專利名稱：同時(shí)鑒別6種雞呼吸道病病毒的GeXP快速檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種同時(shí)鑒別6種雞呼吸道病病毒的GeXP快速檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
H5、H7和H9亞型禽流感、新城疫、傳染性支氣管炎和傳染性喉氣管炎是嚴(yán)重危害雞的6種主要病毒性呼吸道傳染性疾病。這些傳染病可感染不同年齡雞群，具有較高的發(fā)病率和死亡率，其臨床癥狀十分相似。鑒別診斷這些呼吸道疾病的傳統(tǒng)常規(guī)方法，主要包括病原分離鑒定和血清學(xué)試驗(yàn)等，但這些方法常受臨床病料新鮮度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁瑣費(fèi)時(shí)，對多重混合感染的鑒別診斷就更為困難。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于這些呼吸道病的檢測。但基于常規(guī)PCR技術(shù)建立的多重PCR檢測技術(shù)，需幾對引物組合在一起同時(shí)競爭地?cái)U(kuò)增，引物之間會產(chǎn)生相互干擾，多增 加一對引物，敏感性就越低。PCR產(chǎn)物需要通過瓊脂糖電泳才可觀察結(jié)果，該電泳難以區(qū)分50bp-100bp以內(nèi)的條帶，一般只可做到2-4重PCR，難以做到高通量檢測。多重?zé)晒釶CR —般只檢測到3重，由于探針要標(biāo)記不同發(fā)光波長的熒光基團(tuán)，如標(biāo)記太多的熒光基團(tuán)，相互會產(chǎn)生干擾，因此，也只能檢測到2-4重。由于在多重PCR反應(yīng)體系中同時(shí)存在幾對引物，使得形成復(fù)雜引物二聚體的概率大大增加，同時(shí)檢測的目的基因數(shù)量有限，使得多重PCR還達(dá)不到高通量快速檢測和分析的目標(biāo)。GeXP 系統(tǒng)(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美國BeckmanCo μ Lter公司研發(fā)的用于研究多基因表達(dá)定量分析的平臺，由兩部分組成用于設(shè)計(jì)引物的GeXP expression Profiler軟件和用于結(jié)果分析的GenomeLabTM GeXPGenetic Analysis System毛細(xì)管電泳儀,后者可清晰分離出相差7bp的相鄰擴(kuò)增片段。GeXP多重PCR擴(kuò)增采用熒光標(biāo)記通用引物和特異性嵌合引物(基因特異性引物末端連接通用引物序列)相結(jié)合引發(fā)多重體系擴(kuò)增。PCR反應(yīng)之初，先由正、反向嵌合引物的特異性序列以cDNA或DNA為模板啟動PCR反應(yīng)，分別擴(kuò)增出通用引物的互補(bǔ)序列；再由反應(yīng)體系中占主導(dǎo)地位的熒光標(biāo)記通用引物，與其互補(bǔ)序列結(jié)合，引發(fā)后續(xù)擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)GeXP毛細(xì)管電泳分離，含有熒光標(biāo)記的PCR產(chǎn)物經(jīng)GeXP檢測窗口檢測，依據(jù)檢測片段與標(biāo)準(zhǔn)分子片段(DNA Size Standard，DSS)遷移時(shí)間時(shí)間計(jì)算出擴(kuò)增片段的長度，根據(jù)片段大小區(qū)分不同的病原體，熒光信號強(qiáng)度代表該分離片段的擴(kuò)增含量?；贕eXP多重基因遺傳分析系統(tǒng)的平臺，可在同一個(gè)體系里對多達(dá)40個(gè)目的基因進(jìn)行有效分析，關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)，能達(dá)到同時(shí)鑒別檢測的目的。目前，還沒有基于GeXP系統(tǒng)的同時(shí)可檢測家禽多種呼吸道病病毒的試劑或試劑盒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種鑒定或輔助鑒定家禽呼吸道病病毒的GeXP快速檢測的試劑或試劑盒，含有如下七種PCR引物對中的七種、任意六種、任意五種、任意四種、任意三種、任意兩種或任一種鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的PCR引物對A，鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒的PCR引物對B，鑒定或輔助鑒定H7亞型禽流感病毒的PCR引物對C，鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的PCR引物對D，鑒定或輔助鑒定新城疫病毒的PCR引物對E，鑒定或輔助鑒定傳染性支氣管炎病毒的PCR引物對F和鑒定或輔助鑒定傳染性喉氣管炎病毒的PCR引物對G ;所述PCR引物對A由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對C由序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對D由序列表序列7所示的單鏈DNA和序列表序列8所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對E由序列表序列9所示的單鏈DNA和序列表序列10所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對F由序列表序列11所示的單鏈DNA和序列表序列12所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對G由序列表序列13所示的單鏈DNA和序列表序列14所示的單鏈DNA組成。