一種重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子a的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的制備方法，使用原核表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A，其中，可溶性表達(dá)由重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A與分子伴侶蛋白融合表達(dá)。本發(fā)明還涉及一種編碼分子伴侶蛋白、重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的基因序列的重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化至工程菌后可以得到可溶性表達(dá)的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A融合蛋白。本發(fā)明提供的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的制備方法，在原核表達(dá)系統(tǒng)中可溶性大量表達(dá)出重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，該方法產(chǎn)量高、蛋白收率高、工藝簡(jiǎn)便、便于放大、節(jié)約成本。
【專利說明】—種重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明是利用基因工程技術(shù)制備蛋白的方法，尤其涉及利用基因工程技術(shù)制備重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF,Vascular Endothelial Growth Factor),屬于VEGF-PDGF(Platelet-derived growth factor,血小板衍生生長(zhǎng)因子)超家族，由 VEGF-A、B、C、D、E和胎盤生長(zhǎng)因子(PLGF) 6個(gè)成員組成，具有同源二聚體結(jié)構(gòu)，在單體肽鏈上含有8個(gè)半胱氨酸殘基。其中VEGF-A是誘導(dǎo)腫瘤血管形成作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子。人VEGF-A基因全長(zhǎng)28kb，其位于染色體6P21.3，編碼VEGF的cDNA長(zhǎng)14kb，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成。VEGF-A經(jīng)剪切后有7種不同的單體，根據(jù)氨基酸數(shù)目命名為 VEGF-A121、VEGF-A145, VEGF-A148, VEGF-A165、VEGF-A183、VEGF-A189, VEGF-A206。VEGF-A165(VEGF165)具有最佳的生物利用度和生物潛能，是最重要的同源單體。缺少由外顯子6編碼的殘基，有肝素結(jié)合位點(diǎn)，既可以分泌到細(xì)胞外也可以結(jié)合到細(xì)胞表面或細(xì)胞外基質(zhì)。
[0003] 血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子是目前已知作用最強(qiáng)、專屬性最高的促血管生長(zhǎng)因子。作用強(qiáng)，其作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，強(qiáng)烈刺激細(xì)胞增生，促細(xì)胞分裂，促進(jìn)血管的生長(zhǎng)和側(cè)支循環(huán)的建立，并有升高血管通透性的作用。專屬性高，是唯一對(duì)血管形成具有特異性的重要生長(zhǎng)因子，其他生長(zhǎng)因子如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生性生長(zhǎng)因子等能作用于包括血管內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞，是不具特異性的。
[0004]血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子正常生理作用包括:(1)正常組織內(nèi)促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子同時(shí)存在，且保持相對(duì)平衡，這種平衡使得人體脈管可以正常地生成和分化。(2)人體血管內(nèi)皮細(xì)胞表面分布著一定數(shù)量的VEGF受體，稱為VEGFR。血液中的VEGF與受體結(jié)合，從而激活胞內(nèi)酪氨酸激酶，啟動(dòng)下游細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)，進(jìn)而促使新脈管生長(zhǎng)。在腫瘤生長(zhǎng)中促進(jìn)大量不規(guī)則新血管生成。正常人體內(nèi)促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子數(shù)量相對(duì)平衡，在有腫瘤生長(zhǎng)的情況下，多種致癌因素觸發(fā)致使促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的數(shù)量激增，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的作用，以血管為主的脈管大量生長(zhǎng)，為腫瘤提供了優(yōu)越的生長(zhǎng)環(huán)境。
