一種腫瘤靶向腺病毒高分子給藥系統(tǒng)及制備方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種給藥系統(tǒng)，尤其涉及一種腫瘤靶向腺病毒高分子給藥系統(tǒng)?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]腺病毒載體介導(dǎo)的基因治療已廣泛應(yīng)用于抗腫瘤的研究當(dāng)中。大量研究表明：抗腫瘤腺病毒能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長抑制和凋亡，引起強(qiáng)烈旁觀者抗腫瘤效應(yīng)，并且能夠抗血管生成和治療轉(zhuǎn)移病灶，還能與其他的治療措施相結(jié)合，放大一定的免疫殺傷效應(yīng)。通過抗腫瘤腺病毒等生物技術(shù)治療腫瘤，已經(jīng)成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。[0003]但是，腺病毒在臨床應(yīng)用中存在以下兩個問題：一、免疫原性高。機(jī)體天然免疫系統(tǒng)在24h清除90%病毒基因組，隨后的特異性免疫的激活還將清除部分腺病毒，不利于病毒載體的重復(fù)給藥，制約了它在臨床上的應(yīng)用。二，腫瘤靶向性差。人體內(nèi)的多種細(xì)胞都表達(dá)腺病毒受體（CAR)，尤其在人體上皮組織中表達(dá)較高，而在腫瘤細(xì)胞中通常下調(diào)CAR表達(dá)水平，造成腺病毒被正常上皮組織截留，在腫瘤組織的分布大大減少。這不僅使感染腫瘤細(xì)胞的病毒量大大減少，減弱了殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，又增加了對機(jī)體的毒副作用。因此，如何降低腺病毒載體的免疫原性，提高其腫瘤靶向性，成為基于腺病毒載體的腫瘤基因治療亟需解決的問題。[0004]當(dāng)前，對于降低腺病毒載體免疫原性的策略主要有以下兩個方面：1.改造腺病毒載體，但經(jīng)過改造的第三代腺病毒載體仍然攜帶很多"危險(xiǎn)信號"引起機(jī)體的免疫應(yīng)答。改造腺病毒載體要真正廣泛地應(yīng)用于臨床仍還有大量的未知因素有待研究和開發(fā)。2.免疫調(diào)控：主要包括：①應(yīng)用免疫抑制劑抑制機(jī)體對載體的反應(yīng)；②使用能阻斷刺激信號或分子的單克隆抗體；③誘導(dǎo)免疫耐受；④抑制抗原提呈。免疫調(diào)控的方法可不同程度的降低抗腺病毒中和抗體和T細(xì)胞活性，但均系抗腺病毒免疫的優(yōu)化方案，未能屏蔽腺病毒免疫原性，因而免疫系統(tǒng)仍然對腺病毒進(jìn)行免疫識別與免疫清除，并造成機(jī)體血管及組織損傷。[0005]目前，增強(qiáng)腺病毒腫瘤靶向性的方法包括：1.腺病毒載體外殼蛋白修飾，提高腺病毒對細(xì)胞的靶向性及感染效率和（或）降低其天然組織嗜性；2.基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控，控制腺病毒在靶細(xì)胞中選擇性復(fù)制與表達(dá)，引起靶組織細(xì)胞溶解從而實(shí)現(xiàn)其靶向殺傷的作用。腺病毒載體衣殼蛋白修飾與基因復(fù)制及表達(dá)調(diào)控均可顯著提高腺病毒的腫瘤靶向性，但無法同時解決其免疫原性的問題。通過基因復(fù)制與表達(dá)調(diào)控構(gòu)建的腺病毒還存在在非靶組織中分布引起潛在的毒性反應(yīng)的問題，因而其相關(guān)工作尚處于研究階段。[0006]對腺病毒載體進(jìn)行高分子修飾，可以降低腺病毒載體的免疫原性、提高載體的靶向性、同時保持較高的轉(zhuǎn)染能力。因此高分子修飾腺病毒，可以最大限度的發(fā)揮腺病毒生物學(xué)功能，同時保證它在臨床應(yīng)用中的安全性。目前，聚乙二醇（PEG)與聚N_(2-羥丙基）甲基丙烯酰胺（PHPM)是應(yīng)用最廣的腺病毒高分子給藥系統(tǒng)，PEG與pHPM能阻斷病毒衣殼蛋白的抗原決定簇，使腺病毒逃避了免疫識別，腺病毒的免疫清除分別下降6倍及10倍；體外實(shí)驗(yàn)表明，PEG修飾后的腺病毒載體能有效阻斷載體與細(xì)胞柯薩奇受體（CAR)結(jié)合，pHPM修飾的腺病毒載體，能有效富集在腫瘤部位，病毒數(shù)目可達(dá)到未修飾載體的40倍。利用高分子修飾腺病毒載體，提高腺病毒載體的性能，必將在基因治療的研究中受到越來越廣泛的應(yīng)用。[0007]在構(gòu)建腺病毒給藥系統(tǒng)方面，pHPM比PEG更具優(yōu)勢。首先，pHPM對腺病毒修飾效率高。