在上述試劑或試劑盒中，所述PCR弓丨物對A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G的每條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度相同；在上述試劑或試劑盒中，所述PCR引物對A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G的每條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度均為ΙΟηΜ。本發(fā)明所提供的試劑或試劑盒中的引物對可檢測的病毒種類分別如下PCR引物對A可檢測16種HA亞型禽流感病毒，即Hl—H16亞型的禽流感病毒；PCR引物對B可檢測H5亞型禽流感病毒；PCR引物對C可檢測H7亞型禽流感病毒；PCR引物對D可檢測H9亞型禽流感病毒；PCR引物對E可檢測新城疫病毒；PCR引物對F可檢測傳染性支氣管炎病毒；PCR引物對G可檢測傳染性喉氣管炎病毒。本發(fā)明所提供的試劑或試劑盒中的引物對可用于檢測的病毒來源分別如下PCR引物對A可檢測禽源的禽流感病毒，PCR引物對B可檢測禽源的H5亞型禽流感病毒，PCR引物對C可檢測禽源的H7亞型禽流感病毒，PCR引物對D可檢測禽源的H9亞型禽流感病毒，PCR引物對E可檢測禽源的新城疫病毒，PCR引物對F可檢測禽源的傳染性支氣管炎病毒病毒，PCR引物對G可檢測禽源的傳染性喉氣管炎病毒病毒；所述禽源具體可為雞源或鴨源，但不限于上述病毒的上述來源。本發(fā)明保護(hù)如下引物對A-G在制備鑒定或輔助鑒定家禽呼吸道病病毒的試劑盒中的應(yīng)用所述PCR引物對A由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組成；
所述PCR引物對C由序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對D由序列表序列7所示的單鏈DNA和序列表序列8所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對E由序列表序列9所示的單鏈DNA和序列表序列10所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對F由序列表序列11所示的單鏈DNA和序列表序列12所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對G由序列表序列13所示的單鏈DNA和序列表序列14所示的單鏈DNA組成； 所述病毒為禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和/或傳染性喉氣管炎病毒。使用本發(fā)明所提供的基于GeXP系統(tǒng)的試劑或試劑盒中的7種引物對同時(shí)檢測禽流感病毒、H5、H7和H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性喉氣管炎病毒的特異性強(qiáng)，靈敏度分別為100拷貝/ μ I、10拷貝/ μ I、10拷貝/ μ I、100拷貝/μ I、10拷貝/ μ I、100拷貝/ μ I、100拷貝/ μ 1，與病毒分離和血凝抑制實(shí)驗(yàn)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法的鑒定結(jié)果相比，符合率達(dá)100%。本發(fā)明為常見的主要雞病毒性呼吸道病的檢測提供了簡便、高通量的檢測試劑盒和檢測體系，更符合實(shí)際的需要，應(yīng)用前景廣闊。


圖I為Η5、Η9亞型禽流感病毒cDNA混合模板的GeXP七重PCR的毛細(xì)管電泳分析圖。圖2為H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管炎病毒的cDNA混合模板的GeXP七重PCR的毛細(xì)管電泳分析圖。圖3為6種病毒性呼吸道病原的GeXP七重PCR的毛細(xì)管電泳分析I一3中，橫坐標(biāo)為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基數(shù)，縱坐標(biāo)為熒光信號值。
具體實(shí)施例方式
下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、PCR引物對的設(shè)計(jì)以GenBank公布的引物序列為參考，從NCBI上下載已知序列使用DNASTAR軟件進(jìn)行序列比對，選取針對各個(gè)靶基因高度保守與特異的基因片段，由premier 5. O軟件設(shè)計(jì)了 7重特異性引物，并在引物的5’端添加GeXP通用引物(下劃線標(biāo)出的序列)，引物方向均為從5’-3’端，具體如下I)、以禽流感病毒(AIV)M基因?yàn)榘谢虻囊飳 :AIV-Fl:AGGTGACACTATAGAATAAGCGATTCAAGTGATCCTCT (序列表序列 I);AIV-Rl:GTACGACTCACTATAGGGAAGGCACTCCTTCCGTAGAAGG (序列表序列 2)；預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為187bp ；
