專利名稱：自動化核酸提取平臺的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬于核酸提取領(lǐng)域，具體為一種通用自動化核酸提取平臺，該平臺具有廣泛的應(yīng)用，可用于醫(yī)療、衛(wèi)生、防疫、科研、技術(shù)監(jiān)督等領(lǐng)域。
技術(shù)背景核酸是分子生物學(xué)研究的基本對象，核酸提取步驟是分子診斷中最為重要、最基本的一個環(huán)節(jié)。從生物樣品中提取DNA或RNA的方法有很多種，例如傳統(tǒng)的有機溶劑提取方法，以及可適合以96孔板模式進行高通量自動化操作的硅膠膜柱吸附法、磁珠分離法和電荷法等。其中，磁珠分離法是目前應(yīng)用最廣、自動化條件最為成熟的一種方法，例如Roche、·Chiron、Abbott、Gen-probe、Biomerieux等公司研發(fā)的分子診斷產(chǎn)品皆為基于磁珠分離法的產(chǎn)品。磁珠是一種新型的功能化固相載體，其表面包被有活性基團，可以與多種生物活性物質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)，兼具有液體的流動性和固體磁性材料等特點，在外磁場的作用下可以定向移動和集中，當撤去外磁場后，稍加振蕩或抽吸又可均勻分散于液體中，從而使固相、液相的分離變得十分快捷方便，通過簡單的洗脫可以得到純度很高的靶向物質(zhì)。磁珠法核酸提取試劑一般由裂解液、磁珠、洗液、洗脫液等組分組成。裂解液是一種蛋白變性劑，可使動植物、微生物的細胞、病毒衣殼裂解，并使與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)變性，核酸游離釋放，磁球可以特異地吸附核酸，通過洗液洗滌，去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，再因洗脫液解離吸附在磁珠上的核酸，得到純度和濃度均很高的核酸，可用于PCR擴增、酶切、分子雜交等。核酸提取的過程以及所提取的核酸的質(zhì)量對分子診斷的結(jié)果影響極大，如不能有效地完成核酸提取方面的工作，就不能進行分子診斷實驗。在臨床診斷實驗室中，核酸提取的過程基本是手工完成，因其工作強度大，常常帶來操作錯誤、交叉污染等問題。隨著分子診斷的快速發(fā)展，在臨床中，搭建一個自動化核酸提取平臺顯得越來越重要。一方面，國內(nèi)生產(chǎn)的自動化核酸提取平臺很少見，相關(guān)的專利文獻更少見。目前可查到的類似專利文獻有“一體化血液核酸篩查平臺”(授權(quán)公告號CN201695047U)。另一方面，市場上的自動化核酸提取平臺主要由國外廠家，例如Tecan、Hamilton、PE、Beckman等提供,大部分面向科研領(lǐng)域，由于其處理樣品能力體積小(低于200 μ I/樣品)、通量低(=48樣品/批次)、與實驗室信息化管理系統(tǒng)(LIMS)無法交互信息等問題，基本沒有獲得臨床用戶的認可，應(yīng)用極少。其它適合臨床分子診斷的自動化設(shè)備有Roche公司的MagNA Pure、Chiron公司的Procleix TIGRIS System等。然而，Roche 的 MagNA Pure 只適用于 Roche 的試劑，而 Chiron的Procleix TIGRIS System只適用于Chiron和Gen-probe的試劑,基本上是不開放平臺。綜上所述，本領(lǐng)域急需一種高通量、通用的自動化核酸提取平臺來解決核酸提取的自動化問題。