每個PHPM平均含14多肽間隔基團(tuán)，也就是具備14個腺病毒纖毛蛋白反應(yīng)的活性酯鍵位點(diǎn)，而每個聚乙二醇分子僅以單鏈與病毒進(jìn)行反應(yīng)，修飾等量病毒二者所需投藥摩爾比約為1:14。在等摩爾藥物的情況下，pHPM對腺病毒的修飾率大大優(yōu)于聚乙二醇；其次，pHPM給藥系統(tǒng)副作用小，靶向性強(qiáng)。二者與腺病毒反應(yīng)后，均可保留其表面纖毛與配體特異性反應(yīng)的能力，但PHPMA在腺病毒未從接合物上解離前，完全喪失了與柯薩奇受體結(jié)合的能力，而被聚乙二醇修飾的腺病毒則仍具有感染能力，腺病毒仍可感染肝臟等器官，這就增加了藥物的副作用，同時也減少了腺病毒靶向蓄積；最后，PHPM具有多個活性酯基，因而在與腺病毒反應(yīng)時，反應(yīng)體系允許pHPM與其它多種生物效應(yīng)分子(如腫瘤相關(guān)表面抗原）同時進(jìn)行接合，從而形成具有多種功能活性的接合物，提高藥物治療效應(yīng)。由于pHPM在腺病毒修飾上的獨(dú)特效應(yīng)，因而被認(rèn)為是目前最佳的腺病毒載體給藥系統(tǒng)，可期為腺病毒進(jìn)入腫瘤細(xì)胞并表達(dá)抗腫瘤基因打下了良好的基礎(chǔ)。目前，高分子修飾腺病毒尚處于基礎(chǔ)研究階段，國外已有PEG修飾腺病毒應(yīng)用于肺癌治療的報(bào)道，但pHPMA修飾腺病毒進(jìn)行抗腫瘤治療尚未見相關(guān)報(bào)道。[0008]作為藥物載體，pHPMA具有以下特征：一、生物相容性，不引起復(fù)雜的生物、物理及化學(xué)反應(yīng)；二、非免疫原性，無免疫排斥；三、無毒性。而以其為載體合成的多聚HPM-抗腫瘤藥物接合物能形成以疏水藥物為核心的單分子微團(tuán)，具有良好的穩(wěn)定性和藥代動力學(xué)性質(zhì)。pHPMA可顯著提高藥物治療效果，原因在于：1.延長藥物血液循環(huán)半衰期：許多小分子化療藥物常通過自由擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，這種靶組織的非特異性有時會引起不必要的副作用，體內(nèi)的蛋白結(jié)合、解毒系統(tǒng)及快速腎清除作用使之很快由體內(nèi)代謝，亦會使療效受到影響。將小分子藥物連接于水溶性高分子聚合物可避免快速腎清除及通過自由擴(kuò)散的簡單細(xì)胞攝取，從而延長了藥物的循環(huán)半衰期；2.對實(shí)體瘤具有傾向性沉積作用，稱為"增強(qiáng)的透過和滯留效應(yīng)（EPR)"。這種現(xiàn)象原于實(shí)體瘤豐富的血管及血管的不連續(xù)性，使高分子聚合物通過血液循環(huán)漏出到達(dá)腫瘤部位；腫瘤血管分泌的舒緩激肽、腫瘤血管滲透因子、腫瘤壞死因子等使高分子聚合物通過血管壁到達(dá)腫瘤部位；腫瘤部位的淋巴循環(huán)較正常組織的透過率低，聚合物通過血液循環(huán)進(jìn)入實(shí)體瘤組織，進(jìn)而進(jìn)入靶腫瘤細(xì)胞。[0009]pHPMA給藥的優(yōu)勢改變了腺病毒在血液給藥方面的不足。Fisher等研究者首先研究了以pHPM為載體的腺病毒給藥系統(tǒng)，經(jīng)過pHPM修飾的腺病毒被大量的pHPM"包裹"了起來，血液中的抗體分子及細(xì)胞給以接觸腺病毒表面蛋白，因而在腺病毒免疫逃避方面取得了顯著效果。Kim等研究發(fā)現(xiàn)pHPM-腺病毒接合物，在正常組織感染量減少，并選擇性沉積于病變部位，腺病毒保持較高的血藥濃度，腺病毒半衰期延長。充分證明了pHPMA作為腺病毒給藥系統(tǒng)具有高效低毒性及靶向性給藥等特點(diǎn)；Robert等將pHPM與腺病毒接合形成P-Ad5后，發(fā)現(xiàn)Ad5完全失去感染紅細(xì)胞的能力，證實(shí)了腺病毒被pHPMA修飾后不能通過纖毛-柯薩奇受體識別方式而感染細(xì)胞；Chung等發(fā)現(xiàn)pHPM與腺病毒接合物在血漿中的清除率很低，而未修飾的腺病毒則發(fā)生明顯的清除，約5/6病毒被血漿中的抗腺病毒抗體中和，充分說明pHPMA可消除機(jī)體免疫系統(tǒng)對腺病毒的免疫識別與免疫攻擊。因而，pHPM可降低腺病毒免疫原性，提高腺病毒血液半衰期及增強(qiáng)腺病毒腫瘤趨向性方面已逐漸為學(xué)界所接受，受到越來越多的關(guān)注。[0010]對PHPM進(jìn)行靶向分子修飾，可進(jìn)一步加強(qiáng)腺病毒給藥的腫瘤靶向性，提高腺病毒抗腫瘤效應(yīng)。靶向分子是指利用靶細(xì)胞與正常細(xì)胞之間分子生物學(xué)上的差異(包括基因、酶、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等不同特性)，選擇性作用于靶向組織而產(chǎn)生特定生物學(xué)效應(yīng)的活性分子。