靶序列為Genbank DQ485227. I 的第 771-790 和第 900-920 位。2)、以H5亞型禽流感病毒(AIV_H5)HA基因?yàn)榘谢虻囊飳 :AIV-H5-F1: AGGTGACACTATAGAATAGGAAAGTGTAAGAAACGGAACGTA (序列表序列 3)；AIV-H5-R1 :GTACGACTCACTATAGGGACACATCCATAAAGAYAGACCAGC(序列表序列 4，其中的Y為兼并堿基，Y=c/T)；預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為223bp ；靶序列為Genbank DQ095615. I 的第 1485-1508 和第 1648-1670 位。3)、以H7亞型禽流感病毒(AIV_H7)HA基因?yàn)榘谢虻囊飳 AIV-H7-F1: AGGTGACACTATAGAATAAGTGGAAACAAGTTGATAACAGT (序列表序列 5 序列)； AIV-H7-R1 :GTACGACTCACTATAGGGATGCCCCATTGAAASTGAA (序列表序列 6 序列，其中的S為兼并堿基，S=C/G)；預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為175bp ；靶序列為Genbank EU742995. 2 的第 616-638 和第 736-753 位。4)、以H9亞型禽流感病毒(AIV_H9)HA基因?yàn)榘谢虻囊飳 :AIV-H9-F1: AGGTGACACTATAGAATAACCATTTATTCGACTGTCGCCT (序列表序列 7 序列)；AIV-H9-R1: GTACGACTCACTATAGGGACATTGGACATGGCCCAGAA (序列表序列 8 序列)；預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為116bp ；靶序列為GenbankDQ485208 的第 1609-1630 和第 1669-1687 位。5)、以新城疫病毒(NDV)F基因?yàn)榘谢虻囊飳 :NDV-Fl: AGGTGACACTATAGAATACACAAGTCGGTTCTGTGATAG (序列表序列 9 序列)；NDV-Rl: GTACGACTCACTATAGGGAGCTCAAACAGGAATAAATACC (序列表序列 10 序列)；預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為159bp ；靶序列為Genbank ABG29388 的第 971-991 和第 1072-1092 位。6)、以傳染性支氣管炎病毒(IBV)N基因?yàn)榘谢虻囊飳 :IBV-Fl: AGGTGACACTATAGAATATGGTGATGACAAGATGAffTGAG (序列表序列 11 序列，其中的W為兼并堿基，W=A/T)；IBV-Rl:GTACGACTCACTATAGGGATACTTCCAAAAAGACAAGCATG (序列表序列 12 序列)；預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物長度(即目的峰位置)為135bp ；靶序列為Genbank ⑶393338 的第 26700-26721 和第 26776-26797 位。7)、以傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)TK基因?yàn)榘谢虻囊飳 :ILTV-Fl: AGGTGACACTATAGAATATGTTGCACAATATCTAAGCG (序列表序列 13 序列)；ILTV-Rl: GTACGACTCACTATAGGGAATGTACGTTGGAGGTAGGTG (序列表序列 14 序列)；預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度(即目的峰位置)為276bp ；靶序列為Genbank HM230797 的第 1506-1525 和第 1725-1744 位。根據(jù)實(shí)際檢測的病原體的毒株不同以及GeXP系統(tǒng)如GenomeLabTM GeXPGeneticAnalysis System毛細(xì)管電泳儀的誤差,使用上述引物對A—G及GeXP通用引物對檢測獲得的實(shí)際擴(kuò)增產(chǎn)物長度可在預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度基礎(chǔ)上上下波動3bp。實(shí)施例2、PCR引物對的特異性檢測一、模板的制備
I、病毒RNA提取及cDNA的獲得I)病毒RNA提取使用試劑盒MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 4. O (大連 TaKaRa公司，產(chǎn)品編號為DV819A)按照試劑盒說明書，分別從如下病毒毒株的雞胚尿囊液中提取RNA (以提取陰性雞胚尿囊液獲得的樣品為陰性對照樣品)禽流感病毒毒株Duck/HK/717/79-dl (H1N3 亞型)、Duck/HK/77/76 (H2N3 亞型)、Duck/HK/526/79/2B (H3N6 亞型)、Duck/HK/668/79 (H4N5 亞型)、Duck/HK/531/79 (H6N8 亞型)、Turkey/ont/6118/68 (H8N4亞型)、Duck/Guangxi/1/00 (H9N2 亞型)、Duck/HK/876/80 (H10N3 亞型)、Duck/HK/661/79(H11N3 亞型)、Duck/HK/862/80 (H12N5 亞型)、Gull/MD/704/77 (H13N5 亞型)(文獻(xiàn)Zhixun Xie,Yao-shan Pang, Jiabo Liu, et al. A multiplex RT-PCR for detection oftype A influenza virus and differentiation of avian H5, H7, and H9hemagglutininsubtypes[J]. Molecular and Cellular Probes, 2006，20(3-4):245-249. ) ; 10 種新城疫病毒毒株 F48E9 株、Mukteswar 株、C30 株、V4 株、Ulster 株、Losota, GX1/00、GX2/00、 GX6/02、GX7/02 (文獻(xiàn)陳安莉，謝芝勛，周辰瑜，等.