[0005]基于VEGF在體內(nèi)所表現(xiàn)出的特異性促血管生成作用，通過抑制VEGF的血管生成作用和應(yīng)用VEGF促進(jìn)血管生成治療疾病，正在作為一種新的治療方法被應(yīng)用于臨床。VEGF治療方法包括轉(zhuǎn)基因治療及應(yīng)用VEGF成品。VEGF基因治療稱為〃分子搭橋術(shù)〃，為動(dòng)脈缺血性疾病的治療提供了極其誘人的前景。它通過將含有表達(dá)VEGF的cDNA通過載體直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)VEGF，從而實(shí)現(xiàn)體內(nèi)的治療作用。由于VEGF在體內(nèi)的半衰期較短，而應(yīng)用VEGF的轉(zhuǎn)基因治療可以克服這一不足。眾多研究表明VEGF可以縮小腦梗死體積、減輕腦水腫和減輕神經(jīng)元損傷。外源性VEGF可誘發(fā)正常成體腦的血管生成，有助于增加腦梗死邊緣的腦血流和代謝。[0006]由于天然來源的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子很少，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床應(yīng)用的需求，需要應(yīng)用DNA重組技術(shù)大量生產(chǎn)VEGF蛋白。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞及酵母細(xì)胞表達(dá)VEGF蛋白成本高、產(chǎn)量低、表達(dá)不穩(wěn)定，并且后續(xù)分離純化工藝繁瑣。大腸桿菌由于遺傳背景清楚，代時(shí)短，易控制，成為生產(chǎn)重組蛋白的主要工程菌?？墒抢么竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)得到的VEGF蛋白為不可溶的無活性包涵體，純化復(fù)性困難，步驟復(fù)雜，總回收率低。
[0007]rhVEGF165在中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)、純化及其生物學(xué)活性(張甘良、張海峰等，生物工程學(xué)報(bào)，2011，27 (6):935~942)中公開了將VEGF165克隆于表達(dá)載體P⑶NA4.0，與T-GS載體共同轉(zhuǎn)染CHO-S (中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞)細(xì)胞，表達(dá)VEGF165。該方法使用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)蛋白，生產(chǎn)周期長(zhǎng)、成本高、產(chǎn)量較低，不適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0008]Expression of human vascular endothelial growth factor (VEGF165) inPichia pastoris and its biological activity (Ma L、Wang X N 等，Biomedical andenvironmental sciences, 2001, 14(4):302~311)中公開了將 hVEGF165 cDNA 編碼165氨基酸殘基插入含有AOXl啟動(dòng)子和alpha分泌信號(hào)肽的pIPC9K載體，轉(zhuǎn)入畢赤酵母表達(dá)。酵母表達(dá)體系，發(fā)酵周期長(zhǎng)，成本高，且表達(dá)量遠(yuǎn)低于原核表達(dá)系統(tǒng)。同時(shí)，此方法中表達(dá)系統(tǒng)采用PIPC9K載體，最終獲得的蛋白N端有多余氨基酸殘基，不能獲得天然N端VEGF165。[0009]CN03114994.4、CN201110006597.7、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的表達(dá)及其單克隆抗體的制備(徐靜、李樹香等，中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2008，21 (11):1002~1005)、人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子cDNA克隆和在大腸桿菌的高效表達(dá)(何延政、劉建平等，中國(guó)普外基礎(chǔ)與臨床雜志2001，8(2):72~74)、人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因克隆、表達(dá)與純化(胡志明、馬驪等，中國(guó)生化藥物雜志，2005，26(3):135~138)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在原核細(xì)胞中的高效表達(dá)、純化與活性研究(楊佩、王坤正等，南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2006，26(9):1263~1268)、VEGF165的載體構(gòu)建、表達(dá)及其生物學(xué)活性(陳小波、黃錫全等，江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)；醫(yī)學(xué)版，2007，17(2):12廣123)、雞VEGF基因的克隆及融合蛋白的表達(dá)與分離純化(劉倩、唐亮等，沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，39 (4): 447~450)、High-yield expression of human vascularendothelial growth factor VEGF(165) in Escherichia coli (Pizarro SA 等,ProteinExpression and Purification, 2010, 72 (2): 184~193)均公開了血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的原核表達(dá)及制備，采用以上制備方法所得蛋白為包涵體，純化復(fù)性困難，步驟復(fù)雜，總回收率低。
[0010]VEGF189基因合成、原核表達(dá)及鑒定(陳丹、王宏等，免疫學(xué)雜志，2009, 25(4):469~472)公開的方案中，融合蛋白腸激酶酶切后在N段依然會(huì)殘留Ala氨基酸殘基，不能得到天然N端VEGF189蛋白；且從文章圖5可知，該技術(shù)方案只能實(shí)現(xiàn)融合蛋白很少量的可溶性表達(dá)，大部分融合蛋白依然為包涵體，最終收率不理想。
