亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品可擴增得到223_226bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實，該擴增產(chǎn)物的序列為弓I物對B的靶序列；非H5亞型禽流感病毒及陰性對照無任何擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對B的特異性很好，可以特異檢出H5亞型禽流感病毒。3、引物對C的特異性檢測I) PCR 擴增用引物對C對步驟一中I的H7亞型(H7N2)禽流感病毒毒株的cDNA樣品分別進行PCR擴增，同時分別擴增步驟一獲得的H5N3和H9N2亞型禽流感病毒毒株、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株、7種雞毒支原體毒株、5種滑液囊支原體毒株和2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品以及陰性培養(yǎng)物的DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果H7亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品可擴增得到175— 177bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實，該擴增產(chǎn)物的序列為引物對C的靶序列；非H7亞型禽流感病毒及陰性對照無任何擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對C的特異性很好，可以特異檢出H7亞型禽流感病毒。4、引物對D的特異性檢測I) PCR 擴增
用引物對D對步驟一中I的H9亞型(H9N2和H9N6)禽流感病毒毒株的cDNA樣品分別進行PCR擴增，同時分別擴增步驟一獲得的H5N3和H7N2亞型禽流感病毒毒株、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株、7種雞毒支原體毒株、5種滑液囊支原體毒株和2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品以及陰性培養(yǎng)物的DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果H9亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品可擴增得到118bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實，該擴增產(chǎn)物的序列為引物對D的靶序列；非!19亞型禽流感病毒及陰性對照無任何擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對D的特異性很好，可以特異檢出H9亞型禽流感病毒。5、引物對E的特異性檢測·I) PCR 擴增用引物對E對步驟一中I的10種新城疫病毒毒株的cDNA樣品分別進行PCR擴增，同時分別擴增步驟一獲得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亞型禽流感病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株、7種雞毒支原體毒株、5種滑液囊支原體毒株和2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品以及陰性培養(yǎng)物的DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果10種新城疫病毒毒株的cDNA樣品均擴增得到126— 129bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實，該擴增產(chǎn)物的序列為引物對E的靶序列；非新城疫病毒及陰性對照無任何擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對E的特異性很好，可以特異檢出新城疫病毒。6、引物對F的特異性檢測I) PCR 擴增用引物對F對步驟一中I的8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品分別進行PCR擴增，同時分別擴增步驟一獲得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亞型禽流感病毒毒株和10種新城疫病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株、7種雞毒支原體毒株、5種滑液囊支原體毒株和2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品以及陰性培養(yǎng)物的DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品均擴增得到239— 241bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實，該擴增產(chǎn)物的序列為引物對F的靶序列；非傳染性支氣管炎病毒及陰性對照無任何擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對F的特異性很好，可以特異檢出傳染性支氣管炎病毒。7、引物對G的特異性檢測
