轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲及使用該線蟲篩選調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的物質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及制備響應(yīng)于葡萄糖顯示熒光的轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis?elegans(C.elegans))的方法，及使用該轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲篩選候選物質(zhì)和新基因的方法，所述物質(zhì)和新基因能夠調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和代謝性疾病。本發(fā)明制備轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲以通過熒光顯微鏡可容易地觀察葡萄糖的實時變化，因此可快速并準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的物質(zhì)。因此，本發(fā)明預(yù)期對各種關(guān)于代謝的疑難雜癥諸如肥胖、糖尿病等的研究做出較大貢獻(xiàn)。
【專利說明】轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲及使用該線蟲篩選調(diào)節(jié)葡萄糖代謝的物質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及響應(yīng)于葡萄糖顯示突光的轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲(Caenorhabdit i s elegans，縮寫為C.elegans)的制備方法，及使用該秀麗隱桿線蟲篩選候選物質(zhì)和新基因的方法，所述物質(zhì)和新基因能夠調(diào)節(jié)葡萄糖代謝和代謝性疾病。
【背景技術(shù)】
[0002]由于其基因容易調(diào)控及體積較小，秀麗隱桿線蟲可以以相對低的成本在體外立刻大量生長。秀麗隱桿線蟲適合于實驗應(yīng)用，因為其在卵孵化后只需要大約3天經(jīng)過L1、L2、 L3和L4四個階段變成成蟲。秀麗隱桿線蟲結(jié)構(gòu)簡單，不包括生殖細(xì)胞，只有959個細(xì)胞，且為透明的。由于這些原因，很容易通過顯微鏡直接觀察秀麗隱桿線蟲的內(nèi)部。
[0003]此外，從胚胎到成蟲的細(xì)胞系已被完全確定。由基因組計劃已知，秀麗隱桿線蟲的基因組是酵母基因組的3倍，人類基因組的1/3至1/5。秀麗隱桿線蟲基因組40%相似于人類基因組，且具有迄今已知的5000個人類疾病基因的75%的基因。因此，其被廣泛認(rèn)為是研究人類疾病的良好模型系統(tǒng)。
[0004]最近，由于關(guān)于代謝和代謝性疾病的興趣強烈增加，使用秀麗隱桿線蟲遺傳學(xué)的代謝研究進(jìn)展迅速。通過這些研究發(fā)現(xiàn)的許多基因也存在于哺乳動物中。例如，對于哺乳動物的代謝重要的基因的同源基因，諸如胰島素信號傳遞途徑的基因，mTOR信號傳遞途徑的基因，及Tubby、SREBP、PPAR Y、BAR (膽汁酸受體)的基因等，都存在于秀麗隱桿線蟲中， 且已積極研究其在整體代謝中的作用。
[0005]糖是地球上幾乎所有生物(包括人類)能量的重要來源。然而，含糖量很高的食物與肥胖、心臟病，尤其是導(dǎo)致血液中葡萄糖失調(diào)的II型糖尿病密切相關(guān)，因此導(dǎo)致嚴(yán)重的健康問題。
[0006]在韓國，2003年糖尿病的死亡率為每10萬人中25個，相比于1994年的每10萬人中17個，近十年增加了 47%。在美國，糖尿病的社會成本是巨大的，據(jù)估計在1997年約980 億美元。因此，為了減少糖尿病的社會經(jīng)濟(jì)成本，有關(guān)糖尿病的研究非常重要。然而，糖尿病的確切病因很難找到，因為糖尿病是由遺傳和環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用決定的。因此，為了確定糖尿病中起作用的基因的網(wǎng)絡(luò)及尋找能調(diào)控糖代謝的物質(zhì)，使用諸如秀麗隱桿線蟲的簡單動物模型是有效的。然而，迄今為止，還未有使用秀麗隱桿線蟲篩選參與糖代謝及糖尿病的候選基因及候選藥物的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]技術(shù)問題
[0008]本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲的制備方法，該轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)糖的實時變化可使用秀麗隱桿線蟲的特征，如低成本和高效率通過熒光來觀察，以及使用該轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲篩選能夠調(diào)控糖代謝的候選基因和候選藥物的方法。[0009]具體地，本發(fā)明通過證實參與糖代謝和脂代謝的基因被調(diào)控時，轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲發(fā)生熒光變化，確定了轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲作為體內(nèi)糖報告分子的用途。