[0011]血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D基因的原核表達(dá)及純化(耿明偉、張春等，經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào)，2008，12(4):245~248)中利用GST融合基因表達(dá)系統(tǒng)原核表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子D，并進(jìn)行純化。雖然可以實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，但是所用pGEX-6p-l載體不能實(shí)現(xiàn)天然N-端蛋白的表達(dá)，經(jīng)過3C_Protease酶切后，蛋白N端至少會(huì)殘留GlyProLeu等氨基酸殘基。
[0012]利用原核系統(tǒng)表達(dá)人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與真核系統(tǒng)表達(dá)相比，具有代時(shí)短、易控制、成本低、產(chǎn)量高等優(yōu)勢(shì)。然而原核表達(dá)系統(tǒng)也會(huì)受到宿主表達(dá)蛋白時(shí)包涵體變復(fù)性操作繁瑣重現(xiàn)性差、蛋白分離純化收率較低純度不高等因素的制約，因此需要尋找一種可溶性表達(dá)量高、純化收率較高的同時(shí)，蛋白終產(chǎn)物(重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子)、特別是天然N-端蛋白純度較高的基因重組技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0013]如上所述，現(xiàn)有技術(shù)的基因重組制備人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子方法中原核宿主表達(dá)蛋白時(shí)會(huì)以包涵體形式表達(dá)，需要變復(fù)性等繁瑣的操作步驟，重現(xiàn)性差影響產(chǎn)品質(zhì)量；蛋白分離純化收率與純度難以兼得，不能滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需求。
[0014]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過長(zhǎng)期大量試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)使用大腸桿菌二硫鍵形成蛋白A (DsbA)及其突變體DsbAmut、CKS、麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein, MBP)作為分子伴侶蛋白與人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合表達(dá)，可有效解決蛋白以包涵體形式存在的問題。同時(shí)，經(jīng)過Chelating-Sepharose凝膠純化、置換緩沖液、腸激酶酶切去除分子伴侶、Chelating-Sepharose凝膠分離目的蛋白、Heparin Sepharose親和層析進(jìn)一步純化等步驟，重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在滿足純度高、外源DNA殘留低的要求的同時(shí)，收率較高，適合工業(yè)化大生產(chǎn)需求。
[0015]本發(fā)明提供一種重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的制備方法，其特征在于:使用原核表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A，其中，可溶性表達(dá)由重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A與分子伴侶蛋白融合表達(dá)；所述重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A可選自 VEGF-A 經(jīng)剪接后的 7 種不同的變體 VEGF-A121、VEGF-A145, VEGF-A148, VEGF-A165、VEGF-A183、VEGF-A189,VEGF-A206。
[0016]本發(fā)明所述的重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，包括含有信號(hào)肽和不含有信號(hào)肽的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。本發(fā)明的發(fā)明人通過大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的信號(hào)肽不會(huì)影響其可溶性表達(dá)，表達(dá)純化得到的含有或不含有信號(hào)肽的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子均具有生物活性。VEGF-A其他剪接變體亦可應(yīng)用本發(fā)明。
[0017]本發(fā)明提供的制備方法中，所述分子伴侶蛋白可選自DsbA、DsbAmut、CKS、MBP。
[0018]在進(jìn)行融合表達(dá)時(shí)，DsbA可以輔助融合蛋白進(jìn)行正確的空間折疊。因此，利用DsbA蛋白作為融合伴侶表達(dá)真核蛋白是很好的選擇。DsbAmut coli)與DsbA編碼基因序列相比，DsbAmut基因去掉了信號(hào)肽，同時(shí)將DsbA氧化還原功能相關(guān)的兩個(gè)半胱氨酸(cys)突變成絲氨酸(ser)，突變后的DsbA蛋白不再具有氧化還原酶的功能，但仍然具有促目的蛋白可溶和細(xì)胞定位的作用。與DsbAmut融合可實(shí)現(xiàn)許多基因的胞內(nèi)可溶性有活性的高表達(dá)。