I) PCR 擴增用引物對G對步驟一中2的5種傳染性喉氣管炎病毒毒株的DNA樣品分別進行PCR擴增，同時分別擴增步驟一獲得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亞型禽流感病毒毒株、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及7種雞毒支原體毒株、5種滑液囊支原體毒株、和2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品以及陰性培養(yǎng)物的DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果5種傳染性喉氣管炎病毒毒株的DNA樣品均擴增得到182— 185bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實，該擴增產(chǎn)物的序列為引物對G的靶序列；非傳染性喉氣管炎病毒及陰性對 照無任何擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對G的特異性很好，可以特異檢出傳染性喉氣管炎病毒。8、引物對H的特異性檢測I) PCR 擴增用引物對H對步驟一中2的7種雞毒支原體毒株的DNA樣品分別進行PCR擴增，同時分別擴增步驟一獲得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亞型禽流感病毒毒株、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株、5種滑液囊支原體毒株和2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品以及陰性培養(yǎng)物的DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果7種雞毒支原體毒株的DNA樣品均擴增得到200— 203bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實，該擴增產(chǎn)物的序列為引物對H的靶序列；非雞毒支原體及陰性對照無任何擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對H的特異性很好，可以特異檢出雞毒支原體。9、引物對I的特異性檢測I) PCR 擴增用引物對I對步驟一中2的5種滑液囊支原體毒株的DNA樣品分別進行PCR擴增，同時分別擴增步驟一獲得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亞型禽流感病毒毒株、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株、7種雞毒支原體毒株和2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品以及陰性培養(yǎng)物的DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果5種滑液囊支原體毒株的DNA樣品均擴增得到136_139bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實，該擴增產(chǎn)物的序列為引物對I的靶序列；非滑液囊支原體及陰性對照無任何擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對I的特異性很好，可以特異檢出滑液囊支原體。
10、引物對J的特異性檢測I) PCR 擴增用引物對J對步驟一中2的2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品分別進行PCR擴增，同時分別擴增步驟一獲得的H5N3、H7N2、H9N2和H9N6亞型禽流感病毒毒株、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株、7種雞毒支原體毒株和5種滑液囊支原體毒株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品以及陰性培養(yǎng)物的DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細管電泳與步驟I中2)方法相同。
結(jié)果2種副雞嗜血桿菌菌株的DNA樣品均擴增得到156— 159bp的擴增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實，該擴增產(chǎn)物的序列為引物對J的靶序列；非副雞嗜血桿菌及陰性對照無任何擴增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對J的特異性很好，可以特異檢出副雞嗜血桿菌。三、十種引物對混合的特異性檢測1)將引物對么、8、(、03、？、6、!1、I和J同時加入同一個PCR反應(yīng)體系，分別對步
驟一獲得的2種H5亞型禽流感病毒毒株、I種H7亞型禽流感病毒毒株、I種H9亞型禽流感病毒毒株、10種新城疫病毒毒株、8種傳染性支氣管炎病毒毒株、5種傳染性喉氣管炎病毒毒株、7種雞毒支原體毒株、5種滑液囊支原體毒株和2種副雞嗜血桿菌菌株的cDNA或DNA樣品進行擴增反應(yīng)，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下反應(yīng)體系(20μL) :GenomeLabTM GeXP Start Kit 5 X PCR Buffer (含 GeXP 通用引物對，美國貝克曼公司，PN A85017)4yL,引物對A、B、C、D、E、F、G、H、I和J (各引物對中的每條引物在反應(yīng)體系中的終濃度均為10nM)、25mM MgCl2 4 μ L(美國貝克曼公司，PNΑ25395)、Thermo-Start DNA Polymerase O. 7 μ L (美國貝克曼公司，PNA25395)，模板 cDNA或DNA O. 5pg-0. 5 μ g,加滅菌水至20 μ L。每個cDNA/DNA設(shè)置3個重復(fù)。反應(yīng)程序95°C預(yù)變性IOmin ;95°C 30s,50°C 30s，72°C lmin，10 個循環(huán)；95°C30s, 60°C 30s, 72°C lmin，10 個循環(huán)；95°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin，10 個循環(huán)；72°C延伸 IOmin ;4°C終止。2)毛細管電泳與“步驟二”中的“步驟I中2)”相同。結(jié)果七種引物對A-J混合后分別對9種病原體(H5、H7和H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體、滑液囊支原體和副雞嗜血桿菌)的單一 cDNA或DNA樣品檢測，分別檢出了 192bp和223bp、192bp和177bp、192bp和118bp、128bp、240bp、184bp、202bp、137bp和158bp的擴增產(chǎn)物，陰性對照無任何擴增產(chǎn)物。上述結(jié)果表明引物對A— J混合后對各引物對的特異性無影響，可用于特異地檢出禽流感病毒、H5、H7和H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體、滑液囊支原體和副雞嗜血桿菌中的每種病原體。實施例3、PCR引物對的靈敏度檢測一、制備含靶基因的單克隆質(zhì)粒標準品
