運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟：（1）秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)；（2）大腸桿菌OP50的培養(yǎng)；（3）秀麗隱桿線蟲的復(fù)蘇；（4）秀麗隱桿線蟲的傳代；（5）秀麗隱桿線蟲的同步化；（6）使用秀麗隱桿線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進(jìn)行測試。本發(fā)明的有益效果：運(yùn)用模式生物——秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析，通過對比空白對照組的線蟲與暴露線蟲的致死率、生殖率、運(yùn)動(dòng)行為和世代周期之間的差異，從而判斷廢水的綜合毒性的大小。
【專利說明】運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及污水毒性檢測領(lǐng)域，尤其涉及運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著工業(yè)的發(fā)展及城鎮(zhèn)化水平的提高，污水的排放量不斷增加。目前，大部分城市污水和工業(yè)廢水都進(jìn)入污水處理廠集中治理，污水處理廠將污水收集統(tǒng)一處理，處理后的尾水除了一少部分回用外，大部分尾水排入了自然界的水體中。因此污水處理廠排放的尾水對受納水體環(huán)境將是很大的挑戰(zhàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法。
[0004]本發(fā)明采用的技術(shù)方案:運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟:
(1)秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng):使用線蟲培養(yǎng)基NGM培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，以大腸桿菌0P50為食物，在15-25°C環(huán)境下培養(yǎng)；
(2)大腸桿菌0P50的培養(yǎng):使用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度控制在15-25°C；
(3)秀麗隱桿線蟲的復(fù)蘇:取1-4只1.5ml的離心管并分別加入0.5-1.5ml的0P50溶液，將離心管放入離心機(jī)中，設(shè)置r為11000-13000rpm，離心0.5-1.5min，然后取出離心管，用微量移液器吸出750 μ I上清溶液，棄去，剩余的濃縮的0Ρ50用移液器混勻后轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)皿的中央，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使0Ρ50均勻的攤在培養(yǎng)皿中，待菌苔風(fēng)干后，取手術(shù)刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻后，用手術(shù)刀割取培養(yǎng)基放入新的含有0Ρ50的NGM培養(yǎng)基中，然后將含有需要復(fù)蘇的秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為15-25 °C，進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)秀麗隱桿線蟲的傳代:取已鋪有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基，然后將手術(shù)刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻后，割取含有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基放入新的含有E.coli 0P50的培養(yǎng)基中，將新的培養(yǎng)基放入15_25°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(5)秀麗隱桿線蟲的同步化:準(zhǔn)備孕蟲生長板2-4塊，用無菌水沖洗孕蟲生長板，吸取2.5-4.5ml的秀麗隱桿線蟲洗脫液于50ml離心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液與Iml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每l_3min振蕩一次，每次l_3s以將成蟲蟲體腐蝕，取3-5個(gè)1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設(shè)置離心機(jī)的r為2000-4000rpm,離心0.5-1.5min,去上清,然后向離心管中加入0.5-1.5mL的無菌水，輕微振蕩，再設(shè)置離心機(jī)的r為2000-4000rpm，離心0.5-1.5min,棄上清時(shí)留0.08-0.12mL的溶液，并混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基中并不加在E.coli 0P50上，在超凈工作臺(tái)中晾干，將加有蟲卵的培養(yǎng)皿放到15-25°C的生化培養(yǎng)箱中，36-60h后蟲卵發(fā)育成成蟲，可進(jìn)行試驗(yàn)； (6)使用秀麗隱桿線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進(jìn)行測試:取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h的秀麗隱桿線蟲置于待測樣品中暴露12h-48h，通過對秀麗隱桿線蟲的存活率、生殖率、運(yùn)動(dòng)行為和世代周期的對比，對待測樣品進(jìn)行毒性分析。
