專利名稱：：轟擊轉化秀麗新桿線蟲的方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種將核酸導入線蟲，特別是秀麗新桿線蟲(Caenorhabditisclegans)的方法。目前是通過將核酸(通常是DNA)注射進入其兩性體性腺(即進入Syncitium)，或者注射進入單個的卵母細胞核來制備轉基因秀麗新桿線蟲(C.elegans)。一般注射一個混合物，此混合物包含打算導入的DNA(此后被稱為“待測DNA”)和攜帶有使之能將轉基因后代與非轉基因后代區(qū)分開的選擇性標記的質粒。此選擇性標記可以是一種將導致該轉基因線蟲(例如ro1-6)形狀或運動改變的可視性表型標記，也可以是一種挽救條件性致死基因的標記，此致死基因已被導入經(jīng)注射線蟲的遺傳背景中，或者還可以是一種質粒，它含有來自水母AequoreaVictoria的，編碼綠色熒光蛋白(GFP)的核酸。然后，從被注射線蟲的后代(F1代)篩選出表達此選擇性標記的線蟲。一個被注射的兩性體的F1后代，一般含有平均1-10個表達此選擇性標記的個體。然后對這些個體進行培養(yǎng)，但是，平均只有10％的個體將繼續(xù)傳遞此選擇性標記至它們的后代。通常假定，當此標記DNA被接受進入線蟲基因組，并被傳遞至后代時，打算導入的待測DNA將會被共轉化?，F(xiàn)在的這種轉化方法在實際應用中其有局限性，引導DNA進入線蟲必須一個一個進行操作，并且在顯微鏡下注射syncitia/卵母細胞。此工作既費時間，并需要相當多的專家。對于一名精于此注射技術的人員，通常一天可能注射大約50個兩性體。以可遺傳的方式傳遞被轉化DNA的轉基因線蟲已摻入了一個額外的小染色體，此小染色體是由以不可預見結構連接在一起的標記和待測DNA的混合物組成。這種小染色體在有絲分裂和減數(shù)分裂中不穩(wěn)定，每次細胞分裂可能喪失1％-99％。本發(fā)明的目標是對秀麗新桿線蟲提供一個更有效的轉化系統(tǒng)。理想地是希望通過與秀麗新桿線蟲染色體同源重組，達到對外源性待測DNA的整合。為了達到此目的，有必要發(fā)展一種技術，借助于此技術，可以將DNA同時導入大量的，即幾千個線蟲。最近建立的用于引導DNA進入細胞的方法包括以微小投射粒子轟擊細胞，通常是大約2mm直徑的金或鎢粒子，此粒子已用將被導入的DNA包涂了。本領域的技術人員一般將此技術稱為轟擊轉化法，此技術已被成功地用于傳遞DNA進入植物細胞(Kleim等，自然，327:70-73(1987)，Christon等，植物生理學，87:671-674(1988)；Takenthi等，植物分子生物學，18:835-839(1992))，培養(yǎng)的哺乳動物細胞(Zelenin等，F(xiàn)EBS通訊，244:65-67(1989))，魚受精卵(Zelenin等，F(xiàn)EBS通訊，287:118-120(1991))，以及完整的小鼠組織和器官(Zelenin等，F(xiàn)EBS通訊，280:94-94(1991)；Williams等，美國國家科學院學報88:2726-2730(1991))。盡管此技術對于植物細胞和培養(yǎng)的哺乳動物細胞取得了成功，然而本領域的技術人員已預料，轟擊技術在應用于線蟲時會有困難。但是，本發(fā)明人已成功地將類似的轟擊轉化技術用于引導核酸進入秀麗新桿線蟲(C.elegens)。應用這種技術有可能將核酸同時導入大量的線蟲個體。因此，本發(fā)明的第一方面是提供了一種引導核酸(DNA和/或RNA)進入線蟲的方法，包括以許多微小投射粒子轟擊線蟲。在本發(fā)明的一個實施方案中，是用需要導入線蟲的核酸包涂微小投射粒子。