發(fā)明內(nèi)容本實用新型是提供一種自動化核酸提取平臺。在該平臺上，可實現(xiàn)磁珠法提取試劑的自動化提取過程，獲得質(zhì)量穩(wěn)定可靠的核酸產(chǎn)物。在本實用新型的自動化核酸提取平臺設(shè)計中，著重考慮了核酸提取平臺的防止氣溶膠形成、防止樣本交叉污染、穩(wěn)定性和自動化等方面的問題。在調(diào)研市場多家在售設(shè)備的基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)(1)液體工作站是一個成熟的平臺，特別是Tecan、Hamilton等公司所提供的液體工作站加樣精確、運行穩(wěn)定、可選配機械手實現(xiàn)標準元件的移動操作，非常適于作為構(gòu)建通用的核酸提取平臺的基礎(chǔ)；(2)半自動核酸提取儀在臨床實驗室中有較為廣泛的應(yīng)用，其臨床使用情況顯示，該類產(chǎn)品性能穩(wěn)定、技術(shù)成熟、價格低廉、體積小巧，可作為獨立工作單元與液體工作站聯(lián)用。但是，在國內(nèi)外尚無將液體工作站和核酸提取儀二者完全結(jié)合，形成一個概念全新的、完全自動化的核酸提取工作站的報道。在一些情況下，盡管已成功地將二者聯(lián)合使用，但是在核酸提取過程中還需實驗人員參與從液體工作站移動工作元件到半自動核酸提取儀的手工操作，不是完全意義上的自動化產(chǎn)品，再者，其設(shè)計中沒有考慮防氣溶膠形成和防污染設(shè)計。相比而言，本實用新型的最大特點在于將液體工作站和半自動核酸提取儀進行整合，將液體工作站的快速準確的加樣功能和半自動核酸提取儀的高效的核酸提取功能有機結(jié)合起來，將兩種設(shè)備整合于一個基座工作區(qū)，通過軟件控制，構(gòu)建出樣本加樣、試劑分裝、核酸提取、PCR反應(yīng)液配制等一系列全自動化操作的核酸提取平臺。該設(shè)計不僅保證了核酸提取的速度，而且還在混勻方式和分離核酸設(shè)計中有效解決了防止氣溶膠形成，極大程度降低了核酸污染問題。另外本實用新型還有其通用性、便利性、信息化等特點。通用性在于本實用新型屬開放平臺，不排斥任何廠家的磁珠法提取試劑，不僅能用于血液篩查，也可用于臨床醫(yī)院分子診斷實驗，還可用于疾病控制中心、科研院所等機構(gòu)；便利性在于本實用新型可處理的樣品量從例如20μ l-2ml均可、批次通量可為例如24-96個樣品、可連續(xù)批次進樣等；信息化在于所有流程控制自帶條形碼掃描識別系統(tǒng)，由計算機軟件控制全部流程，并自動記錄存檔，其結(jié)果可與實驗室信息化管理系統(tǒng)(UMS)交互數(shù)據(jù)，實現(xiàn)實驗室信息統(tǒng)一管理。本實用新型的自動化核酸提取平臺包括基座工作區(qū)域和至少一個用于實現(xiàn)液體操作的液體加樣臂和/或用于實現(xiàn)標準元件的移動操作的機械手。其中所述基座工作區(qū)域被劃分為若干功能區(qū)，所述功能區(qū)包括但不限于樣品區(qū)、耗材區(qū)、試劑區(qū)、中轉(zhuǎn)區(qū)、核酸提取區(qū)和廢棄物區(qū)。具體而言(I)樣品區(qū)用于放置實驗待檢樣品，所述待檢樣品位于樣品區(qū)中的樣品池內(nèi)，所述樣品池包括但不限于采血管、標準24孔板、標準48孔板、標準96孔板等。優(yōu)選地，其中各樣品池各自帶有條形碼，可被自動掃描識別確認。(2)耗材區(qū)用于放置實驗所需的耗材，所述耗材包括但不限于吸頭載架、深孔板和PCR板；吸頭載架供放置專用吸頭，深孔板用于核酸提取，PCR板用于擴增反應(yīng)液的配制；優(yōu)選地，各耗材各自帶有條形碼，可被自動掃描識別確認。(3)試劑區(qū)用于放置實驗所需的試劑，所述試劑位于試劑區(qū)中的試劑載架上；優(yōu)選地，各試劑各自帶有條形碼，可被自動掃描識別。