[0005]步驟(I)中秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為Imm的鉬金絲挑取處于產(chǎn)卵期的雌雄同體的秀麗隱桿線蟲于鋪有0P50的NGM培養(yǎng)基中，不能破壞瓊脂層，在15-25°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；大量傳代為用經(jīng)灼燒滅菌后的手術(shù)刀片切一塊含有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到鋪有0P50的NGM培養(yǎng)基上，秀麗隱桿線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli 0P50菌苔上生長，在15-25°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0006]步驟(6)中對秀麗隱桿線蟲的存活率的研究方法是取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲暴露于尾水樣品中，12-48h后統(tǒng)計(jì)線蟲致死率，具體方法為:吸取尾水樣品160-200 μ I于96孔板中，每種水樣做三個(gè)平行樣，再取含同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱桿線蟲液密度為800-1200條/ml，再將離心管中秀麗隱桿線蟲液搖勻，用微量移液器吸取15-25 μ I液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個(gè)孔中15-25條線蟲，最后用封口膜將96孔板封好，放入15-25 °C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12-48h后取出統(tǒng)計(jì)一次存活率。
[0007]步驟(6)中對秀麗隱桿線蟲的生殖率的研究方法是取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲暴露于尾水樣品中，12-48h后統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲的生殖率，具體方法為:取滅過菌的干凈1.5ml離心管4-8個(gè)，每管中分別加入
0.5-1.5ml尾水樣品，再取含同步化36-60h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置一段時(shí)間待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15-25°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12-48h后將離心管取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入含新鮮0P50的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使其產(chǎn)卵，每12-36h轉(zhuǎn)移一次準(zhǔn)備孕蟲生長板，至秀麗隱桿線蟲停止產(chǎn)卵，每種樣品做4-6個(gè)平行樣，待蟲卵孵化成成蟲后，統(tǒng)計(jì)板中秀麗隱桿線蟲總數(shù)。
[0008]步驟(6)中對秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)行為的的研究方法是取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲暴露于尾水樣品中，12-48h后統(tǒng)計(jì)暴露的秀麗隱桿線蟲Imin內(nèi)頭部擺動(dòng)次數(shù)及20s內(nèi)身體彎曲次數(shù)，具體方法為:取滅過菌的干凈1.5ml離心管4-8個(gè)，每管中分別加入0.5-1.5ml尾水樣品，取含同步化36_60h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15-25°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12_48h后將離心管取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入干凈不含食物的NGM培養(yǎng)基上，恢復(fù)Imin后計(jì)算20s內(nèi)線蟲的身體彎曲次數(shù)，每種尾水樣品做3-6個(gè)平行樣，再取干凈不含食物的NGM板中滴一滴無菌水，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入水中，恢復(fù)Imin后統(tǒng)計(jì)Imin內(nèi)頭部擺動(dòng)次數(shù)，每種尾水樣品做3-6個(gè)平行樣。
[0009]秀麗隱桿線蟲的爬行軌跡為正弦曲線，假設(shè)秀麗隱桿線蟲咽泵的方向?yàn)閥軸，則對應(yīng)在其爬行的X軸上每改變一次爬行方向記為一次身體彎曲；而頭部擺動(dòng)則為秀麗隱桿線蟲頭部擺動(dòng)達(dá)到身體的一半定義為一次頭部擺動(dòng)。
[0010]步驟(6)中對秀麗隱桿線蟲的世代周期的的研究方法是取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲暴露于尾水樣品中，12-48h后統(tǒng)計(jì)暴露的秀麗隱桿線蟲的世代周期時(shí)間，具體方法為:取滅過菌的干凈1.5ml離心管4-8個(gè)，每管中分別加入0.5-1.5ml尾水樣品，取含同步化36-60h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15-250C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12-48h后將秀麗隱桿線蟲取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入含有食物的NGM培養(yǎng)基上，等待線蟲產(chǎn)卵，當(dāng)?shù)谝幻堵旬a(chǎn)出后，記下時(shí)間并挑出秀麗隱桿線蟲，將蟲卵放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)1-3天后，蟲卵孵化生長為成蟲，每隔Ih觀察一次，記錄它產(chǎn)下第一個(gè)卵的時(shí)間，從而算出暴露秀麗隱桿線蟲的世代周期時(shí)間，每種離子濃度處理3-6條秀麗隱桿線蟲。
[0011]本發(fā)明的有益效果:運(yùn)用模式生物——秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析，通過對比空白對照組的線蟲與暴露線蟲的致死率、生殖率、運(yùn)動(dòng)行為和世代周期之間的差異，從而判斷廢水的綜合毒性的大小。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為尾水樣品中秀麗隱桿線蟲的存活率情況的條形圖；
圖2為尾水樣品中秀麗隱桿線蟲的生殖率情況的條形圖；
圖3為尾水樣品中秀麗隱桿線蟲的頭部擺動(dòng)頻率情況的條形圖；
圖4為尾水樣品中秀麗隱桿線蟲的身體彎曲次數(shù)情況的條形圖；
圖5為尾水樣品中秀麗隱桿線蟲的世代周期情況的條形圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟:
(1)秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng):使用線蟲培養(yǎng)基NGM培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，以大腸桿菌0P50為食物，在15°C環(huán)境下培養(yǎng)；