[0019]MBP (麥芽糖結(jié)合蛋白)標(biāo)簽蛋白大小為40kDa，由大腸桿菌K12的malE基因編碼。MBP可增加在細(xì)菌中過量表達(dá)的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。
[0020]CKS (CTP:CMP-3-deoxy-D-manno-octulosonate cytidyIyItransferase orCMP-KDO synthetase)是一個(gè)非常穩(wěn)定且高度可溶的理想融合伴侶。利用CKS融合蛋白研制的HIV和HCV重組抗原成功實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)并取得FDA認(rèn)證在美國(guó)上市。
[0021] 本發(fā)明的發(fā)明人在研究初期，為了實(shí)現(xiàn)重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在原核體系的可溶性表達(dá)，選擇了大量的分子伴侶蛋白與重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子進(jìn)行融合表達(dá)。本發(fā)明的發(fā)明人利用基因工程技術(shù)構(gòu)建融合表達(dá)載體。在融合表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)插入目的基因后誘導(dǎo)表達(dá)，將菌體破碎，使用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白存在于破碎液上清還是破碎菌體沉淀，以此來檢驗(yàn)融合蛋白是否可溶及其可溶性優(yōu)劣。對(duì)于可溶性較好的融合蛋白，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了小量表達(dá)純化，對(duì)所得重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子測(cè)活分析，將純化收率、終產(chǎn)物蛋白活性作為優(yōu)化工藝步驟的考量標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的構(gòu)建質(zhì)粒、表達(dá)純化、測(cè)活實(shí)驗(yàn)，最終選擇DsbA、DsbAmut, CKS、MBP作為分子伴侶。
[0022]本發(fā)明提供的使用原核表達(dá)系統(tǒng)高效可溶性表達(dá)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的制備方法，包括以下步驟:
①利用基因工程技術(shù)獲取含有編碼重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因序列，所述基因工程技術(shù)可選自人工合成含有編碼人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因序列、PCR法制備含有編碼人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因序列；
②利用表達(dá)載體，運(yùn)用基因克隆技術(shù)構(gòu)建含有編碼6XHis標(biāo)簽、分子伴侶蛋白、腸激酶酶切位點(diǎn)、重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因序列的重組質(zhì)粒；
③將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌中，獲得表達(dá)含有重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的融合蛋白的工程菌； ④培養(yǎng)并誘導(dǎo)工程菌，可溶性表達(dá)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子融合蛋白；
⑤分離純化得到的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
[0023]本發(fā)明提供的制備方法，所述的表達(dá)載體為原核表達(dá)載體，可選自pET-DsbA表達(dá)載體、PET-DsbAmut表達(dá)載體、ρΕΤ-ΜΒΡ表達(dá)載體、pET-CKS表達(dá)載體。進(jìn)一步地，所述表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)引入了編碼腸激酶酶切位點(diǎn)、重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以直接購(gòu)買得到的或通過簡(jiǎn)單酶切連接改造的含有DsbA、DsbAmut,CKS、MBP分子伴侶的表達(dá)載體均可應(yīng)用于本發(fā)明。
[0024]腸激酶(Enterokinase,EK 酶)是一種高度專一性識(shí)別 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys 序列的蛋白酶，在Lys的C端水解多肽，可以將帶有這個(gè)識(shí)別序列的融合蛋白切開。本發(fā)明的發(fā)明人將其作為工具蛋白酶構(gòu)建于重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的N端融合表達(dá)，在編碼重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子C端的基因序列后設(shè)計(jì)終止密碼子，特異性切開重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子與分子伴侶蛋白即可獲得天然N端序列的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。