新城疫病毒強(qiáng)弱毒株LAMP鑒別檢測方法的建立[J]·中國獸醫(yī)科學(xué)，2011，41 (09) :917-922. ) ;8種傳染性支氣管炎病毒毒株:Massachussetts 41、Connecticut (Conn)、Arkansas (Ark)、Delaware (DE/2686/92)、PA、JMK, H52、廣西分離株GXIB/02 (文獻(xiàn)謝志勤，謝芝勛，呂華剛.等.30株雞傳染性支氣管炎病毒標(biāo)準(zhǔn)株與分離株SI基因的克隆及序列分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21 (6) : 1733-1736.)。2)cDNA 的獲得將步驟I)獲得的RNA樣品分別按照如下反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA ;以DEPC水作為總RNA的對照。反應(yīng)體系(20μ L) :5X Reverse Transcriptase Buffer 4 μ L, RandomPrimer(9mer)50pmol> dNTP Mixture (IOmM)2 μ L, Ribonuclease Inhibitor 20U, AMVReverseTranscriptase,模板 RNA I μ g, DEPC 水補(bǔ)足至 20 μ L。用反轉(zhuǎn)錄試劑Random Primer (9mer)、dNTP Mixture、Ribonuclease Inhibitor、Reverse Transcriptase XL(AMV)(均購自大連TaKaRa公司，目錄號分別為 D3802、D4030RA、D2313A、D2620)。反應(yīng)條件抽提的總RNA加完DEPC水和Random Primer (9mer)后，瞬離，70°C IOmin后立即冰浴5min。加完其余四樣后，瞬離，42°C I. 5h，置于_20°C保存。3)禽流感病毒毒株 Chicken/Guangxi/1/04 (H5N1 亞型)、Duck/HK/313/78(H5N3亞型)和Duck/HK/47/76 (H7N2亞型)分別是以cDNA形式留存的樣品，并已經(jīng)HA基因測序證實(shí)(記載上述毒株的文獻(xiàn)Zhixun Xie, Yao-shan Pang, Jiabo Liu, et al. Amultiplex RT-PCR for detection of type A influenza virus and differentiationof avian H5, H7, and H9 hemagglutinin subtypes[J]. Molecular and CellularProbes, 2006，20(3-4) : 245-249)。2、基因組DNA的提取使用血液組織細(xì)胞基因組提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，產(chǎn)品編號DP304)，按照試劑盒說明書，分別提取如下5種傳染性喉氣管炎病毒毒株的雞胚尿囊液的病毒基因組DNA (以提取陰性雞胚尿囊液獲得的樣品為陰性對照樣品)北京株、臺灣疫苗株、美國標(biāo)準(zhǔn)株、以色列疫苗株、廣西分離株(文獻(xiàn)謝芝勛，謝志勤，龐耀珊.等.采用二溫氏聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增雞喉氣管炎病毒TK基因的研究[J].中國獸醫(yī)科技，2000，30(9) :5-7)。3、測定核酸含量用核酸蛋白分析儀BioPhotometer測定其OD值,得出其濃度與純度值,并以此控制核酸質(zhì)量。二、各引物對單重PCR的·特異性檢測I、引物對A的特異性檢測I) PCR 擴(kuò)增用引物對A對步驟一中I獲得的13種HA亞型禽流感病毒毒株、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及步驟一中2獲得的5種傳染性喉氣管炎病毒毒株的DNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下反應(yīng)體系(20μL) :GenomeLabTM GeXP StartKit 5 X PCR Buffer (含 GeXP 通用引物對，美國貝克曼公司，PN A85017)4yL,引物對A (每條引物在反應(yīng)體系中的終濃度為 10nM)、25mM MgCl24 μ L (美國貝克曼公司，PN Α25395)、Thermo-Start DNAPolymerase0.7yL(美國貝克曼公司，PN A25395),模板cDNA或DNA O. 5pg-0. 5 μ g,加滅菌水至20 μ L0每個(gè)cDNA/DNA設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)程序95°C預(yù)變性IOmin ；95°C 30s,50°C 30s,72°C lmin，10 個(gè)循環(huán)；95°C 30s，60°C 30s, 72°C lmin, 10 個(gè)循環(huán)；95°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin, 10 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；