分別以實施例2中步驟一獲得的禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒雞毒支原體、滑液囊支原體和副雞嗜血桿菌的cDNA或DNA樣品為模板，將PCR擴增獲得的禽流感病毒M基因、H5亞型禽流感病毒HA基因、H7亞型禽流感病毒HA基因、H9亞型禽流感病毒HA基因、新城疫病毒ND基因、傳染性支氣管炎病毒N基因和傳染性喉氣管炎病毒TK基因、雞毒支原體16rRNA基因、滑液囊支原體VLHA基因和副雞嗜血桿菌HA基因的全長cDNA或DNA片段,分別與質(zhì)粒pGEM-T Easy Vector連接(購自Promega公司)連接,獲得七種重組質(zhì)粒PA、PB、PC、PD、PE、PF、PG、PH、PI和PJ，經(jīng)測序證實這十種重組質(zhì)粒為質(zhì)粒pGEM_T EasyVector分別插入了一種上述基因的重組質(zhì)粒，且分別可作為上述10種引物對A— J的靶基因。利用紫外分光光度計測定各含靶基因重組質(zhì)粒的濃度，并根據(jù)重組質(zhì)粒的分子量和濃度計算相應(yīng)的拷貝數(shù)。將高濃度的各重組質(zhì)粒分別稀釋成靶基因濃度為106、105、104、103、IO2UO1拷貝/ μ L的單一質(zhì)粒稀釋液。將各重組質(zhì)?；旌?，制成在混合溶液中各質(zhì)粒的濃度均為IO5拷貝/ μ L的混合液，再按10倍比稀釋為ΙΟ4、103、IO2拷貝/ μ L的混合質(zhì)粒稀釋液。·二、十種引物對混合的靈敏度檢測I.以引物對A— J混合為引物，不同濃度的不同單一質(zhì)粒稀釋液為模板，按照實施例2中步驟三的方法進行PCR擴增和電泳檢測；結(jié)果，檢測禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測Η5亞型禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測Η7亞型禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測Η9亞型禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測新城疫病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測傳染性支氣管炎病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測傳染性喉氣管炎病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L,檢測雞毒支原體的靈敏度為100拷貝/ μ L,檢測滑液囊支原體的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測副雞嗜血桿菌的靈敏度為10拷貝/ μ L。2.以引物對A— J混合為引物，不同濃度的混合十種質(zhì)粒稀釋液為模板，按照實施例2中步驟三的方法進行PCR擴增和電泳檢測；結(jié)果，檢測禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測Η5亞型禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測Η7亞型禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測Η9亞型禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測新城疫病毒的靈敏度為100拷貝/y L，檢測傳染性支氣管炎病毒的靈敏度為10拷貝/y L，檢測傳染性喉氣管炎病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L,檢測雞毒支原體的靈敏度為100拷貝/ μ L,檢測滑液囊支原體的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測副雞嗜血桿菌的靈敏度為10拷貝/y L。實施例4、引物對檢測的準確率一、十種引物對混合檢測的準確率分別取經(jīng)HA基因測序鑒定為Η5亞型禽流感病毒和Η7亞型禽流感病毒的cDNA樣品，經(jīng)病毒分離、血凝抑制試驗、中和試驗等常規(guī)實驗方法分別鑒定為H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性喉氣管炎病毒的抗原液(按照實施例2中步驟一的方法分別提取cDNA或DNA)，經(jīng)常規(guī)PCR方法分別鑒定為雞毒支原體、滑液囊支原體、副雞嗜血桿菌的培養(yǎng)物(按照實施例2中步驟一的方法分別提取cDNA或DNA)，按照實施例2中步驟三的方法分別對上述單一病原體的cDNA或DNA樣品、上述病原體模擬臨床感染的樣品、上述9種病原體cDNA或DNA樣品的混合模板進行PCR擴增和電泳檢測，具體結(jié)果如下1、9種單一病原體的cDNA或DNA樣品均可檢出相應(yīng)病原體的目的峰，無其他雜峰，與上述測序、病毒分離、血凝抑制試驗、中和試驗和PCR等常規(guī)實驗方法的檢測結(jié)果相符合。2、模擬臨床感染從上述9種病原體的cDNA或DNA樣品中隨機選擇兩種病原體的cDNA或DNA混合，分如下兩組試驗第I組H5亞型禽流感病毒的cDNA和H9亞型禽流感病毒的cDNA混合作為模板，第2組傳染性支氣管炎病毒的cDNA和雞毒支原體的DNA混合作為模板；經(jīng)實施例2中步驟三的方法檢測，第I組可檢出116. 89bp、190. 26bp和223. 37bp·三個目的峰(圖I )，表明樣品中含有H5和H9亞型禽流感病毒的模板，與實際相符；第2組可檢出202. 03bp和240. 50bp兩個目的峰，無其他雜峰，表明樣品中含有傳染性支氣管炎病毒和雞毒支原體的模板(圖2),與實際相符。3、9種病原體混合可檢出10個目的峰(如圖3所示)，無其他雜峰，表明檢測樣品中含有H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體、滑液囊支原體、副雞嗜血桿菌的全部病原體的cDNA或DNA模板，與實際相符。