(2)大腸桿菌0P50的培養(yǎng):使用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度控制在15°C；
(3)秀麗隱桿線蟲的復(fù)蘇:取I只1.5ml的離心管并分別加入0.5的0P50溶液，將離心管放入尚心機(jī)中，設(shè)置r為IlOOOrpm,尚心0.5min,然后取出尚心管，用微量移液器吸出750 μ I上清溶液，棄去，剩余的濃縮的0Ρ50用移液器混勻后轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)皿的中央，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使0Ρ50均勻的攤在培養(yǎng)皿中，待菌苔風(fēng)干后，取手術(shù)刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻后，用手術(shù)刀割取培養(yǎng)基放入新的含有0Ρ50的NGM培養(yǎng)基中，然后將含有需要復(fù)蘇的秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為15°C，進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)秀麗隱桿線蟲的傳代:取已鋪有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基，然后將手術(shù)刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻后，割取含有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基放入新的含有E.coli 0P50的培養(yǎng)基中，將新的培養(yǎng)基放入15°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(5)秀麗隱桿線蟲的同步化:準(zhǔn)備孕蟲生長板2塊，用無菌水沖洗孕蟲生長板，吸取2.5ml的秀麗隱桿線蟲洗脫液于50ml離心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液與Iml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每I振蕩一次，每次Is以將成蟲蟲體腐蝕，取3個(gè)1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設(shè)置離心機(jī)的r為2000rpm,離心0.5min,去上清,然后向離心管中加入0.5mL的無菌水,輕微振蕩，再設(shè)置離心機(jī)的r為2000rpm,離心0.5min,棄上清時(shí)留0.08mL的溶液，并混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基中并不加在E.coli 0P50上，在超凈工作臺(tái)中晾干，將加有蟲卵的培養(yǎng)皿放到15°C的生化培養(yǎng)箱中，36h后蟲卵發(fā)育成成蟲，可進(jìn)行試驗(yàn)；
(6)使用秀麗隱桿線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進(jìn)行測試:取樣4個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36h的秀麗隱桿線蟲置于待測樣品中暴露12-48h，通過對秀麗隱桿線蟲的存活率、生殖率、運(yùn)動(dòng)行為和世代周期的對比，對待測樣品進(jìn)行毒性分析。
[0014]步驟(I)中秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為Imm的鉬金絲挑取處于產(chǎn)卵期的雌雄同體的秀麗隱桿線蟲于鋪有0P50的NGM培養(yǎng)基中，不能破壞瓊脂層，在15°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；大量傳代為用經(jīng)灼燒滅菌后的手術(shù)刀片切一塊含有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到鋪有0P50的NGM培養(yǎng)基上，秀麗隱桿線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli 0P50菌苔上生長，在15°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0015]存活率的研究方法:取樣4個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，吸取尾水樣品160 μ I于96孔板中，每種水樣做三個(gè)平行樣，再取含同步化36h后的秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱桿線蟲液密度為800條/ml，再將離心管中秀麗隱桿線蟲液搖勻，用微量移液器吸取15μ I液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個(gè)孔中15條線蟲，最后用封口膜將96孔板封好，放入15°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后取出統(tǒng)計(jì)一次存活率。
[0016]生殖率的研究方法:取樣4個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，取滅過菌的干凈1.5ml離心管4個(gè)，每管中分別加入0.5ml尾水樣品，再取含同步化36h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置一段時(shí)間待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取15μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后將離心管取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入含新鮮0P50的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使其產(chǎn)卵，每12h轉(zhuǎn)移一次準(zhǔn)備孕蟲生長板,至秀麗隱桿線蟲停止產(chǎn)卵，每種樣品做4個(gè)平行樣，待蟲卵孵化成成蟲后，統(tǒng)計(jì)板中秀麗隱桿線蟲總數(shù)。