(4)中轉(zhuǎn)區(qū)設(shè)置有載架供放置包括但不限于深孔板、PCR板等元件用于樣品加樣、試劑添加、PCR反應(yīng)液配置等操作；這些元件可通過機械手在中轉(zhuǎn)區(qū)、試劑區(qū)和核酸提取區(qū)等區(qū)域進行轉(zhuǎn)移。(5)核酸提取區(qū)用于放置實現(xiàn)核酸提取所需的核酸提取裝置。該區(qū)為本實用新型的關(guān)鍵區(qū)域，在該區(qū)域放置半自動核酸提取儀為本實用新型的獨特設(shè)計，半自動核酸提取儀采用了磁棒上下攪動的混勻方式。目前本領(lǐng)域的主要廠商所生產(chǎn)的設(shè)備多采用渦旋振蕩混勻(例如，Tecan公司提供的用于個體識別系統(tǒng)的設(shè)備多采用此方式)和反復(fù)吹打混勻(例如，Hamilton提供的用于科研單位的設(shè)備多采用此方式)等混勻方式，這樣的混勻方式容易產(chǎn)生氣溶膠，導(dǎo)致核酸污染，不同廠家的試劑在此類平臺上工作污染幾率較高，約為O. 5%-10%。與上述其他混勻方式相比，所述磁棒上下攪動的混勻方式具有氣溶膠形成幾率低、交叉污染小等優(yōu)點。另外，不同于常規(guī)的吸棄廢液的做法，本實用新型提取區(qū)的半自動核酸提取儀將提取廢棄液靜止放在原耗材中，通過分離轉(zhuǎn)移磁珠的方式實現(xiàn)核酸分離，因此，較之傳統(tǒng)吸棄液體的方式，本實用新型具有氣溶膠形成幾率低、實驗環(huán)境污染小的優(yōu)點。在本實用新型的一個實施方式中，所述核酸提取區(qū)的半自動核酸提取儀可選用但不限于KingFisher Flex磁珠分離純化系統(tǒng)、MagMAXExpress核酸抽提系統(tǒng),優(yōu)選為KingFisherFlex磁珠分離純化系統(tǒng)。(6)廢棄物區(qū)用于放置實驗中所產(chǎn)生的廢棄物，例如固體廢棄物和/或液體廢棄·物；優(yōu)選地，所述廢棄物區(qū)中可包括廢棄吸頭收集桶、廢液槽等。上述功能區(qū)可根據(jù)應(yīng)用情況進行調(diào)整，各工作區(qū)的元件數(shù)量可根據(jù)應(yīng)用情況進行增減。優(yōu)選地所述各功能區(qū)位于所述基座工作區(qū)域的X軸與Y軸組成的平面上，按照附圖所示的順序排列。這樣既將各個工作區(qū)相對獨立分開，避免樣本區(qū)、核酸提取區(qū)、試劑區(qū)等區(qū)域的相互污染，又可最大化節(jié)約工作基座空間。除上述6個功能區(qū)外還可增加其他功能區(qū)域，如封膜區(qū)用于將深孔板和/或PCR板進行封膜處理。在Z軸方向上(即所述基座工作區(qū)域的平面上方)為液體加樣臂和/或機械手，其中所述液體加樣臂上帶有移液裝置(例如加樣器)，可對所述基座工作區(qū)域上的元件進行移液操作，其可在X、Y、Z軸上運動；所述機械手可對所述基座工作區(qū)域上的元件(例如深孔板)進行移動操作，可在X、Y、Z軸上運動。在本實用新型的核酸提取平臺的使用過程中，由軟件控制完成例如下列步驟樣品的自動掃描和計數(shù)、將反應(yīng)池置于中轉(zhuǎn)區(qū)中、將試劑和/或樣品加入反應(yīng)池中、將反應(yīng)池轉(zhuǎn)移到核酸提取區(qū)中進行核酸提取等。本實用新型的核酸提取平臺的核酸提取過程自動化程度高、操作方便，優(yōu)選地，所述核酸提取平臺操作軟件數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，能夠與實驗室信息化管理系統(tǒng)(UMS)交互數(shù)據(jù)，實現(xiàn)實驗室管理標準化。