4°C終止。2)毛細(xì)管電泳使用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)對步驟I)的各PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，操作步驟如下用甲酰胺為上樣緩沖液(美國貝克曼庫爾特公司，目錄編號608082)，DNA size standard Kit_400Base Pairs (美國貝克曼庫爾特公司，目錄編號608098)與上樣緩沖液按體積比I 80-160徹底混勻，在樣品板上每孔加入39 μ L混勻好的液體，用PCR產(chǎn)物進(jìn)行10-100倍稀釋，取稀釋后的產(chǎn)物IyL加至樣品板，吹打混勻，最后在每孔滴入一滴石蠟油封閉，以免甲酰胺氧化和樣品蒸發(fā)。在緩沖液板上每孔加入2/3的緩沖液，進(jìn)行毛細(xì)管電泳。毛細(xì)管電泳的條件如下毛細(xì)管升溫溫度50°C ;變性90°C，120s ;注入樣品2. OKV, 30s ;分離6. 0KV,35min。利用GenomeLabGeXP遺傳分析系統(tǒng)分析檢測結(jié)果。結(jié)果13種HA亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品均可擴(kuò)增得到188bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實(shí)，該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對A的靶序列；非禽流感病毒及陰性對照無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對A的特異性很好，可特異檢出13種HA亞型(H1-H13亞型)的禽流感病毒。另外，將引物對A的序列與H14、H15、H16亞型禽流感病毒的RNA序列進(jìn)行NCBIBLASA比對，同源性很高，如引物對A的序列與H14N6 (登錄號CY005394)、H14N5 (登錄號為:CY014605)、H14N5 (登錄號為⑶052253)、H15N9 (登錄號 CY077617)、H15N6 (登錄號為GU05226O.H15N9 (登錄號為:CY005406)、H16N3 (登錄號為:AY684908)、H16N3 (登錄號為HM060055)的靶引物序列同源性均為100. 00%，說明引物對A也可檢出H14、H15、H16亞型禽流感病毒。2、引物對B的特異性檢測I) PCR 擴(kuò)增用引物對B對步驟一中I的H5亞型禽流感病毒毒株H5N1和H5N3的cDNA樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的禽流感病毒毒株H7N2和H9N2、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。 2)毛細(xì)管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果兩種H5亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品可擴(kuò)增得到223—225bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實(shí)，該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為弓I物對B的靶序列；非H5亞型禽流感病毒及陰性對照無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對B的特異性很好，可以特異檢出H5亞型禽流感病毒。3、引物對C的特異性檢測用引物對C對步驟一中I獲得的H7亞型禽流感病毒毒株H7N2的cDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的禽流感病毒毒株H5N3和H9N2、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細(xì)管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果H7亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品可擴(kuò)增得到175— 177bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實(shí)，該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對C的靶序列；非H7亞型禽流感病毒及陰性對照無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對C的特異性很好，可以特異檢出H7亞型禽流感病毒。4、引物對D的特異性檢測I) PCR 擴(kuò)增用引物對D對步驟一中I獲得的H9亞型禽流感病毒毒株H9N2的cDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的禽流感病毒毒株H5N3和H7N2、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細(xì)管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果H9亞型禽流感病毒毒株的cDNA樣品可擴(kuò)增得到116 — 118bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實(shí)，該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對D的靶序列；非H9亞型禽流感病毒及陰性對照無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對D的特異性很好，可以特異檢出H9亞型禽流感病毒。