[0017]運(yùn)動(dòng)行為的的研究方法:取樣4個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，再取滅過菌的干凈1.5ml離心管4個(gè)，每管中分別加入0.5ml尾水樣品，取含同步化36h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取15 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后將離心管取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入干凈不含食物的NGM培養(yǎng)基上，恢復(fù)Imin后計(jì)算20s內(nèi)線蟲的身體彎曲次數(shù)，每種尾水樣品做3個(gè)平行樣，再取干凈不含食物的NGM板中滴一滴無菌水，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入水中，恢復(fù)Imin后統(tǒng)計(jì)Imin內(nèi)頭部擺動(dòng)次數(shù)，每種尾水樣品做3個(gè)平行樣。
[0018]世代周期的的研究方法:取樣4個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，再取滅過菌的干凈1.5ml離心管4個(gè)，每管中分別加入0.5ml尾水樣品，取含同步化36h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取15 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后將秀麗隱桿線蟲取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入含有食物的NGM培養(yǎng)基上，等待線蟲產(chǎn)卵，當(dāng)?shù)谝幻堵旬a(chǎn)出后，記下時(shí)間并挑出秀麗隱桿線蟲，將蟲卵放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)I天后，蟲卵孵化生長為成蟲，每隔Ih觀察一次，記錄它產(chǎn)下第一個(gè)卵的時(shí)間，從而算出暴露秀麗隱桿線蟲的世代周期時(shí)間，每種離子濃度處理3條秀麗隱桿線蟲。
[0019]實(shí)施例2
運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟:
(1)秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng):使用線蟲培養(yǎng)基NGM培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，以大腸桿菌0P50為食物，在20°C環(huán)境下培養(yǎng)；
(2)大腸桿菌0P50的培養(yǎng):使用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度控制在20°C；
(3)秀麗隱桿線蟲的復(fù)蘇:取2只1.5ml的離心管并分別加入Iml的0P50溶液，將離心管放入尚心機(jī)中，設(shè)置r為12000rpm,尚心Imin,然后取出尚心管，用微量移液器吸出750 μ I上清溶液，棄去，剩余的濃縮的0Ρ50用移液器混勻后轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)皿的中央，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使0Ρ50均勻的攤在培養(yǎng)皿中，待菌苔風(fēng)干后，取手術(shù)刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻后，用手術(shù)刀割取培養(yǎng)基放入新的含有0Ρ50的NGM培養(yǎng)基中，然后將含有需要復(fù)蘇的秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為20°C，進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)秀麗隱桿線蟲的傳代:取已鋪有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基，然后將手術(shù)刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻后，割取含有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基放入新的含有E.coli 0P50的培養(yǎng)基中，將新的培養(yǎng)基放入20°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(5)秀麗隱桿線蟲的同步化:準(zhǔn)備孕蟲生長板3塊，用無菌水沖洗孕蟲生長板，吸取
3.5ml的秀麗隱桿線蟲洗脫液于50ml離心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液與Iml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每2min振蕩一次，每次2s以將成蟲蟲體腐蝕，取4個(gè)1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設(shè)置離心機(jī)的r為3000rpm，離心lmin，去上清，然后向離心管中加入ImL的無菌水，輕微振蕩，再設(shè)置離心機(jī)的r為3000rpm,離心lmin,棄上清時(shí)留0.1mL的溶液,并混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli0P50的NGM培養(yǎng)基中并不加在E.coli 0P50上，在超凈工作臺(tái)中晾干，將加有蟲卵的培養(yǎng)皿放到20°C的生化培養(yǎng)箱中，48h后蟲卵發(fā)育成成蟲，可進(jìn)行試驗(yàn)；
(6)使用秀麗隱桿線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進(jìn)行測試:取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化48h的秀麗隱桿線蟲置于待測樣品中暴露12h-48h，通過對秀麗隱桿線蟲的存活率、生殖率、運(yùn)動(dòng)行為和世代周期的對比，對待測樣品進(jìn)行毒性分析。
