專利名稱：冬蟲夏草中國被毛孢5’-核苷酸酶、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一個來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢的參與嘧啶核苷酸出發(fā)合成代謝嘧啶的5’ -核苷酸酶(5’ -nucleotidase),以及編碼這個酶的基因及其應(yīng)用。背景技術(shù)：
冬蟲夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲夏草菌寄生在鱗翅目 (Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲上的子座及幼蟲尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲體)。冬蟲夏草是一類珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認為，冬蟲夏草入肺腎二經(jīng)，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛，陽痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調(diào)節(jié)陰陽的中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)已證實，冬蟲夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。
冬蟲夏草菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實際生產(chǎn)中使用的是無性階段的冬蟲夏草菌，因而冬蟲夏草無性型的鑒定非常重要。國內(nèi)外學(xué)者在冬蟲夏草資源調(diào)查、無性型確證、活性成分分離分析和作用機理、開發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲夏草中國被毛孢已被證明是冬蟲夏草的無性型存在形式，具有與天然冬蟲夏草相同的活性成分和藥效。
天然蟲草具有嚴格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產(chǎn)量很低，價格高昂。野生冬蟲夏草由于受生長環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進展不大，野生冬蟲夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液，是解決冬蟲夏草藥源的一種有效途徑。蟲草發(fā)酵生產(chǎn)蟲草替代品，既可有效保護蟲草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環(huán)境和蟲草寄生條件嚴格的限制，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲草相似，因而國內(nèi)外一直致力于蟲草菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲夏草中國被毛孢得到的菌絲，經(jīng)毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲草化學(xué)組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲草生產(chǎn)蟲草制品，以彌補自然資源的短缺，通過對發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌絲體生物量和代謝產(chǎn)物的量均有明顯提聞。
近年來，隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和現(xiàn)代色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，在對蟲草產(chǎn)品研發(fā)中已逐步由蟲草原料或粗提物的直接利用轉(zhuǎn)向更深層次的功能性 代謝產(chǎn)物研究。國內(nèi)外已對蟲草代謝產(chǎn)物做了大量的研究，代謝產(chǎn)物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類化合物，其中嘌呤類核苷、蟲草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產(chǎn)物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見成效。
核苷類是蟲草最主要的活性物質(zhì)之一，其中嘧啶類核苷包括胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷。尿喃唳核苷(uracil riboside)又稱尿苷(ulidine),別稱由雪核糖苷、二氫喃唳核苷、1-β-D-喃核糖基尿喃唳。胞喃唳核苷(cytosine riboside)又名胞苷(cytidine)、胞啶、l-β -D-呋喃核苷胞嘧啶。嘧啶核苷是多用途的核苷，可作為保健品和食品的添加劑。 它作為美容和抗紫外輻射化妝品也逐漸成為人們生活的必需品，作為藥物，已臨床應(yīng)用于中樞神經(jīng)、泌尿、代謝和心血管等多方面的疾病，在美國，核酸類藥品近年來在抗病毒、抗腫瘤方面顯示了不可替代的作用。
由于嘌呤嘧啶及其類似物的重要生理作用，國內(nèi)外有關(guān)微生物生產(chǎn)嘌呤類核苷已有很多研究。然而，作為重要合成代謝嘌呤類核苷的冬蟲夏草菌，還只停留在代謝產(chǎn)物成分分析和功效的研究上，對冬蟲夏草菌嘌呤類核苷合成代謝途徑中相關(guān)基因和蛋白的研究還很少見。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對以上存在的不足和需要解決的技術(shù)問題，對“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢合成代謝嘧啶的酶及其編碼基因進行深入研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與嘧啶核苷酸出發(fā)合成代謝嘧啶的酶(即5’ -核苷酸酶)、編碼基因及其應(yīng)用。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
本發(fā)明提供一種來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與嘧啶核苷酸出發(fā)合成代謝嘧啶的5’-核苷酸酶，所述酶具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列90%以上同源性，優(yōu)選其氨基酸序列為SEQ ID No.1所示(記為pynD蛋白)；該酶可催化嘧啶核苷酸制備嘧啶。 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護范圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變， 如用色氨酸替換甘氨酸。
本發(fā)明涉及所述冬蟲夏草中國被毛孢5’ -核苷酸酶在生物催化嘧啶核苷酸制備嘧啶中的應(yīng)用。
進一步，所述的應(yīng)用為以含冬蟲夏草中國被毛孢5’ -核苷酸酶菌體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)細胞破碎后的破碎混合液為催化劑，以嘧啶核苷酸為底物，于PH為6. 5^8. 5 的緩沖溶液構(gòu)成的轉(zhuǎn)化體系中，在30°C、150rpm條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)3 4h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液過濾，取濾液即為含嘧啶的粗品，所述粗品分離純化獲得嘧啶。
更進一步，所述底物的初始濃度為10g/L，所述催化劑的體積用量為100mL/g底物，所述催化劑的干菌體濃度為6.7mg/mL。
由嘧啶核苷酸合成代謝獲得嘧啶的路徑如下式所示
權(quán)利要求
1.一種冬蟲夏草中國被毛孢5’-核苷酸酶，其特征在于所述酶具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列90%以上同源性。
2.如權(quán)利要求1所述冬蟲夏草中國被毛孢5’-核苷酸酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列為SEQ ID No.1所示。
3.如權(quán)利要求1所述冬蟲夏草中國被毛孢5’-核苷酸酶在生物催化嘧啶核苷酸制備嘧啶中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以含冬蟲夏草中國被毛孢5’ -核苷酸酶菌體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)細胞破碎后的破碎混合液為催化劑，以嘧啶核苷酸為底物，于PH為6. 5^8. 5的緩沖溶液構(gòu)成的轉(zhuǎn)化體系中，在30°C、150rpm條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)3 4h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液過濾，取濾液即為含嘧啶的粗品，所述粗品分離純化獲得嘧啶。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述底物的初始濃度為10g/L，所述催化劑的體積用量為100mL/g底物，所述催化劑的干菌體濃度為6. 7mg/mL。
6.一種編碼權(quán)利要求1所述酶的基因。
7.如權(quán)利要求6所述基因，其特征在于所述基因具有SEQID No. 2所示核苷酸序列90%以上同源性。
8.如權(quán)利要求6所述基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列為SEQID No. 2所示。
9.如權(quán)利要求6 8之一所述基因在構(gòu)建能夠生物催化嘧啶核苷酸制備嘧啶的基因工程菌中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有所述冬蟲夏草中國被毛孢5’ -核苷酸酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離純化獲得含有冬蟲夏草中國被毛孢5’ -核苷酸酶的菌體細胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個來自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲夏草中國被毛孢參與嘧啶核苷酸出發(fā)合成代謝嘧啶的5’-核苷酸酶，編碼基因及其應(yīng)用，所述酶氨基酸序列具有SEQ ID No.1所示序列90%以上同源性，其編碼基因具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列90%以上同源性；本發(fā)明從原理上對嘧啶核苷酸合成嘧啶的代謝途徑進行了詳細研究，包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來通過轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過調(diào)節(jié)嘧啶生物合成基因的表達，賦予宿主嘧啶的高表達性，為擴大嘧啶的產(chǎn)量提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
文檔編號C12R1/19GK103031288SQ20121053698
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者鄭裕國, 柳志強, 吳暉, 李邦良, 吳玲芳, 許靜, 許峰, 薛亞平, 袁水金, 王鴻艷 申請人:浙江工業(yè)大學(xué), 杭州中美華東制藥有限公司