[0025]本發(fā)明的發(fā)明人利用商業(yè)可購(gòu)得的載體，或利用基因工程技術(shù)在pET_28a載體的6XHis標(biāo)簽后插入不同的分子伴侶蛋白構(gòu)建融合表達(dá)載體。在融合表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)插入目的基因后誘導(dǎo)表達(dá)，將菌體破碎，使用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白存在于破碎液上清還是菌體沉淀，以此來檢驗(yàn)融合蛋白是否可溶及其可溶性優(yōu)劣。對(duì)于可溶性較好的融合蛋白，本發(fā)明的發(fā)明人進(jìn)行了小量表達(dá)純化，對(duì)所得重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子測(cè)活分析，將純化收率、終產(chǎn)物蛋白活性作為優(yōu)化工藝步驟的考量標(biāo)準(zhǔn)。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過大量的構(gòu)建質(zhì)粒、表達(dá)純化、測(cè)活實(shí)驗(yàn)，最終選擇pET-DsbA表達(dá)載體、PET-DsbAmut表達(dá)載體、ρΕΤ-ΜΒΡ表達(dá)載體、pET-CKS表達(dá)載體。
[0026]本發(fā)明的發(fā)明人通過大量的研究發(fā)現(xiàn)，利用以上幾種分子伴侶蛋白的重組質(zhì)粒，PET-DsbAniut-血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、pET-DsbA-血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、pET_MBP_血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、PET-CKS-血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子在宿主菌中均能較好的實(shí)現(xiàn)可溶性表達(dá)，遺傳穩(wěn)定性良好。菌種連續(xù)多次傳代后分別進(jìn)行發(fā)酵、誘導(dǎo)培養(yǎng)，菌體破菌后，經(jīng)SDS-PAGE分離結(jié)果顯示工程菌各次傳代表達(dá)穩(wěn)定，其融合蛋白含量占全菌蛋白的20%以上，可實(shí)現(xiàn)大量可溶性表達(dá)。同時(shí)，純化后蛋白收率高，蛋白活性較好。
[0027]本發(fā)明提供的制備方法，步驟③所述的宿主菌為大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3 )、大腸桿菌 BL21 (DE3) pLySs。
[0028]本發(fā)明提供的制備方法，步驟⑤所述的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分離純化包括以下步驟:
a.使用緩沖液重懸菌體，破碎，離心，收集可溶性蛋白富集的上清液；
b.Chelating Sepharos凝膠親和層析分離純化融合蛋白；
c.將緩沖液置換為不影響腸激酶正常活性的緩沖體系；
d.腸激酶酶切融合蛋白，得到重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子；
e.Chelating Sepharose親和層析純化目的蛋白；
f.Heparin Sepharose親和層析分離得到的目的蛋白。
[0029]本發(fā)明提供的制備方法中步驟⑤所述的分離純化方法中，步驟a及步驟b所用的緩沖液包含Chelating Sepharos凝膠可承受濃度范圍內(nèi)的Tris_HCl、NaCl及咪唑；其中步驟a中用于重懸菌體的緩沖液包含10mM~30mM Tris-HCl.0.15M~0.25M NaCl、10mM~30mM咪唑，pH為7.5~8.5 ;優(yōu)選地，步驟a中用于重懸菌體的緩沖液(Buffer A)包含20mMTris-HCl、0.2M NaCl、20mM 咪唑，pH 為 8.0。
[0030]大腸桿菌中的表達(dá)的大部分雜蛋白由于沒有6XHis標(biāo)簽不能被ChelatingSepharos吸附，上樣后會(huì)存在于流穿液中。在Chelating Sepharos凝膠柱中使用Tris-HCl、NaCl、咪唑緩沖體系可以較好的分離純化目的蛋白。本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，使用20mM Tris-HCU0.2M NaCl、20mM咪唑，pH為8.0的緩沖液作為上樣緩沖液，可以使目的蛋白極大程度上吸附在凝膠上，而雜蛋白大部分存在于流穿液中，棄掉流穿液后，通過進(jìn)一步加大咪唑濃度可實(shí)現(xiàn)目的蛋白的洗脫。其他可以用于Chelating Sepharos凝膠柱分離目的蛋白的緩沖體系，如Na2EDTA緩沖體系，亦可應(yīng)用于本發(fā)明中。
[0031]本發(fā)明提供的制備方法步驟⑤所述的分離純化方法中，步驟c所用的置換方法可選自透析、超濾、脫鹽柱脫鹽。
[0032]本發(fā)明提供的制備方法中步驟⑤使用腸激酶酶切融合蛋白得到重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。腸激酶適用范圍為PH 4.5-9.5，某些去垢劑和變性劑的存在會(huì)極大的影響腸激酶活性，常見影響腸激酶活性的因素包括尿素>2M、氯化鈉>250mM、巰基乙醇>20mM、SDS>0.1%、咪唑>50mM等。為保證腸激酶酶切效率，需要將Chelating S印haros凝膠柱洗脫的蛋白緩沖液置換為不影響腸激酶正?；钚缘木彌_液，優(yōu)選PH8.0的20mM Tris-HCl作為腸激酶酶切緩沖體系。
[0033]融合蛋白經(jīng)過腸激酶酶切后形成兩個(gè)蛋白/多肽:6 X His標(biāo)簽+分子伴侶蛋白、重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子由于不帶有6XHis標(biāo)簽，因此不能被Chelating Sepharos凝膠吸附,過柱純化時(shí)會(huì)存在流穿液中，而切掉的6 XHis標(biāo)簽+分子伴侶蛋白以及未切開的融合蛋白則被CheIating Sepharos凝膠吸附,從而和目的蛋白重組血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子分離。目的蛋白經(jīng)過Heparin Sepharose親和層析進(jìn)一步純化，純度可達(dá)到90%以上。