[0020]步驟(I)中秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為Imm的鉬金絲挑取處于產(chǎn)卵期的雌雄同體的秀麗隱桿線蟲于鋪有0P50的NGM培養(yǎng)基中，不能破壞瓊脂層，在20°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；大量傳代為用經(jīng)灼燒滅菌后的手術(shù)刀片切一塊含有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到鋪有0P50的NGM培養(yǎng)基上，秀麗隱桿線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli 0P50菌苔上生長，在20°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0021]存活率的研究方法:取樣6個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，吸取尾水樣品180 μ I于96孔板中，每種水樣做三個(gè)平行樣，再取含同步化48h后的秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱桿線蟲液密度為1000條/ml，再將離心管中秀麗隱桿線蟲液搖勻，用微量移液器吸取20 μ I液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個(gè)孔中20條線蟲，最后用封口膜將96孔板封好，放入20°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后取出統(tǒng)計(jì)一次存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。
[0022]生殖率的研究方法:取樣6個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，取滅過菌的干凈1.5ml離心管6個(gè)，每管中分別加入Iml尾水樣品，再取含同步化48h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置一段時(shí)間待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取20 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入20°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后將離心管取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入含新鮮0P50的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使其產(chǎn)卵，每24h轉(zhuǎn)移一次準(zhǔn)備孕蟲生長板,至秀麗隱桿線蟲停止產(chǎn)卵，每種樣品做5個(gè)平行樣，待蟲卵孵化成成蟲后，統(tǒng)計(jì)板中秀麗隱桿線蟲總數(shù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。
[0023]運(yùn)動(dòng)行為的的研究方法:取樣6個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，再取滅過菌的干凈1.5ml離心管6個(gè)，每管中分別加入Iml尾水樣品，取含同步化48h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取20μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入20°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后將離心管取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入干凈不含食物的NGM培養(yǎng)基上，恢復(fù)Imin后計(jì)算20s內(nèi)線蟲的身體彎曲次數(shù)，每種尾水樣品做5個(gè)平行樣，再取干凈不含食物的NGM板中滴一滴無菌水，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入水中，恢復(fù)Imin后統(tǒng)計(jì)Imin內(nèi)頭部擺動(dòng)次數(shù)，每種尾水樣品做5個(gè)平行樣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3和圖4所示。
[0024]世代周期的的研究方法:取樣6個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，再取滅過菌的干凈1.5ml離心管6個(gè)，每管中分別加入Iml尾水樣品，取含同步化48h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取20 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入20°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12h后將秀麗隱桿線蟲取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入含有食物的NGM培養(yǎng)基上，等待線蟲產(chǎn)卵，當(dāng)?shù)谝幻堵旬a(chǎn)出后，記下時(shí)間并挑出秀麗隱桿線蟲，將蟲卵放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)2天后，蟲卵孵化生長為成蟲，每隔Ih觀察一次，記錄它產(chǎn)下第一個(gè)卵的時(shí)間，從而算出暴露秀麗隱桿線蟲的世代周期時(shí)間，每種離子濃度處理5條秀麗隱桿線蟲。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。
[0025]實(shí)施例3
運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，該方法包括以下步驟:
(1)秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng):使用線蟲培養(yǎng)基NGM培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，以大腸桿菌0P50為食物，在25 °C環(huán)境下培養(yǎng)；
(2)大腸桿菌0P50的培養(yǎng):使用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度控制在25°C；
(3)秀麗隱桿線蟲的復(fù)蘇:取4只1.5ml的離心管并分別加入1.5ml的0P50溶液，將離心管放入尚心機(jī)中，設(shè)置r為13000rpm,尚心1.5min,然后取出尚心管，用微量移液器吸出750 μ I上清溶液，棄去，剩余的濃縮的0Ρ50用移液器混勻后轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)皿的中央，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使0Ρ50均勻的攤在培養(yǎng)皿中，待菌苔風(fēng)干后，取手術(shù)刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻后，用手術(shù)刀割取培養(yǎng)基放入新的含有ΟΡ50的NGM培養(yǎng)基中，然后將含有需要復(fù)蘇的秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為25°C，進(jìn)行培養(yǎng)；