[0010]技術(shù)方案
[0011]根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了在體內(nèi)響應(yīng)糖顯示熒光的轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲，所述糖包括葡萄糖。
[0012]在本發(fā)明的一實施方式中，轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲具有far-3::GFP DNA，所述 far-3::GFP DNA通過將綠色熒光蛋白(GFP)與糖攝取增加其表達(dá)的基因，即far_3連接而制備，far-3::GFP DNA整合到染色體上。
[0013]根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種制備轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲的方法，所述方法包括通過紫外線輻射將far-3::GFP DNA整合到其染色體上。
[0014]根據(jù)本發(fā)明的還另一方面，提供了一種使用轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲篩選能夠調(diào)控糖代謝的候選基因及候選藥物的方法，所述轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲在體內(nèi)響應(yīng)糖顯示熒光。
[0015]在本發(fā)明的一實施方式中，所述篩選方法包括轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲一攝取糖就使用RNA干擾(RNAi)抑制調(diào)控糖代謝的基因的表達(dá)。
[0016]有益效果
[0017]制備轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲以通過熒光顯微鏡容易地觀察葡萄糖的實時變化，因此可快速并準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)糖代謝調(diào)節(jié)物質(zhì)。此外，由于秀麗隱桿線蟲的特征可以低成本地進(jìn)行高效研究。因此，本發(fā)明預(yù)期對治療各種關(guān)于代謝的疑難雜癥諸如肥胖、糖尿病等的研究做出較大貢獻(xiàn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1為說明在制備轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲過程中DNA整合的示意圖；
[0019]圖2A示出了在含有2%的葡萄糖的培養(yǎng)基中生長的far-3::GFP轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲比對照組顯示出更強的熒光，圖2B示出了熒光的定量結(jié)果；
[0020]圖3A示出了存在葡萄糖的情況下由gp1-lRNAi干擾糖酵解時，由葡萄糖增強的熒光相比于對照組可進(jìn)一步加強，圖3B示出了熒光的定量結(jié)果；
[0021]圖4A示出了存在葡萄糖的情況下由pod-2RNAi或fasn_lRNAi干擾脂肪酸合成時，由葡萄糖增強的熒光相比于對照組可進(jìn)一步加強，圖4B示出了熒光的定量結(jié)果；及
[0022]圖5A示出了存在葡萄糖的情況下由RNAi抑制葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白H17B01.1的預(yù)期表達(dá)時，由葡萄糖增強的熒光相比于對照組減弱，圖5B示出了熒光的定量結(jié)果。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲，其響應(yīng)糖以顯示熒光。
[0024]本文中使用的術(shù)語“秀麗隱桿線蟲(C.elegans)”是學(xué)名“秀麗隱桿線蟲 (Caenorhabditis elegans)”的簡稱,其為以細(xì)菌為食生活于土壤中的線蟲，在遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實驗中廣泛使用。
[0025]本文中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化”是指由外部環(huán)境注入的DNA引起的生物體遺傳特征的改變。
[0026]此外， 本發(fā)明提供了制備轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲的方法，其包括通過紫外輻射將far-3::GFP DNA整合到其染色體上。
