專(zhuān)利名稱(chēng)：冬蟲(chóng)夏草胞嘧啶脫氨酶、編碼基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢的參與胞嘧啶出發(fā)合成代謝尿喃唳以及從胸腺喃唳出發(fā)合成5-甲基胞喃唳的胞喃唳脫氨酶(cytosinedeaminase),編碼這個(gè)酶的基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
冬蟲(chóng)夏草(Cordyceps sinensis (Berk. ) Sacc.)是冬蟲(chóng)夏草菌寄生在鱗翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆蟲(chóng)(Hepialus armoricanus Oberthur)幼蟲(chóng)上的子座及幼蟲(chóng)尸體上的復(fù)合體(包括子座和蟲(chóng)體)。冬蟲(chóng)夏草是一類(lèi)珍惜的傳統(tǒng)真菌藥材資源，具有代謝產(chǎn)物和生物活性多樣的特點(diǎn)，在生物醫(yī)藥領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用和發(fā)展前景。冬蟲(chóng)夏草以其多種藥用功效廣泛、明顯而備受關(guān)注，在世界范圍內(nèi)備受推崇。中醫(yī)認(rèn)為，冬蟲(chóng)夏草入肺腎二經(jīng)，既能補(bǔ)肺陰，又能補(bǔ)腎陽(yáng)，主治腎虛，陽(yáng)痿遺精，腰膝酸痛，病后虛弱，久咳虛弱，勞咳痰血，自汗盜汗等，是唯一的一種能同時(shí)平衡、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的中藥?，F(xiàn)代藥理學(xué)已證實(shí)，冬蟲(chóng)夏草具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗腫瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素樣作用等廣泛的生物活性。冬蟲(chóng)夏草 菌是一種子囊菌，在其生活史中具有分生孢子階段(無(wú)性型)和子囊孢子階段(有性型)。而在人工培養(yǎng)、液體發(fā)酵等實(shí)際生產(chǎn)中使用的是無(wú)性階段的冬蟲(chóng)夏草菌，因而冬蟲(chóng)夏草無(wú)性型的鑒定非常重要。國(guó)內(nèi)外學(xué)者在冬蟲(chóng)夏草資源調(diào)查、無(wú)性型確證、活性成分分離分析和作用機(jī)理、開(kāi)發(fā)應(yīng)用方面做了大量工作。冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢已被證明是冬蟲(chóng)夏草的無(wú)性型存在形式，具有與天然冬蟲(chóng)夏草相同的活性成分和藥效。天然蟲(chóng)草具有嚴(yán)格的寄生性以及特殊的生態(tài)環(huán)境，故其產(chǎn)量很低，價(jià)格高昂。野生冬蟲(chóng)夏草由于受生長(zhǎng)環(huán)境等因素制約，資源匱乏。由于近幾年在人工栽培上進(jìn)展不大，野生冬蟲(chóng)夏草代用品研究多集中在液體發(fā)酵上。利用液體深層發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草菌絲體、提取物或發(fā)酵液，是解決冬蟲(chóng)夏草藥源的一種有效途徑。蟲(chóng)草發(fā)酵生產(chǎn)蟲(chóng)草替代品，既可有效保護(hù)蟲(chóng)草這一珍貴資源，又不受氣候、地理環(huán)境和蟲(chóng)草寄生條件嚴(yán)格的限制，適合于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。生產(chǎn)出的替代品如菌絲體其成分和藥效也與天然蟲(chóng)草相似，因而國(guó)內(nèi)外一直致力于蟲(chóng)草菌絲體的發(fā)酵培養(yǎng)。人工發(fā)酵培養(yǎng)冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢得到的菌絲，經(jīng)毒理、藥理、植化研究，證明與天然蟲(chóng)草化學(xué)組成、藥理作用基本一致，可代替天然蟲(chóng)草生產(chǎn)蟲(chóng)草制品，以彌補(bǔ)自然資源的短缺，通過(guò)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，菌絲體生物量和代謝產(chǎn)物的量均有明顯提聞。近年來(lái)，隨著天然產(chǎn)物化學(xué)和現(xiàn)代色譜技術(shù)的飛速發(fā)展，在對(duì)蟲(chóng)草產(chǎn)品研發(fā)中已逐步由蟲(chóng)草原料或粗提物的直接利用轉(zhuǎn)向更深層次的功能性代謝產(chǎn)物研究。國(guó)內(nèi)外已對(duì)蟲(chóng)草代謝產(chǎn)物做了大量的研究，代謝產(chǎn)物主要包括核苷、多糖、多肽、留醇等幾大類(lèi)化合物，其中嘧啶類(lèi)核苷、蟲(chóng)草多糖、甘露醇等具有代表性的功能性代謝產(chǎn)物在生物合成、藥理作用等方面的研究初見(jiàn)成效。核苷類(lèi)是蟲(chóng)草最主要的活性物質(zhì)之一，其中嘧啶類(lèi)核苷包括胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷。尿喃唳核苷(uracil riboside)又稱(chēng)尿苷(ulidine),別稱(chēng)由雪核糖苷、二氫喃唳核苷、1-β-D-喃核糖基尿喃唳。胞喃唳核苷(cytosine riboside)又名胞苷(cytidine)、胞啶、l-β -D-呋喃核苷胞嘧啶。嘧啶核苷是多用途的核苷，可作為保健品和食品的添加劑。它作為美容和抗紫外輻射化妝品也逐漸成為人們生活的必需品，作為藥物，已臨床應(yīng)用于中樞神經(jīng)、泌尿、代謝和心血管等多方面的疾病，在美國(guó)，核酸類(lèi)藥品近年來(lái)在抗病毒、抗腫瘤方面顯示了不可替代的作用。由于嘧啶核苷及其類(lèi)似物的重要生理作用，國(guó)內(nèi)外有關(guān)微生物生產(chǎn)嘧啶類(lèi)核苷已有很多研究。