(4)秀麗隱桿線蟲的傳代:取已鋪有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基，然后將手術(shù)刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻后，割取含有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基放入新的含有E.coli 0P50的培養(yǎng)基中，將新的培養(yǎng)基放入25°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(5)秀麗隱桿線蟲的同步化:準(zhǔn)備孕蟲生長板4塊，用無菌水沖洗孕蟲生長板，吸取
4.5ml的秀麗隱桿線蟲洗脫液于50ml離心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液與Iml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每3min振蕩一次，每次3s以將成蟲蟲體腐蝕，取5個(gè)1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設(shè)置離心機(jī)的r為4000rpm，離心1.5min，去上清，然后向離心管中加入1.5mL的無菌水，輕微振蕩，再設(shè)置離心機(jī)的r為4000rpm,離心1.5min,棄上清時(shí)留0.12mL的溶液,并混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基中并不加在E.coli 0P50上，在超凈工作臺(tái)中晾干，將加有蟲卵的培養(yǎng)皿放到25°C的生化培養(yǎng)箱中，60h后蟲卵發(fā)育成成蟲，可進(jìn)行試驗(yàn)；
(6)使用秀麗隱桿線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進(jìn)行測試:取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化60h的秀麗隱桿線蟲置于待測樣品中暴露12h-48h，通過對秀麗隱桿線蟲的存活率、生殖率、運(yùn)動(dòng)行為和世代周期的對比，對待測樣品進(jìn)行毒性分析。
[0026]步驟(I)中秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為Imm的鉬金絲挑取處于產(chǎn)卵期的雌雄同體的秀麗隱桿線蟲于鋪有0P50的NGM培養(yǎng)基中，不能破壞瓊脂層，在25°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；大量傳代為用經(jīng)灼燒滅菌后的手術(shù)刀片切一塊含有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到鋪有0P50的NGM培養(yǎng)基上，秀麗隱桿線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli 0P50菌苔上生長，在25°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0027]存活率的研究方法:取樣8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，吸取尾水樣品200 μ I于96孔板中，每種水樣做三個(gè)平行樣，再取含同步化60h后的秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱桿線蟲液密度為1200條/ml，再將離心管中秀麗隱桿線蟲液搖勻，用微量移液器吸取25 μ I液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個(gè)孔中25條線蟲，最后用封口膜將96孔板封好，放入25°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后取出統(tǒng)計(jì)一次存活率。
[0028]生殖率的研究方法:取樣8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，取滅過菌的干凈1.5ml離心管8個(gè)，每管中分別加入1.5ml尾水樣品，再取含同步化60h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置一段時(shí)間待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入25°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后將離心管取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入含新鮮0P50的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使其產(chǎn)卵，每36h轉(zhuǎn)移一次準(zhǔn)備孕蟲生長板,至秀麗隱桿線蟲停止產(chǎn)卵，每種樣品做6個(gè)平行樣，待蟲卵孵化成成蟲后，統(tǒng)計(jì)板中秀麗隱桿線蟲總數(shù)。
[0029]運(yùn)動(dòng)行為的的研究方法:取樣8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，取滅過菌的干凈1.5ml離心管8個(gè)，每管中分別加入1.5ml尾水樣品，取含同步化60h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取25μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入25°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后將離心管取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入干凈不含食物的NGM培養(yǎng)基上，恢復(fù)Imin后計(jì)算20s內(nèi)線蟲的身體彎曲次數(shù)，每種尾水樣品做6個(gè)平行樣，再取干凈不含食物的NGM板中滴一滴無菌水，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入水中，恢復(fù)Imin后統(tǒng)計(jì)Imin內(nèi)頭部擺動(dòng)次數(shù)，每種尾水樣品做6個(gè)平行樣。