[0034] 本發(fā)明還提供一種由制備方法步驟②所得的編碼分子伴侶蛋白、重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的基因序列的重組質(zhì)粒。該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至工程菌后，能實(shí)現(xiàn)分子伴侶蛋白重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A融合蛋白的可溶性表達(dá)，經(jīng)進(jìn)一步分離、酶切、純化后可得到天然重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A。
[0035]本發(fā)明提供的使用原核表達(dá)系統(tǒng)高效可溶性表達(dá)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的制備方法，在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中可溶性大量表達(dá)出重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，該方法產(chǎn)量高、蛋白收率高、工藝簡(jiǎn)便、便于放大、節(jié)約成本。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1 pET-DsbA/DsbA_載體物理圖譜。
[0037]圖2 ρΕΤ-ΜΒΡ載體物理圖譜。
[0038]圖3 pTrc-CKS載體物理圖譜。
[0039]圖4實(shí)施例5中PET-DsbAniut-VEGFieS/ BL21 (DE3)工程菌誘導(dǎo)表達(dá)蛋白可溶性分析。其中，M為蛋白標(biāo)準(zhǔn)；泳道I為pET-DsbA-VEGF165/ BL21 (DE3)未誘導(dǎo)菌體；泳道2為誘導(dǎo)菌體破碎后上清；泳道3為誘導(dǎo)菌體破碎后沉淀。
[0040]圖5實(shí)施例5中VEGF165蛋白各純化步驟電泳圖。其中，泳道I為破菌上清；泳道2為Chelating Sepharose Fast Flow純化樣品泳道3為置換緩沖液后樣品；泳道4為酶切后樣品；泳道5為Chelating Sepharose Fast Flow純化樣品；泳道6為Heparin Sepharose6 Fast Flow純化樣品；泳道7為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照。
[0041]圖6實(shí)施例5中VEGF165蛋白特異性鑒定。其中，泳道I為DsbAmut-VEGF165融合蛋白；泳道2、3為Ek酶切融合蛋白；泳道4為VEGF165蛋白。
[0042]圖7實(shí)施例5中rhVEGF165蛋白活性。
【具體實(shí)施方式】
[0043]以下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的具體說明，不應(yīng)對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
[0044]實(shí)施例1:構(gòu)建pET-CKS載體
人工合成編碼CKS的基因片段(InvitIOgen公司合成)，在編碼CKS的基因片段5’端引入NdeI內(nèi)切酶位點(diǎn)，3’端引入BamHI內(nèi)切酶位點(diǎn)。將合成片段插入pMD18_T Simple載體，得到PMD18-T-CKS載體。pMD18-T-CKS載體和pET_28a載體分別經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切，T4 DNA連接酶連接，常規(guī)轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定和DNA測(cè)序正確后，保存質(zhì)粒為pET-CKS載體質(zhì)粒。
[0045]實(shí)施例2:構(gòu)建ρΕΤ-ΜΒΡ載體
人工合成編碼MBP的基因片段(InvitiOgen公司合成)，在編碼MBP的基因片段上游引ANdeI內(nèi)切酶位點(diǎn)，下游引入BamHI內(nèi)切酶位點(diǎn)。將合成片段插入pMD18_T Simple載體，得到pMD18-T-MBP載體。pMD18_T_MBP載體和pET_28a載體分別經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切，T4 DNA連接酶連接，常規(guī)轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定和DNA測(cè)序正確后，保存質(zhì)粒為ρΕΤ-ΜΒΡ載體質(zhì)粒。
[0046]實(shí)施例3:不同分子伴侶融合蛋白可溶性表達(dá)分析。
[0047]1.構(gòu)建分子伴侶-VEGF融合表達(dá)載體
按照實(shí)施例廣2的方法改造pET-28a表達(dá)載體，構(gòu)建pET_Trx表達(dá)載體、pET-GST表達(dá)載體。pET-DsbA、PET-DsbAmut載體為商業(yè)化載體。人工合成含有腸激酶(Ek酶)切位點(diǎn)的 VEGF121、VEGF165、VEGF189 基因片段(Invitrogen 公司合成)，5’ 端帶有 EcoR I 內(nèi)切酶位點(diǎn)的牛腸激酶(Ek酶)切位點(diǎn)位于VEGF121、VEGF165、VEGF189蛋白N端，編碼VEGF基因片段末尾設(shè)計(jì)終止密碼子。將合成片段插入PMD18-T Simple載體，得到pMD18-T-VEGF121/165/189 載體。pMD18_T_ VEGF121/165/189 載體與所構(gòu)建載體分別經(jīng) EcoR I 和Hind III雙酶切，T4 DNA連接酶連接，常規(guī)轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，雙酶切鑒定和DNA測(cè)序正確后，轉(zhuǎn)入BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，得到工程菌。