[0027]本文中使用的術(shù)語“綠色熒光蛋白(GFP) ”是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的蛋白以顯示強烈的綠色熒光，且廣泛應(yīng)用于檢測基因表達(dá)的各種領(lǐng)域，尤其是，由于其便于觀察。
[0028]本文中使用的術(shù)語“轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲”是糖報告分子熒光秀麗隱桿線蟲，其通過整合far-3::GFP DNA制備，其中將GFP與糖攝取增加其表達(dá)的基因即far_3連接制備 far-3::GFP DNA。
[0029]此外，本發(fā)明提供了使用轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲篩選用于調(diào)控糖代謝的候選基因及藥物的方法，所述轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲在體內(nèi)響應(yīng)糖以顯示熒光。所述篩選方法使用RNAi。
[0030]所述方法包括轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲一攝取糖就使用RNAi抑制秀麗隱桿線蟲的基因表達(dá)。在本發(fā)明的一實施方方式中，當(dāng)脂代謝和糖代謝基因被抑制時，就觀察到綠色熒光強度的重大變化，其示出使用轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲可發(fā)現(xiàn)參與代謝調(diào)節(jié)的新基因(參見圖3 至5)。
[0031]具體地，本發(fā)明人制備了 far-3::GFP轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲以顯示熒光， far-3::GFP通過將GFP與糖攝取增加其表達(dá)的基因，即far_3連接而制備，且然后確定，如圖1所示，當(dāng)在含有2%葡萄糖的培養(yǎng)基中生長時，far-3::GFP轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲相對于對照組顯示出更亮的熒光(參見圖2)。
[0032]隨后，發(fā)明人確定了存在葡萄糖的情況下，由gp1-lRNAi干擾糖酵解時，由葡萄糖增強的熒光相比于對照組可進(jìn)一步加強(參見圖3)。
[0033]此外，發(fā)明人確定了存在葡萄糖的情況下，由pod-2RNAi或fasn_lRNAi干擾脂肪酸合成時，由葡萄糖增強的熒光相比于對照組可進(jìn)一步加強(參見圖4)。
[0034]此外，發(fā)明人確定了存在葡萄糖的情況下，由RNAi抑制糖轉(zhuǎn)運蛋白H17B01.1的預(yù)期表達(dá)時，由葡萄糖增強的熒光相比于對照組減弱(參見圖5)。
[0035]在下文中，為了幫助理解本發(fā)明，將提供優(yōu)選實施例。然而，以下實施例僅提供于更容易地理解本發(fā)明，而不限制本發(fā)明的范圍。`
[0036]實施例
[0037]實施例1.轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲的制備方法-DNA整合
[0038]由于插入到秀麗隱桿線蟲的far-3::GFP DNA是不包含在染色體中的類型，所以 far-3::GFP DNA將不會傳遞到秀麗隱桿線蟲的子代中。對于使用這種轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲的實驗，篩選轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲很困難，并且far-3::GFP的表達(dá)并不統(tǒng)一。
[0039]因此，為了獲得穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲，通過紫外線輻射改變DNA，引入外源 far-3::GFP DNA并整合到染色體中。通過紫外線整合的DNA整合以很低的可能性進(jìn)行，因此通過紫外線輻射獲得大量秀麗隱桿線蟲的成功率可能會增加。
[0040]將從短體突變體(dpy-5)中獲得的基因與far-3::GFP DNA插入到長體中，由此可以在光學(xué)顯微鏡下鑒定秀麗隱桿線蟲的轉(zhuǎn)化。在DNA整合過程中，用與上述相同的方式辨別轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲。在DNA整合之前，作為傳遞far-3::GFP DNA到子代的頻率的測量結(jié)果，可以證實DNA傳遞到大約50%的子代中，并且可以看出紫外線強度測定顯示紫外線強度是300J/m2后，為大約50%的活性。