應用粒子轟擊槍達到以高速微小投射粒子轟擊線蟲的目的，轟擊槍是本領域熟知的基于氦氣流一類的轟擊槍，參見例如Johnston，自然，346:pp776；Klein等生物技術等10:pp286-291和Takeuchi等，植物分子生物學，18:pp835-839。此轟擊槍利用氦氣氣流加速DNA包涂的粒子，沖向將被轉化的靶樣品。在此提供的實施例中將描述應用核酸包涂的微小投射粒子轟擊轉化秀麗新桿線蟲(C.elegans)的詳細方案。簡單地說，先將線蟲的小沉淀塊分散在一小塊線蟲培養(yǎng)瓊脂板上。然后將此培養(yǎng)板置于“槍”內，并用核酸包涂的微小投射粒子(例如金粒子)轟擊這些線蟲。在短時間的恢復期之后，將此培養(yǎng)板切成許多小塊，并被置于大的瓊脂板上對線蟲進行培養(yǎng)，用于選擇轉基因線蟲。此轉化步驟僅需幾分鐘，并且技術非常簡單，以致在非常短的時間內可進行多次實驗。在本發(fā)明方法的另一個實施方案中，也可以通過首先將含有此核酸的溶液直接施加于線蟲上，然后以未包涂核酸的‘裸露’微小投射粒子轟擊此線蟲而實現(xiàn)轟擊轉化作用。應用這種技術不必用核酸包涂微小投射粒子。當應用常規(guī)的轟擊技術(即使用被包涂的微小投射粒子)時，是由于包涂的微粒被射入線蟲的性腺細胞而產生轉化的后代。應用另一種方法時，其中是首先用核酸的濃溶液包涂線蟲，然后用‘裸露的’微小投射粒子轟擊此線蟲，微?？赡軤恳鼶NA沿其路徑通過線蟲，因此，微粒沒有必要停留在性腺細胞內。如果微粒在它通過線蟲時僅僅穿過性腺細胞，那末它可能遺留下足夠量牽引攜帶的核酸，導致對性腺細胞的轉化作用。為了便于選擇通過本發(fā)明的方法已成功地導入了DNA的轉化體，優(yōu)選地是應用雙重選擇方案，例如使用顯性表型標記如ro1-6或自激性(autonomous)熒光蛋白(AFP)與一種挽救條件性致死基因的標記相結合，此條件性致死基因已被導入注射線蟲的遺傳背景中。在此使用的名詞“自激性熒光蛋白”包括綠色熒光蛋白(GFP)和藍色熒光蛋白(BFP)以及這種類型的任何其它自激性熒光蛋白。下面提供的實施例是關于攜帶pha-1基因溫度敏感性突變的遺傳背景的秀麗新桿線蟲的轉化，其中編碼野生型pha-1基因的DNA已被導入作為共-選擇性標記。但是，其它的條件性致死突變也可同樣使用，并且應該理解，本發(fā)明將不受為了便于鑒別轉化的線蟲所使用的選擇性標記性質的限制。參照下面的實施例以及附圖，將會更進一步理解本發(fā)明。圖1顯示已用金微粒轟擊的秀麗新桿線蟲的Normarski顯微照片。上面的箭頭指示位于性腺內的金微粒，下面的箭頭指示一個位于幼小兩性體腸內的金微粒。實施例1-轟擊轉化法的基本方案(A)同步線蟲的培養(yǎng)1．在標準的大NGM-培養(yǎng)板上培養(yǎng)秀麗新桿線蟲(pha-1株(e2123ts))至饑餓狀態(tài)，以便促進L1期幼蟲累積。2．切取含有‘L1-島’的瓊脂片，用于接種新的大NGM-培養(yǎng)板。3．取決于特定秀麗新桿線蟲株的需要，在清潔的假無菌環(huán)境中15-20℃將此線蟲培養(yǎng)達到成蟲初期。4．用蒸餾水或卵-緩沖液從培養(yǎng)板中洗出線蟲集中至50ml的Falcon試管中，使之借助于應力形成沉淀。5．使用裝有藍色吸頭的Gilson移液器吸取大約500-800μl等分量線蟲沉淀，一滴一滴地滴加于小NGM-培養(yǎng)板的中心。6．將此培養(yǎng)板置于冰上，并使其液體能滲入遺留在已不均勻線蟲“墊”的背面。用鉑金刮片使此線蟲墊形成直徑大約10mm的圓形，并留在冰上待用。(B)用投射粒子轟擊1．將含有冰冷線蟲的NGM培養(yǎng)板置于轟擊槍真空室內的瞄準臺上，距發(fā)射室開口的距離為120mm。