利用靶向分子的活性作用使PHPMA的被動吸收變?yōu)橹鲃舆\(yùn)輸，提高藥物的內(nèi)吞速度，實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放。pHPMA的靶向分子修飾是pHPMA載體給藥系統(tǒng)的一大進(jìn)步，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。Menachery等首先將祀向分子四環(huán)素與pHPMA相結(jié)合，最初動物體內(nèi)試驗(yàn)表明，此復(fù)合物能很好的與體內(nèi)的羥基磷灰石相結(jié)合。靶向活性分子已應(yīng)用于腫瘤的診斷與治療，在白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、乳腺癌及腫瘤血管性疾病的臨床試驗(yàn)中取得了明顯的療效。在一項(xiàng)臨床I期研究中，靶向活性分子修飾的HPM-表柔比星-自體IgG使4名患者病情得到控制，生命也從7個月延長至18個月；另2名患者在第5周期給藥后血清中的癌胚抗原（CEA)水平分別減少至給藥前的75%和34%。目前，靶向分子已成為pHPMA給藥系統(tǒng)最具研究價值的研究領(lǐng)域之一，已成為臨床診斷與靶向治療的有力工具。[0011]細(xì)胞穿膜肽（cellpenetratingpeptides,CPPs)是具有水溶性、低裂解性的多肽分子，通過非吞噬作用進(jìn)入各種細(xì)胞膜，是目前最強(qiáng)最快的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)分子。國外學(xué)者將CPPs改造為具有腫瘤祀向性的可活化細(xì)胞穿膜肽（active-tablecellpenetratingp印tide,ACPPs)，其結(jié)構(gòu)分為A、B及C三部分，A段序列（R-R-R-R-R-R-R-R)為ACPPs的活性中心（CPPs區(qū)），由聚精氨酸組成的帶正電荷的序列，具有細(xì)胞膜穿透功能。B段序列為腫瘤細(xì)胞外分泌酶（以MMP-2和MMP-9主的基質(zhì)金屬蛋白酶）的識別位點(diǎn)P-L-G-L-A-G，并可被MMP-2和MMP-9特異性酶切斷。C段序列（E-E-E-E-E-E-E-E)為帶負(fù)電荷的谷氨酸，功能為通過中和A段的正電荷來消除A段的細(xì)胞膜穿透活性。其結(jié)構(gòu)圖如下：[0012]【主權(quán)項(xiàng)】1.一種腫瘤靶向腺病毒高分子給藥系統(tǒng)，其特征在于：該給藥系統(tǒng)的實(shí)現(xiàn)方法主要有：（一）增強(qiáng)腫瘤靶向性；采用靶向分子ACPPs與腫瘤過表達(dá)MMPs(主要是MMP2和MMP9)發(fā)生酶一底物反應(yīng)獲得腫瘤靶向性，通過ACPPs修飾pHPMA-腺病毒給藥系統(tǒng)，使pHPM-腺病毒給藥系統(tǒng)獲得腫瘤靶向性；（二）降低腺病毒給藥免疫清除效應(yīng)；將孵育前后的Ad.mda-7.egfp及ACPPs-pc-Ad.mda-7感染A549細(xì)胞48h，獲得免疫清除少，循環(huán)半衰期長，腺病毒的給藥量低的反應(yīng)產(chǎn)物ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp;(三）腺病毒定位于細(xì)胞胞漿，有利于治療基因的表達(dá)；通過ACPPs的介導(dǎo)的穿膜方式實(shí)現(xiàn)大分子藥物跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)效率較高；跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)于20分鐘內(nèi)出現(xiàn)，并隨時間不斷增強(qiáng)；（四)抗腫瘤譜廣；該腫瘤靶向腺病毒高分子給藥系統(tǒng)ACPPs-pc-Ad.mda-7.egfp，采用黑色素瘤分化相關(guān)基因-7(mda-7)，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)多種癌細(xì)胞的生長抑制和凋亡。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種腫瘤靶向腺病毒高分子給藥系統(tǒng)，其特征在于：合成步驟有以下組成：一、pHPMA(pHPMA-ONp)的合成①HPM的合成將甲基丙烯酰氯100ml(LOlmol)加入到含1-氨基-2-丙醇160ml(2.02mol)的乙腈溶液中，室溫?cái)嚢?0min;濾去沉淀；然后將濾液保持當(dāng)前第1頁1 2