[0041]為了 DNA整合的實驗成功，紫外線輻射后，需要超過600條轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲， 因此在L4階段對200條轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲施用300J/m2的紫外線輻射。6天后，紫外線處理的秀麗隱桿線蟲的600條秀麗隱桿線蟲(Fl)子代轉(zhuǎn)移到600個平板中以生產(chǎn)下一代。4 天后，600條秀麗隱桿線蟲(F2)生產(chǎn)的秀麗隱桿線蟲子代中的每個板中的兩條轉(zhuǎn)移到1200 個板中去生產(chǎn)子代。大約4天后，檢查這1200個板。因為如果DNA整合成功，那么轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲可以示出100%的轉(zhuǎn)化，尋找含有100%正常體的秀麗隱桿線蟲。通過從含有葡萄糖的培養(yǎng)基中觀察熒光鑒定DNA的整合，從而確認(rèn)100%正常體轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲(參見圖1)。
[0042]實施例2.存在葡萄糖的情況下測定far-3::GFP轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲的熒光
[0043]實施例1中制備的far-3::GFP轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲在含有2%葡萄糖的培養(yǎng)基中生長，且通過以下方法測定熒光。
[0044]具體地，將一滴2%的瓊脂糖滴在載玻片上，并覆蓋另一載玻片以使瓊脂糖糖薄薄地擴(kuò)散其中。瓊脂糖硬化形成平板后移除載玻片，并將一滴濃度為50mM的NaN3滴到瓊脂糖平板上，然后轉(zhuǎn)移大約15條秀麗隱桿線蟲在其上以麻醉。仔細(xì)將蓋玻片覆蓋，而無氣泡，然后使用熒光顯微鏡通過拍攝圖像觀察far_3::GFP的熒光。使用Zeiss Axio Scope Al作為熒光顯微鏡。使用ImageJ軟件對秀麗隱桿線蟲整個身體顯示的熒光定量分析，并通過三組獨立實驗分析超過20條秀麗隱桿線蟲的熒光。
[0045]如圖2所示，可確定其熒光比對照組強，所述對照組即在沒有葡萄糖的培養(yǎng)基中生長的far-3::GFP轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲(*P〈0.05，**P〈0.01，***P〈0.001，雙側(cè)學(xué)生t檢驗)。
[0046]實施例3.使用RNAi尋找糖代謝基因的方法
[0047]本發(fā)明的發(fā)明人使用Julie Ahringer RNAi細(xì)菌文庫去抑制特定基因的表達(dá)，并觀察far-3::GFP的熒光。挑取(streak)從文庫中獲得的細(xì)菌，并轉(zhuǎn)移到LB/氨芐霉素平板，在培養(yǎng)箱中，在37°C下培養(yǎng)12到16小時。選 擇在平板上生長的一個細(xì)菌菌落,轉(zhuǎn)移到液體LB/氨芐霉素培養(yǎng)基中，并在振蕩培養(yǎng)箱中，在37°C下培養(yǎng)12小時。12小時后，生長有細(xì)菌的100 u I的LB/氨芐霉素培養(yǎng)基被分配到包括2%葡萄糖和氨芐霉素的NG培養(yǎng)基中，并且在37°C下培養(yǎng)細(xì)菌12到16小時。為了誘導(dǎo)反應(yīng)，加入濃度為IOOmM的50iU的異丙基-1-硫代-P-D-半乳糖吡喃苷(IPTG)到細(xì)菌中，在室溫下反應(yīng)一天，并且將兩個成體 far-3::GFP轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移到平板中產(chǎn)卵，平板中生長有RNAi細(xì)菌。大約12小時后，移走成體far-3::GFP轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲，三天后，當(dāng)從卵生長成為成體的秀麗隱桿線蟲時，使用熒光顯微鏡，通過熒光測定方法觀察熒光的表達(dá)。
[0048]實施例3-1.gp1-1 RNAi 的使用
[0049]發(fā)明人觀察到，當(dāng)使用gp1-1 RNAi干擾已知與糖酵解有關(guān)的gp1-1基因的表達(dá)時，轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲中的熒光強度改變。
[0050]當(dāng)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞中時，其被己糖激酶轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，然后被6-磷酸葡萄糖異構(gòu)酶(gp1-1)轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸。gp1-1在糖酵解限速步驟中扮演重要角色，并因此能夠通過抑制gp1-1表達(dá)，阻斷糖酵解。
[0051]如圖3所示，可以看出，當(dāng)gp1-1基因的表達(dá)被阻斷時，與對照組相比，由葡萄糖引起的熒光進(jìn)一步增加，也就是說，在葡萄糖的存在下，轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲中g(shù)p1-1的表達(dá)不降低(*P〈0.05，**P〈0.01，_P〈0.001，雙側(cè)學(xué)生 t 檢驗)。