5、引物對E的特異性檢測I) PCR 擴(kuò)增用引物對E對步驟一中I獲得的10種新城疫病毒毒株的cDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的禽流感病毒毒株H5N3、H7N2和H9N2和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細(xì)管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果新城疫病毒毒株的cDNA樣品可擴(kuò)增得到159— 162bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測序證實(shí)，該擴(kuò)增產(chǎn)物的序列為引物對E的靶序列；非新城疫病毒毒株及陰性對照無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對E的特異性很好，可以特異檢出新城疫病毒。6、引物對F的特異性檢測
I) PCR 擴(kuò)增用引物對F對步驟一中I獲得的8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的禽流感病毒毒株H5N3、H7N2和H9N2和10種新城疫病毒毒株的cDNA樣品以及5種傳染性喉氣管炎病毒毒株的DNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細(xì)管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品可擴(kuò)增得到135_137bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序證實(shí)為引物對F的靶序列，非傳染性支氣管炎病毒毒株及對照無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對F的特異性很好，可以特異檢出傳染性支氣管炎病毒。7、引物對G的特異性檢測I) PCR 擴(kuò)增用引物對G對步驟一中2獲得的5種傳染性喉氣管炎病毒毒株的DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時(shí)分別擴(kuò)增步驟一獲得的禽流感病毒毒株H5N3、H7N2和H9N2、10種新城疫病毒毒株和8種傳染性支氣管炎病毒毒株的cDNA樣品，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與步驟I中I)方法相同。2)毛細(xì)管電泳與步驟I中2)方法相同。結(jié)果傳染性喉氣管炎病毒毒株的DNA樣品可擴(kuò)增得到276— 278bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測序證實(shí)為引物對G的靶序列，非傳染性喉氣管炎病毒毒株及對照無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明，引物對F的特異性很好，可以特異檢出傳染性喉氣管炎病毒。三、七種弓丨物對混合的特異性檢測I)將引物對A、B、C、D、E、F和G同時(shí)加入同一個(gè)PCR反應(yīng)體系，分別對步驟一獲得的H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒或傳染性喉氣管炎病毒毒株的cDNA或DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，以步驟一獲得的陰性雞胚尿囊液的cDNA樣品和DNA樣品為陰性對照，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序如下反應(yīng)體系(20μL) :GenomeLabTM GeXP StartKit 5 X PCR Buffer (含 GeXP 通用引物對，美國貝克曼公司，PN A85017)4yL,引物對A、B、C、D、E、F和G (各引物對中的每條引物在反應(yīng)體系中的終濃度均為10nM)、25mM MgCl24 μ L(美國貝克曼公司，ΡΝΑ25395)、Thermo-Start DNA Polymerase O. 7 μ L(美國貝克曼公司，PN Α25395)，模板 cDNA 或 DNAO. 5pg-0. 5 μ g,加滅菌水至20 μ L。每個(gè)cDNA/DNA設(shè)置3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)程序:95°C預(yù)變性IOmin ；95°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin，10 個(gè)循環(huán)；95°C 30s,60°C 30s, 72°C lmin, 10 個(gè)循環(huán)；95°C 30s, 50°C 30s, 72°C lmin, 10 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin ；