[0030]世代周期的的研究方法:取樣8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，取滅過菌的干凈
1.5ml離心管8個(gè)，每管中分別加入1.5ml尾水樣品，取含同步化60h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入25°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后將秀麗隱桿線蟲取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入含有食物的NGM培養(yǎng)基上，等待線蟲產(chǎn)卵，當(dāng)?shù)谝幻堵旬a(chǎn)出后，記下時(shí)間并挑出秀麗隱桿線蟲，將蟲卵放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)3天后，蟲卵孵化生長為成蟲，每隔Ih觀察一次，記錄它產(chǎn)下第一個(gè)卵的時(shí)間，從而算出暴露秀麗隱桿線蟲的世代周期時(shí)間，每種離子濃度處理6條秀麗隱桿線蟲。
[0031]上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，某些污水處理廠尾水還存在一定量的有毒物質(zhì)，對秀麗線蟲具有較大的致死毒性。經(jīng)過廢水急性暴露的秀麗線蟲雖在短時(shí)間內(nèi)不足以致死，但線蟲的各項(xiàng)生理指標(biāo)均受到不同程度的損害，其中秀麗線蟲的生殖率急劇減少，頭部擺動(dòng)和身體彎曲等運(yùn)動(dòng)行為指標(biāo)也受到嚴(yán)重?fù)p傷。因此，通過對秀麗線蟲四種生理指標(biāo)結(jié)果的綜合判定，我們可以得出結(jié)論:某些污水處理廠尾水含有一定的綜合毒性，對環(huán)境中的生物的健康存在危害。
[0032]有益效果:運(yùn)用模式生物一秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析，通過對比空白對照組的線蟲與暴露線蟲的致死率、生殖率、運(yùn)動(dòng)行為和世代周期之間的差異，從而判斷廢水的綜合毒性的大小。
【權(quán)利要求】
1.運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，其特 征在于包括以下步驟: (1)秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)； (2)大腸桿菌0P50的培養(yǎng)； (3)秀麗隱桿線蟲的復(fù)蘇； (4)秀麗隱桿線蟲的傳代； (5)秀麗隱桿線蟲的同步化； (6)使用秀麗隱桿線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進(jìn)行測試。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，其特征在于: (1)秀麗隱桿線蟲的 培養(yǎng):使用線蟲培養(yǎng)基NGM培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，以大腸桿菌0P50為食物，在15-25°C環(huán)境下培養(yǎng)； (2)大腸桿菌0P50的培養(yǎng):使用LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，溫度控制在15-25°C； (3)秀麗隱桿線蟲的復(fù)蘇:取1-4只1.5ml的離心管并分別加入0.5-1.5ml的0P50溶液，將離心管放入離心機(jī)中，設(shè)置r為11000-13000rpm，離心0.5-1.5min，然后取出離心管，用微量移液器吸出750 μ I上清溶液，棄去，剩余的濃縮的0Ρ50用移液器混勻后轉(zhuǎn)移到NGM培養(yǎng)皿的中央，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿使ΟΡ50均勻的攤在培養(yǎng)皿中，待菌苔風(fēng)干后，取手術(shù)刀，蘸上75%乙醇，再在酒精燈上灼燒滅菌，冷卻后，用手術(shù)刀割取培養(yǎng)基放入新的含有0Ρ50的NGM培養(yǎng)基中，然后將含有需要復(fù)蘇的秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基放入生化培養(yǎng)箱中，設(shè)定溫度為15-25 °C，進(jìn)行培養(yǎng)； (4)秀麗隱桿線蟲的傳代:取已鋪有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基，然后將手術(shù)刀片放在酒精燈上灼燒滅菌，待冷卻后，割取含有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基放入新的含有E.coli 0P50的培養(yǎng)基中，將新的培養(yǎng)基放入15_25°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (5)秀麗隱桿線蟲的同步化:準(zhǔn)備孕蟲生長板2-4塊，用無菌水沖洗孕蟲生長板，吸取2.5-4.5ml的秀麗隱桿線蟲洗脫液于50ml離心管中，取0.5ml的5M NaOH溶液與Iml漂白液混合配置裂解液，將新鮮配置的裂解液倒入50ml的離心管中，在室溫下每l_3min振蕩一次，每次l_3s以將成蟲蟲體腐蝕，取3-5個(gè)1.5ml離心管，將裂解液均勻加入其中，設(shè)置離心機(jī)的r為2000-4000rpm,離心0.5-1.5min,去上清,然后向離心管中加入0.5-1.5mL的無菌水，輕微振蕩，再設(shè)置離心機(jī)的r為2000-4000rpm，離心0.5-1.5min,棄上清時(shí)留0.08-0.12mL的溶液，并混勻，將蟲卵加到新的鋪有E.coli 0P50的NGM培養(yǎng)基中并不加在E.coli 0P50上，在超凈工作臺(tái)中晾干，將加有蟲卵的培養(yǎng)皿放到15-25°C的生化培養(yǎng)箱中，36-60h后蟲卵發(fā)育成成蟲，可進(jìn)行試驗(yàn)； (6)使用秀麗隱桿線蟲對待測尾水樣品的綜合毒性進(jìn)行測試:取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h的秀麗隱桿線蟲置于待測樣品中暴露12h-48h，通過對秀麗隱桿線蟲的存活率、生殖率、運(yùn)動(dòng)行為和世代周期的對比，對待測樣品進(jìn)行毒性分析。