[0048]表1分子伴侶-VEGF融合表達(dá)質(zhì)粒
【權(quán)利要求】
1.一種重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的制備方法，其特征在于:使用原核表達(dá)系統(tǒng)可溶性表達(dá)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A，其中，可溶性表達(dá)由重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A與分子伴侶蛋白融合表達(dá)；所述重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A選自VEGF-A經(jīng)剪接后的 7 種不同的變體 VEGF-A121、VEGF-A145, VEGF-A148, VEGF-A165、VEGF-A183、VEGF-A189、VEGF-A206。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述分子伴侶蛋白可選自DsbA、DsbAn1'CKS、MBP。
3.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: ①利用基因工程技術(shù)獲取含有編碼重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因序列，所述基因工程技術(shù)可選自人工合成含有編碼人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因序列、PCR法制備含有編碼人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因序列； ②利用表達(dá)載體，運(yùn)用基因克隆技術(shù)構(gòu)建含有編碼6XHis標(biāo)簽、分子伴侶蛋白、腸激酶酶切位點(diǎn)、重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的基因序列的重組質(zhì)粒； ③將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌中，獲得表達(dá)含有重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的融合蛋白的工程菌； ④培養(yǎng)并誘導(dǎo)工程菌，可溶性表達(dá)重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A融合蛋白； ⑤分離純化得到重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A。
4.如權(quán)利要求3所 述的制備方法，其特征在于，步驟②所述的表達(dá)載體為原核表達(dá)載體，可選自ρΕΤ-DsbA表達(dá)載體、PET-DsbAmut表達(dá)載體、ρΕΤ-ΜΒΡ表達(dá)載體、pET-CKS表達(dá)載體。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)插入了編碼腸激酶酶切位點(diǎn)、重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的基因序列。
6.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟③所述的宿主菌為大腸桿菌，優(yōu)選大腸桿菌 BL21 (DE3)、大腸桿菌 BL21 (DE3)pLySs。
7.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟⑤所述的重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的分離純化包括以下步驟: a.使用緩沖液重懸菌體，破碎，離心，收集可溶性蛋白富集的上清液； b.Chelating Sepharos凝膠親和層析分離純化融合蛋白； c.將緩沖液置換為不影響腸激酶正常活性的緩沖體系； d.腸激酶酶切融合蛋白，得到重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子； e.Chelating Sepharose親和層析純化目的蛋白； f.Heparin Sepharose親和層析分離得到目的蛋白。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟a及步驟b所用的緩沖液包含Chelating Sepharos凝膠可承受濃度范圍內(nèi)的Tris_HCl、NaCl及咪唑；其中步驟a中用于重懸菌體的緩沖液包含10mM~30mM Tris-HCl.0.15M~0.25M NaCl、10mlT30mM咪唑，pH為7.5~8.5 ;優(yōu)選地，步驟a中用于重懸菌體的緩沖液包含20mM Tris-HCl.0.2M NaCl、20mM咪唑，pH 為 8.0。
9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟c所用的置換方法可選自透析、超濾、脫鹽柱脫鹽。
10.一種由權(quán)利要求4步驟②所得的編碼分子伴侶蛋白、重組人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A的基因序列的重 組質(zhì)粒。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK103898146SQ201210589088
【公開日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月31日
【發(fā)明者】周曉雷, 王曉婧, 唐仁陶, 齊磊, 周青青, 陳陽(yáng), 張世光, 張鋒, 蓋文麗, 謝濤, 王莉芳, 竇燕峰 申請(qǐng)人:石藥集團(tuán)中奇制藥技術(shù)（石家莊）有限公司