[0052]實施例3_2.pod-2RNAi 或 fasn-lRNAi 的使用[0053]本發(fā)明的發(fā)明人觀察到，當(dāng)使用pod_2RNAi或fasn_lRNAi干擾已知與脂肪酸合成相關(guān)的乙酰輔酶A羧化酶(pod-2)或脂肪酸合酶(fasn-1)的表達(dá)時，在轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲中熒光強度改變。
[0054]pod-2是位于脂肪酸合成中最高階段的酶，用于將乙酰輔酶A轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶 A。fasn-1參與pod-2的下一個步驟中使用乙酰輔酶A與丙二酰輔酶A的脂肪酸的合成。 pod-2和fasn-1是調(diào)控脂肪酸合成初始步驟的主要的酶,可以通過干擾pod_2和fasn_l顯著抑制脂肪酸的合成。
[0055]如圖4所示，可以看出，當(dāng)pod-2或fasn-1基因的表達(dá)被干擾時，與對照相比，由葡萄糖引起的熒光強度增加，也就是，在葡萄糖的存在下，轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲中pod-2或 fasn-1基因的表達(dá)沒有增加(*P〈0.05, #P〈0.01，*#P〈0.001，雙尾學(xué)生t檢驗)。
[0056]實施例3-3.H17B01.1RANi 的使用
[0057]本發(fā)明人觀察到，當(dāng)使用H17B01.1RANi時，葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白H17B01.1預(yù)期的表達(dá)被阻斷，轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲中的熒光強度改變。
[0058]H17B01.1預(yù)期是具有與人葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUIl最相似堿基序列的秀麗隱桿線蟲的基因，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運葡萄糖到秀麗隱桿線蟲的細(xì)胞中。
[0059]如圖5所示，可以看出，與對照組相比，當(dāng)阻斷H17B01.1的表達(dá)時，葡萄糖增加的熒光下降，也就是在葡萄糖的存在下，在轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲中阻斷了 H17B01.1的表達(dá) (*P〈0.05，**P〈0.01，_P〈0.001，雙尾學(xué)生 t 檢驗)。
[0060]對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以對上述本發(fā)明的典型實施方式作出各種改進(jìn)，而不脫離本發(fā)明的精神或范圍。因此，本發(fā)明旨在涵蓋所有的在附屬的權(quán)利要求書及其等價物的范圍內(nèi)所包括的所有的這些改進(jìn)。
[0061]工業(yè)實用性
[0062]本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的秀 麗隱桿線蟲，使調(diào)控糖代謝的物質(zhì)能夠被快速并準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)， 此外，據(jù)預(yù)計其將有助于治療與代謝有關(guān)的疑難雜癥，例如肥胖、糖尿病等。
【權(quán)利要求】
1.一種轉(zhuǎn)化的秀I?隱桿線蟲，其在體內(nèi)響應(yīng)糖以顯不突光。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲，其還包含Ar-K/PDNA，在所浪feir-3::GFP DNA中將綠色熒光蛋白與糖攝取增強其表達(dá)的基因/ar-J連接，且所述 far-3::GFP DNA整合到秀麗隱桿線蟲染色體上。
3.一種制備轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲的方法,其包含:通過紫外線輻射將/ar-K/P DNA 整合到其染色體上。
4.一種篩選調(diào)節(jié)糖代謝的候選基因及藥物的方法，其使用在體內(nèi)響應(yīng)糖以顯示熒光的轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲 。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其包含:轉(zhuǎn)化的秀麗隱桿線蟲一攝取糖就使用RNA干擾抑制調(diào)節(jié)糖代謝的基因的表達(dá)。
【文檔編號】C12N5/10GK103561566SQ201280025295
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2012年5月24日 優(yōu)先權(quán)日:2011年5月25日
【發(fā)明者】李昇宰, 李東燁 申請人:浦項工科大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)