權(quán)利要求
1.鑒定或輔助鑒定家禽呼吸道病病原體的GeXP快速檢測的試劑或試劑盒，含有如下十種PCR引物對中的十種、任意九種、任意八種、任意七種、任意六種、任意五種、任意四種、任意三種、任意兩種或任意一種鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的PCR引物對A，鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒的PCR引物對B，鑒定或輔助鑒定H7亞型禽流感病毒的PCR引物對C，鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的PCR引物對D，鑒定或輔助鑒定新城疫病毒的PCR引物對E，鑒定或輔助鑒定傳染性支氣管炎病毒的PCR引物對F、鑒定或輔助鑒定傳染性喉氣管炎病毒的PCR引物對G，鑒定或輔助鑒定雞毒支原體的PCR引物對H，鑒定或輔助鑒定滑液囊支原體的PCR引物對I，鑒定或輔助鑒定副雞嗜血桿菌的PCR引物對J ； 所述PCR引物對A由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對C由序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對D由序列表序列7所示的單鏈DNA和序列表序列8所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對E由序列表序列9所示的單鏈DNA和序列表序列10所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對F由序列表序列11所示的單鏈DNA和序列表序列12所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對G由序列表序列13所示的單鏈DNA和序列表序列14所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對H由序列表序列15所示的單鏈DNA和序列表序列16所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對I由序列表序列17所示的單鏈DNA和序列表序列18所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對J由序列表序列19所示的單鏈DNA和序列表序列20所示的單鏈DNA組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑或試劑盒，其特征在于所述PCR引物對A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G和/或H和/或I和/或J的每條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑或試劑盒，其特征在于所述PCR引物對A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G和/或H和/或I和/或J的每條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度分別均為ΙΟηΜ。
4.如下引物對A-J在制備鑒定或輔助鑒定家禽呼吸道病病原體的試劑盒中的應(yīng)用； 所述PCR引物對A由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對C由序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對D由序列表序列7所示的單鏈DNA和序列表序列8所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對E由序列表序列9所示的單鏈DNA和序列表序列10所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對F由序列表序列11所示的單鏈DNA和序列表序列12所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對G由序列表序列13所示的單鏈DNA和序列表序列14所示的單鏈DNA組成；· 所述PCR引物對H由序列表序列15所示的單鏈DNA和序列表序列16所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對I由序列表序列17所示的單鏈DNA和序列表序列18所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對J由序列表序列19所示的單鏈DNA和序列表序列20所示的單鏈DNA組成； 所述病原體為禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體、滑液囊支原體和/或副雞嗜血桿菌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時鑒別9種雞呼吸道病病原體的GeXP快速檢測試劑盒。該試劑盒是基于GeXP系統(tǒng)使用的，包含10種PCR引物對，用于同時鑒別檢測禽流感病毒、H5、H7和H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒、雞毒支原體、滑液囊支原體和副雞嗜血桿菌，特異性好，靈敏度高，均可檢到100拷貝/μl，與病原體分離和血凝抑制實驗或血清學(xué)實驗等常規(guī)實驗方法的鑒定結(jié)果相比，符合率達100％。本發(fā)明為常見的主要雞呼吸道病及其病原體的檢測提供了簡便、高通量的檢測試劑盒和檢測體系，更符合實際的需要，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12Q1/70GK102899424SQ201210407739
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者謝芝勛, 羅思思, 謝麗基, 鄧顯文, 謝志勤, 龐耀珊, 劉加波, 范晴 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所