此外，利用本實用新型的核酸提取平臺可處理的樣品可以是任何包含核酸分子的物質(zhì)，包括但不限于痰液、尿液、血清、血漿、組織勻漿物、腦脊液、培養(yǎng)物等。經(jīng)由本實用新型的核酸提取平臺處理后的產(chǎn)品可用于PCR、RT-PCR、TMA, NASBA、3SR、LCR、酶切反應(yīng)、連接反應(yīng)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染等分子實驗。此外，由于本實用新型的核酸提取平臺能夠?qū)崿F(xiàn)實驗的自動化、信息化，降低了檢驗人員的工作強度，極大地減少了檢驗人員的誤操作，并且便于數(shù)據(jù)的統(tǒng)一管理。以下將結(jié)合具體實施方式
和附圖，進一步闡釋本實用新型的核酸提取平臺。本領(lǐng)域人員將會了解，下述內(nèi)容僅僅旨在更好地描述本實用新型的精神、思想，而不會成為對本實用新型的限制。此外，依據(jù)本說明書的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易地了解，本實用新型的許多變化形式均不會超出本實用新型的主旨精神，而落入本實用新型的保護范圍內(nèi)。

圖1 :自動化核酸提取平臺平面示意圖圖中標號I樣品區(qū)2耗材區(qū) 3試劑區(qū)4中轉(zhuǎn)區(qū)5核酸提取區(qū)6廢棄物區(qū)7KingFisher Flex磁珠分離純化系統(tǒng)8試劑儲存低溫模塊①樣品架②吸頭廢棄存放處③液體廢棄存放處④96孔深孔板⑤96孔深孔板及96頭磁頭套管⑥PCR 板⑦試劑槽⑧磁珠存放架⑨1000 μ I 吸頭⑩200 μ I 吸頭具體實施方式
下面通過實例對本發(fā)明做進一步詳細說明實施例1 :選用Tecan FREEDOM EV0_2100/150/200Bace 液體工作站和 KingFisher Flex 磁珠分離純化系統(tǒng)進行組合，設(shè)置樣品區(qū)、耗材區(qū)、試劑區(qū)、中轉(zhuǎn)區(qū)、核酸提取區(qū)、廢棄物區(qū)等6個功能區(qū)。(I)樣品區(qū)用于放置實驗待檢樣品，樣品池為采血管或標準24孔板、標準48孔板、標準96孔板等。各樣品池各自帶有條形碼，可被自動掃描識別確認。(2)耗材區(qū)用于放置實驗所需的耗材，所述耗材包括吸頭載架、深孔板和PCR板；吸頭載架供放置專用吸頭，96深孔板用于核酸提取、PCR板用于擴增反應(yīng)液的配制；各耗材各自帶有條形碼，可被自動掃描識別確認。(3)試劑區(qū)用于放置實驗所需的試劑，如磁珠法核酸提取試劑、PCR反應(yīng)液等，所述試劑位于試劑區(qū)中的試劑載架上；各試劑各自帶有條形碼，可被自動掃描識別。(4)中轉(zhuǎn)區(qū)設(shè)置有載架供放置包括深孔板、PCR板等元件用于樣品加樣、試劑添加、PCR反應(yīng)液配置等操作；這些元件可通過機械手在中轉(zhuǎn)區(qū)、試劑區(qū)和核酸提取區(qū)等區(qū)域進行轉(zhuǎn)移。(5)核酸提取區(qū)設(shè)置KingFisher Flex磁珠分離純化系統(tǒng)進行核酸提取。[0051](6)廢棄物區(qū)中可包括廢棄吸頭收集桶、廢液槽。技術(shù)流程用戶將樣品放入樣品區(qū)的支架上，樣品區(qū)一次可容納1飛76份樣品(16位X 36條=576份)。用戶在軟件操作界面點擊“掃描”按鈕，Tecan掃描元件開始對樣品條碼進行掃描，掃描完成后軟件界面出現(xiàn)和樣品排放相對應(yīng)的示意圖，用戶可以點擊示意圖查看樣品條碼信息、對樣品進行分組、選擇樣品混合方式(單檢取樣量位960μ 1、6混取樣量位160μ1、8混取樣量位120 μ I)、選取檢測項目等操作。