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，其特征在于:步驟(1)中秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)包括少量傳代和大量傳代，所述少量傳代為用直徑為1mm的鉬金絲挑取處于產(chǎn)卵期的雌雄同體的秀麗隱桿線蟲于鋪有0P50的NGM培養(yǎng)基中，不能破壞瓊脂層，在15-25°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；大量傳代為用經(jīng)灼燒滅菌后的手術(shù)刀片切一塊含有秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到鋪有0P50的NGM培養(yǎng)基上，秀麗隱桿線蟲即從食物少的瓊脂邊緣爬向E.coli 0P50菌苔上生長，在15-25°C的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，其特征在于，步驟(6)中對秀麗隱桿線蟲的存活率的研究方法是取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲暴露于尾水樣品中，12-48h后統(tǒng)計(jì)線蟲致死率，具體方法為:吸取尾水樣品160-200 μ 1于96孔板中，每種水樣做三個(gè)平行樣，再取含同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，加無菌水稀釋至秀麗隱桿線蟲液密度為800-1200條/ml，再將離心管中秀麗隱桿線蟲液搖勻，用微量移液器吸取15-25 μ I液體分別加入到96孔板中的尾水樣品中，在顯微鏡下觀察，每個(gè)孔中15-25條線蟲，最后用封口膜將96孔板封好，放入15-25 °C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12-48h后取出統(tǒng)計(jì)一次存活率。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，其特征在于，步驟(6)中對秀麗隱桿線蟲的生殖率的研究方法是取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲暴露于尾水樣品中，12-48h后統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲的生殖率，具體方法為:取滅過菌的干凈1.5ml離心管4-8個(gè)，每管中分別加入0.5-1.5ml尾水樣品，再取含同步化36-60h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置一段時(shí)間待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15_25°C的生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12-48h后將離心管取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入含新鮮0P50的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使其產(chǎn)卵，每12-36h轉(zhuǎn)移一次準(zhǔn)備孕蟲生長板，至秀麗隱桿線蟲停止產(chǎn)卵，每種樣品做4-6個(gè)平行樣，待蟲卵孵化成成蟲后，統(tǒng)計(jì)板中秀麗隱桿線蟲總數(shù)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，其特征在于，步驟(6)中對秀麗隱桿線蟲的運(yùn)動(dòng)行為的的研究方法是取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲暴露于尾水樣品中，12-48h后統(tǒng)計(jì)暴露的秀麗隱桿線蟲Imin內(nèi)頭部擺動(dòng)次數(shù)及20s內(nèi)身體彎曲次數(shù)，具體方法為:取滅過菌的干凈1.5ml離心管4-8個(gè)，每管中分別加入0.5-1.5ml尾水樣品，取含同步化36_60h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15-25°C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12_48h后將離心管取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入干凈不含食物的NGM培養(yǎng)基上，恢復(fù)Imin后計(jì)算20s內(nèi)線蟲的身體彎曲次數(shù)，每種尾水樣品做3-6個(gè)平行樣，再取干凈不含食物的NGM板中滴一滴無菌水，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入水中，恢復(fù)Imin后統(tǒng)計(jì)Imin內(nèi)頭部擺動(dòng)次數(shù)，每種尾水樣品做3-6個(gè)平行樣。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的運(yùn)用秀麗隱桿線蟲對污水處理廠尾水進(jìn)行毒性分析的方法，其特征在于，步驟(6)中對秀麗隱桿線蟲的世代周期的的研究方法是取樣4-8個(gè)典型污水處理廠的尾水樣品，將同步化36-60h后的秀麗隱桿線蟲暴露于尾水樣品中，12-48h后統(tǒng)計(jì)暴露的秀麗隱桿線蟲的世代周期時(shí)間，具體方法為:取滅過菌的干凈1.5ml離心管4-8個(gè)， 每管中分別加入0.5-1.5ml尾水樣品，取含同步化36-60h秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)皿，用無菌水沖洗培養(yǎng)皿，將秀麗隱桿線蟲洗脫液轉(zhuǎn)移至無菌的50ml離心管中，靜置待秀麗隱桿線蟲沉淀后，棄上清至管中剩余2ml液體，將管中秀麗隱桿線蟲搖勻，吸取15-25 μ I液體分別加入到尾水樣品中，放入15-250C生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12-48h后將秀麗隱桿線蟲取出，挑出一條秀麗隱桿線蟲放入含有食物的NGM培養(yǎng)基上，等待線蟲產(chǎn)卵，當(dāng)?shù)谝幻堵旬a(chǎn)出后，記下時(shí)間并挑出秀麗隱桿線蟲，將蟲卵放入生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)1-3天后，蟲卵孵化生長為成蟲，每隔Ih觀察一次，記錄它產(chǎn)下第一個(gè)卵的時(shí)間，從而算出暴露秀麗隱桿線蟲的世代周期時(shí)間，每種離子濃度處理3-6條秀麗隱桿線蟲。
【文檔編號】G01N33/18GK103913555SQ201410150085
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】曹侃, 壯子恒, 李敏, 薛婷, 楊蘊(yùn)敏 申請人:常州紡織服裝職業(yè)技術(shù)學(xué)院