4°C終止。2)毛細(xì)管電泳與“步驟二”中的“步驟I中2)”相同。結(jié)果七種引物對A-G混合后分別對6種病毒(H5、H7和H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒)毒株的單一 cDNA或DNA樣品檢測,分別檢出了 188bp 和 223bp、188bp 和 177bp、188bp 和 118bp、160bp、135bp 和 276bp 的擴(kuò)增產(chǎn)物，陰性對照無任何擴(kuò)增產(chǎn)物。 上述結(jié)果表明引物對A-G混合后對各引物對的特異性無影響，可用于特異地檢出禽流感病毒、H5、H7和H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒中的每種病毒。實(shí)施例3、PCR引物對的靈敏度檢測一、制備含靶基因的單克隆質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別以實(shí)施例2中步驟一獲得的禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒的cDNA或DNA樣品為模板，將PCR擴(kuò)增獲得的禽流感病毒M基因、H5亞型禽流感病毒HA基因、H7亞型禽流感病毒HA基因、H9亞型禽流感病毒HA基因、新城疫病毒ND基因、傳染性支氣管炎病毒N基因和傳染性喉氣管炎病毒TK基因的全長cDNA或DNA片段分別與質(zhì)粒pGEM_TEasy Vector連接(購自Promega公司)連接，獲得七種重組質(zhì)粒PA、PB、PC、PD、PE、PF和PG,經(jīng)測序證實(shí)這七種重組質(zhì)粒為質(zhì)粒pGEM-T EasyVector分別插入了一種上述基因的重組質(zhì)粒，且分別可作為上述7種引物對A— G的靶基因。利用紫外分光光度計(jì)測定各含靶基因重組質(zhì)粒的濃度，并根據(jù)重組質(zhì)粒的分子量和濃度計(jì)算相應(yīng)的拷貝數(shù)。將高濃度的各重組質(zhì)粒分別稀釋成靶基因濃度為107、106、105、104、IO3, IO2UO1拷貝/ μ L的單一質(zhì)粒稀釋液。將各重組質(zhì)粒混合，制成在混合溶液中各質(zhì)粒的濃度均為IO6拷貝/ μ L的混合液，再按10倍比稀釋為105、104、103、102拷貝/ μ L的混合質(zhì)粒稀釋液。二、七種引物對混合的靈敏度檢測I.以引物對A— G混合為引物，不同濃度的不同單一質(zhì)粒稀釋液為模板，按照實(shí)施例2中步驟三的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測；結(jié)果，檢測禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測Η5亞型禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測Η7亞型禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測Η9亞型禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測新城疫病毒的靈敏度為10拷貝/y L，檢測傳染性支氣管炎病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測傳染性喉氣管炎病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L。2.以引物對A— G混合為引物，不同濃度的混合七種質(zhì)粒稀釋液為模板，按照實(shí)施例2中步驟三的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測；結(jié)果，檢測禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測Η5亞型禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測Η7亞型禽流感病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測Η9亞型禽流感病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測新城疫病毒的靈敏度為10拷貝/ μ L，檢測傳染性支氣管炎病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L，檢測傳染性喉氣管炎病毒的靈敏度為100拷貝/ μ L。實(shí)施例4、七種引物對混合檢測的準(zhǔn)確率分別取經(jīng)HA基因測序鑒定為Η5亞型禽流感病毒和Η7亞型禽流感病毒的cDNA樣品，經(jīng)病毒分離、血凝抑制試驗(yàn)、中和試驗(yàn)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法分別鑒定為H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性喉氣管炎病毒的抗原液(按照實(shí)施例2中步驟一的方法分別提取cDNA或DNA)，按照實(shí)施例2中步驟三的方法分別對上述單一病毒的cDNA或DNA樣品、上述病毒模擬臨床感染的樣品、上述6種病毒cDNA或DNA樣品的混合模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增和電泳檢測，具體結(jié)果如下I、6種單一病毒的cDNA或DNA樣品均可檢出相應(yīng)病毒的目的峰，無其他雜峰,與上述測序、病毒分離、血凝抑制試驗(yàn)和中和試驗(yàn)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法的檢測結(jié)果相符合。 2、模擬臨床感染隨機(jī)從上述6種病原體(病毒)的cDNA或DNA樣品中選擇兩種病原體的cDNA或DNA混合，分如下兩組試驗(yàn)第I組H5亞型禽流感病毒cDNA和H9亞型禽流感病毒cDNA混合作為模板，第2組H9亞型禽流感毒株cDNA、新城疫毒株cDNA和傳染性支氣管毒株cDNA混合作為模板；經(jīng)實(shí)施例2中步驟三的方法檢測，第I組可檢出117. 31bp、188. 42bp和223. 14bp三個(gè)目的峰(圖I )，表明樣品中含有H5和H9亞型禽流感病毒的模板，與實(shí)際相符；第2組可檢出118. 18bp、135. 13bp、160. 75三個(gè)目的峰，無其他雜峰，表明樣品中含有H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒和傳染性支氣管病毒的模板(圖2),與實(shí)際相符。3、6種病原體混合可檢出7個(gè)目的峰(如圖3所示)，無其他雜峰，表明檢測樣品中含有H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒的全部模板，與實(shí)際相符。