然而作為重要合成代謝嘧啶類(lèi)核苷的冬蟲(chóng)夏草菌，還只停留在代謝產(chǎn)物成分分析和功效的研究上，對(duì)冬蟲(chóng)夏草菌嘧啶類(lèi)核苷合成代謝途徑中相關(guān)基因和蛋白的研究還很少見(jiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于對(duì)“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢合成代謝尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶的酶及其編碼基因進(jìn)行深入研究，提供了“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與胞嘧啶出發(fā)合成代謝尿嘧啶或胸腺嘧啶出發(fā)合成代謝5-甲基胞嘧啶的酶、編碼基因及其應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是本發(fā)明涉及一種來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與胞嘧啶或胸腺嘧啶出發(fā)合成代謝尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶的胞嘧啶脫氨酶，所述酶具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列90%以上同源性，優(yōu)選其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示(記為pynL蛋白)；該酶可催化胞嘧啶制備尿嘧啶，或催化胸腺嘧啶制備5-甲基胞嘧啶。由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的肽蛋白的片段或其變體，如其保守性變體、生物活性片段或衍生物，只要該肽蛋白的片段或肽蛋白變體與前述氨基酸序列同源性在90%以上，均屬于本發(fā)明保護(hù)范 圍之列。具體的所述改變可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替換；其中，對(duì)于變體的保守性改變，所替換的氨基酸具有與原氨基酸相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)，如用亮氨酸替換異亮氨酸，變體也可具有非保守性改變，如用色氨酸替換甘氨酸。由胞嘧啶或胸腺嘧啶合成代謝獲得尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶的路徑如下所示
權(quán)利要求
1.一種冬蟲(chóng)夏草胞嘧啶脫氨酶，其特征在于所述酶具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列90%以上同源性。
2.如權(quán)利要求1所述冬蟲(chóng)夏草胞嘧啶脫氨酶，其特征在于所述酶的氨基酸序列為SEQID No.1 所示。
3.如權(quán)利要求1所述冬蟲(chóng)夏草胞嘧啶脫氨酶在生物催化胞嘧啶或胸腺嘧啶制備尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為以含冬蟲(chóng)夏草胞嘧啶脫氨酶菌體發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體經(jīng)細(xì)胞破碎后的破碎混合液為催化劑，以胞嘧啶或胸腺嘧啶為底物，于PH為6. 5^8. 5的緩沖溶液構(gòu)成的轉(zhuǎn)化體系中，在30°C、150rpm條件下轉(zhuǎn)化反應(yīng)2 3h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液過(guò)濾，取濾液即為含尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶的粗品，所述粗品分離純化獲得尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶。
5.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述底物的初始濃度為10g/L，所述催化劑的體積用量為100mL/g底物，所述催化劑的干菌體濃度為6. 7mg/mL。
6.一種編碼權(quán)利要求1所述酶的基因。
7.如權(quán)利要求6所述基因，其特征在于所述基因具有SEQID No. 2所示核苷酸序列90%以上同源性。
8.如權(quán)利要求6所述基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列為SEQID No. 2所示。
9.如權(quán)利要求6 8之一所述基因在構(gòu)建能夠生物催化胞嘧啶或胸腺嘧啶制備尿嘧啶或5-甲基胞嘧啶的基因工程菌中的應(yīng)用。
10.如權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng)用為構(gòu)建含有所述冬蟲(chóng)夏草胞嘧啶脫氨酶基因的重組載體，將所述重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，獲得的重組基因工程菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)液分離純化獲得含有冬蟲(chóng)夏草胞嘧啶脫氨酶的菌體細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一個(gè)來(lái)自“百令”生產(chǎn)菌冬蟲(chóng)夏草中國(guó)被毛孢參與胞嘧啶出發(fā)合成代謝尿嘧啶或胸腺嘧啶出發(fā)合成代謝5-甲基胞嘧啶的酶，編碼這個(gè)酶的基因及其應(yīng)用，所述酶即為胞嘧啶脫氨酶，具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列90%以上同源性，其編碼基因具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列90%以上同源性；本發(fā)明從原理上對(duì)胞嘧啶合成尿嘧啶和胸腺嘧啶合成5-甲基胞嘧啶的代謝途徑進(jìn)行了詳細(xì)研究，包含本發(fā)明所提供的核苷酸序列的克隆DNA可以用來(lái)通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)化、結(jié)合轉(zhuǎn)移的方法轉(zhuǎn)入工程菌中，通過(guò)調(diào)節(jié)尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶生物合成基因的表達(dá)，賦予宿主尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶的高表達(dá)性，為擴(kuò)大尿嘧啶和5-甲基胞嘧啶的產(chǎn)量提供了有效途徑，具有重大應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P17/12GK103045573SQ20121053693
公開(kāi)日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者鄭裕國(guó), 柳志強(qiáng), 吳暉, 李邦良, 許靜, 吳玲芳, 許峰, 薛亞平, 袁水金, 王鴻艷 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué), 杭州中美華東制藥有限公司