在程序設(shè)置界面選取操作程序，操作程序可選擇“混樣+提取+PCR配液+試劑模板分裝”，也可根據(jù)用戶需要減少中間某個操作 ，由手工代替，增加了實驗的靈活性，程序可設(shè)置I飛輪，可實現(xiàn)576的I飛倍的樣品數(shù)量。選取完畢軟件根據(jù)之前的用戶設(shè)置計算出本次試驗掃需要的試劑、耗材量并提示用戶在相應(yīng)位置加載試劑耗材在耗材區(qū)的吸頭載架上放置吸頭、在中轉(zhuǎn)區(qū)設(shè)置有載架供放置包括深孔板、PCR板等元件。在試劑區(qū)放置實驗所需的LH buffer、washbuffer、W/Ebuffer、磁珠、PCR反應(yīng)液等。試劑耗材加載完畢用戶可手動確認或通過儀器掃描確認。點擊運行后，儀器開始進行樣本混合操作，在樣品區(qū)吸取一定量的樣品(根據(jù)混樣方式的不同取樣體積不同)加入到中轉(zhuǎn)區(qū)的96孔深孔板中，樣本混合操作根據(jù)用戶的設(shè)置方式在(Tl. 5小時能完成。樣品混合完畢，加樣器從試劑區(qū)吸取960 μ I的LH buffer>500 μ I的Washbuffer、180 μ I W/Ebuffer、180 μ I磁珠、分別加入到中轉(zhuǎn)區(qū)的5塊96孔深孔板中。機械臂夾取中轉(zhuǎn)區(qū)已經(jīng)加有樣本和提取試劑的5塊96孔深孔板和帶有磁頭套管的I塊96孔板移動到核酸提取區(qū)設(shè)置的KingFisher Flex磁珠分離純化系統(tǒng)的I飛位進行核酸提取，提取在2小時內(nèi)完成。提取過程涉及在第1、2塊96孔板中進行加熱裂解、冷卻、磁珠吸附核酸等反應(yīng)，吸附有核酸的磁珠經(jīng)過第3塊板中的Washbuffer、第4塊W/E buffer的清洗去掉蛋白、鹽類等，在第5塊96孔板的W/E buffer中洗脫，釋放核酸，這樣核酸就被提取純化出來。在核酸提取的同時，通機械手夾取PCR反應(yīng)試劑和PCR板移動到中轉(zhuǎn)區(qū)，加樣器在中轉(zhuǎn)區(qū)配制PCR反應(yīng)液并分裝于PCR板中。待核酸提取區(qū)操作完畢，機械手夾取裝有核酸提取物的第5塊96孔板放置于中轉(zhuǎn)區(qū)，加樣器將核酸分裝到有PCR反應(yīng)液的PCR板中，操作完畢軟件圖示提醒用戶將分裝好的PCR板封膜或加蓋放到PCR儀中進行檢測。同時提示用戶移走儀器臺面上及廢棄物區(qū)的垃圾。PCR儀檢測結(jié)果可導(dǎo)入到儀器的軟件中，軟件自動生成樣品的檢測結(jié)果。實施例2 采用該全自動核酸提取平臺提取中國藥品生物制品檢定研究院的HBV核酸參考品、HIV核酸參考品，在熒光定量PCR儀上進行檢測，檢測項目及檢測結(jié)果如下HBV核酸參考品包括陽性參考品P1-P9，陰性參考品N1-N8，靈敏度參考品LO用陰性血漿稀釋至10IU/ml。HIV-1核酸參考品包括陽性參考品P1-P8，陰性參考品N1-N8，靈敏度參考品用陰性血漿稀釋至50IU/ml。檢測結(jié)果HBV陽性參考品P1-P9，符合率9/9 ;陰性參考品N1-N10符合率10/10。說明該平臺HBV DNA提取的特異性好。[0064]檢測結(jié)果檢測HIV-1陽性參考品P1-P8，陰性參考品N1-N10符合率8/8。說明該平臺HIV-1RNA提取的特異性好。將HBV靈敏度參考品用陰性血漿稀釋至10IU/ml，重復(fù)檢測20次，檢出率≥95%，說明該平臺對HBV DNA的提取靈敏度好。將HIV靈敏度參考品用陰性血漿稀釋至50IU/ml，重復(fù)檢測20次，檢出率≥95%，說明該平臺對HIV-1RNA的提取靈敏度好。通過該實例說明，本平臺對DNA和RNA均有較好的提取效率，且特異性好。