權(quán)利要求
1.鑒定或輔助鑒定家禽呼吸道病病毒的GeXP快速檢測的試劑或試劑盒，含有如下七種PCR引物對中的七種、任意六種、任意五種、任意四種、任意三種、任意兩種或任一種鑒定或輔助鑒定禽流感病毒的PCR引物對A，鑒定或輔助鑒定H5亞型禽流感病毒的PCR引物對B，鑒定或輔助鑒定H7亞型禽流感病毒的PCR引物對C，鑒定或輔助鑒定H9亞型禽流感病毒的PCR引物對D，鑒定或輔助鑒定新城疫病毒的PCR引物對E，鑒定或輔助鑒定傳染性支氣管炎病毒的PCR引物對F和鑒定或輔助鑒定傳染性喉氣管炎病毒的PCR引物對G ； 所述PCR引物對A由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對C由序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對D由序列表序列7所示的單鏈DNA和序列表序列8所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對E由序列表序列9所示的單鏈DNA和序列表序列10所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對F由序列表序列11所示的單鏈DNA和序列表序列12所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對G由序列表序列13所示的單鏈DNA和序列表序列14所示的單鏈DNA組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑或試劑盒，其特征在于所述PCR引物對A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G的每條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度相同。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的試劑或試劑盒，其特征在于所述PCR引物對A和/或B和/或C和/或D和/或E和/或F和/或G的每條單鏈DNA在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度分別均為ΙΟηΜ。
4.如下引物對A-G在制備鑒定或輔助鑒定家禽呼吸道病病毒的試劑盒中的應(yīng)用 所述PCR引物對A由序列表序列I所示的單鏈DNA和序列表序列2所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對B由序列表序列3所示的單鏈DNA和序列表序列4所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對C由序列表序列5所示的單鏈DNA和序列表序列6所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對D由序列表序列7所示的單鏈DNA和序列表序列8所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對E由序列表序列9所示的單鏈DNA和序列表序列10所示的單鏈DNA組成； 所述PCR引物對F由序列表序列11所示的單鏈DNA和序列表序列12所示的單鏈DNA組成；所述PCR引物對G由序列表序列13所示的單鏈DNA和序列表序列14所示的單鏈DNA組成； 所述病毒 為禽流感病毒、H5亞型禽流感病毒、H7亞型禽流感病毒、H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和/或傳染性喉氣管炎病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種同時(shí)鑒別6種雞呼吸道病病毒的GeXP快速檢測試劑盒。該試劑盒是基于GeXP系統(tǒng)使用的，包含7種PCR引物對，用于同時(shí)檢測禽流感病毒、H5、H7和H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒和傳染性喉氣管炎病毒的特異性強(qiáng)，靈敏度均可達(dá)到100拷貝/μl，與病毒分離和血凝抑制實(shí)驗(yàn)等常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法的鑒定結(jié)果相比，符合率達(dá)100%。本發(fā)明為常見的主要雞病毒性呼吸道病的檢測提供了簡便、高通量的檢測試劑盒和檢測體系，更符合實(shí)際的需要，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號C12Q1/68GK102899423SQ201210407318
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月23日
發(fā)明者謝芝勛, 羅思思, 謝麗基, 鄧顯文, 謝志勤, 龐耀珊, 劉加波, 范晴 申請人:廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所