比目前可查到的類似專利“一體化血液核酸篩查平臺”(授權(quán)公告號CN201695047U)的提取效率優(yōu)越(類似專利檢出率≥95%時HBV DNA靈敏度為20IU/ml，HIV-1RNA靈敏度為100IU/ml)根據(jù)本實用新型的公開內(nèi)容，本領(lǐng)域的技術(shù)人員無趣大量實驗即可對本實用新型的核酸提取平臺得以成功實施。本實用新型公開的實例僅是對本實用新型進行描述，但并不構(gòu)成對本實用新型的限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員用相類似的代替物(如相似的液體工作站或相似的核酸提取儀)或改造，或用相關(guān)化學(xué)和生物學(xué)制劑替代本實例描述的內(nèi)容進行變動，但不超出本實用新型的精神、范圍和思想，均落入本實用新型要求保護的范圍。
權(quán)利要求1.一種通用的自動化核酸提取平臺，其特征在于，以液體工作站和核酸提取儀進行組合，該核酸提取平臺的基座工作區(qū)域設(shè)置以下六個功能區(qū) 樣品區(qū)用于放置實驗待檢樣品； 耗材區(qū)用于放置實驗所需的耗材； 試劑區(qū)用于放置實驗所需的試劑； 中轉(zhuǎn)區(qū)設(shè)置有載架，供放置包括但不限于深孔板、PCR板等元件，用于樣品加樣、試劑添加、PCR反應(yīng)液配置等操作； 核酸提取區(qū)用于放置實現(xiàn)核酸提取所需的核酸提取儀； 廢棄物區(qū)用于放置實驗中所產(chǎn)生的廢棄物。
2.權(quán)利要求1所述的自動化核酸提取平臺，其中所述液體工作站是TecanFREEDOMEV0-2100/150/200Bace系列液體工作站或HAMILTON MICROLAB STAR系列移液工作站。
3.權(quán)利要求1或2所述的自動化核酸提取平臺，其中所述核酸提取儀是KingFisherFlex磁珠分離純化系統(tǒng)或MagMAX Express核酸抽提系統(tǒng)磁珠分離純化系統(tǒng)。
4.權(quán)利要求1或2所述的自動化核酸提取平臺，其中基座工作區(qū)域上方有液體加樣臂和機械手，液體加樣臂實現(xiàn)液體添加操作，機械手實現(xiàn)標準原件移動操作。
專利摘要本實用新型屬于核酸提取領(lǐng)域，具體為一種通用自動化核酸提取平臺。該平臺是由兩個功能設(shè)備組成液體工作站和核酸提取儀。液體工作站用于樣品、試劑添加，核酸提取儀用于核酸提取，由軟件控制，實現(xiàn)核酸提取全自動化。設(shè)有6個功能區(qū)樣品區(qū)、耗材區(qū)、試劑區(qū)、中轉(zhuǎn)區(qū)、核酸提取區(qū)、廢棄物區(qū)，其中優(yōu)選的核酸提取區(qū)設(shè)有核酸提取裝置KingFisher Flex。由軟件程序控制完成樣品的掃描、試劑樣品加入中轉(zhuǎn)區(qū)反應(yīng)池、反應(yīng)池轉(zhuǎn)入核酸提取區(qū)進行核酸提取、PCR反應(yīng)液配制、加核酸提取物等操作。本平臺的核酸提取過程自動化程度高、操作方便，大大提高了核酸提取效率。軟件能夠與實驗室信息化管理系統(tǒng)(LIMS)交互數(shù)據(jù)，實現(xiàn)實驗室管理標準化。
文檔編號C12M1/00GK202830011SQ2012204343
公開日2013年3月27日 申請日期2012年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月29日
發(fā)明者鄒天利, 葉祥忠, 李益民 申請人:北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司