移開NGM培養(yǎng)板上的罩子，然后立即關閉真空室的門。在發(fā)射室內的鋼制柵格內裝入DNA包涂的金微粒懸液(在乙醇內)。此金微粒包涂了待測DNA和標記DNA(含有ro1-6的質粒pRF4和含有野生型pha-1的pBX)的混合物。2．設定預置閥的氦氣壓力為8-10巴(bar)。然后對真空室抽真空，當達到局部真空壓力-50至-100mbar時，加壓氣體被釋放出。3．然后打開真空室的門，并且為了保護無菌狀態(tài)立即更換NGM培養(yǎng)板的罩子。然后將此培養(yǎng)板置于15℃，使線蟲從轟擊程序中恢復。4．將此NGM瓊脂板切成4-8塊，每塊各置于加富新鮮的大NGM培養(yǎng)板上(雙倍胰蛋白胨)。然后在15-20℃溫育此大培養(yǎng)板。(C)選擇轉化體轉化后6-7天之后，篩選出F1線蟲(ⅰ)目視觀察表達ro1-6表型的線蟲以及被分離出的表達ro1-6表型的線蟲，隨后對其穩(wěn)定的轉化進行測定，和/或(ⅱ)通過改變至25℃和繼續(xù)培養(yǎng)3-4天，以便篩選pha-1挽救作用，和/或按照上面的任何一種方法，(ⅲ)然后，用本領域熟知的技術，對在25℃既表達ro1-6表型又顯示pha-1挽救作用的單一轉基因線蟲系，單獨檢測其是否存在待測DNA。實施例2轟擊轉化的詳細方案以流程的形式描述了所使用的方法。所有步驟均在無菌條件下進行。在Wood,W.B(1988)，‘秀麗新桿線蟲’，冷泉港實驗室，紐約中描述了秀麗新桿線蟲的一般方法。(A)線蟲的制備在標準的大NGM-培養(yǎng)板(直徑90mm)上培養(yǎng)目標線蟲株(在此是pha-1(e2123ts))至饑餓狀態(tài)，使培養(yǎng)板上被許多L1幼蟲的小島所覆蓋。根據(jù)“L1-島”的大小，切成5-10mm2的瓊脂片，每10次射擊接種大約8塊新鮮的大NGM培養(yǎng)板。在線蟲達到成蟲期之前不應該饑餓它們?？梢晕菇o線蟲細菌，如大腸桿菌。當大約50％的線蟲含有新卵時，培養(yǎng)板已準備就緒。用蒸餾水從培養(yǎng)板上洗出線蟲，集中于50ml的試管內。借助于重力使線蟲沉淀下來(在室溫下放置約15分鐘)。將大約100μl線蟲沉淀置于小NGM-培養(yǎng)板(35mm)的中央。這些培養(yǎng)板已干燥了幾天，并且在前一天接種了一薄層大腸桿菌(op50株)，直徑大約10mm(在室溫下培養(yǎng))。將這些培養(yǎng)板的背面放在冰上，以便使線蟲停止來回運動，并讓液體向上滲入遺留在不均勻線蟲“墊”的背面。用鉑金刮片，使之形成直徑約10mm，近似均勻的圓形線蟲“墊”。置于冰上待用，不能超過1-2小時。(B)以轟擊微粒轟擊通過對置于射擊距離(見下面)的濾紙射擊而校準轟擊裝置(槍)，并隨之畫出通過靶區(qū)域中心的交叉瞄準標線。應該經(jīng)常重復校準。用于校準和轉化時氦氣壓力預置閥都置于8-10巴。在轟擊槍真空室內的瞄準臺上放置和調整冰冷的線蟲培養(yǎng)小板，使對濾器支架的距離為120mm，在剛要關閉真空室之前移開培養(yǎng)板上的罩子。將在乙醇內的DNA包涂的金微粒懸液裝入射擊室內的鋼制柵格。開始對真空室抽真空，當局部真空達到50-100毫巴值時引發(fā)轟擊槍(脈沖時間大約10ms，壓力波不應該打開該裝置中用于壓力釋放的蓋子)。我們不能確定將對轟擊壓力或局部真空給出顯著最好結果的設定。對單個儀器進行這種系統(tǒng)分析可能是有用的。即使在更強的局部真空下線蟲也能生存，并且以小于8巴的壓力也可能轉化。釋放真空，并立即再封閉線蟲培養(yǎng)板。使線蟲在15℃恢復大約30分鐘。線蟲將被溫暖，并開始再運動。將此瓊脂培養(yǎng)板切成4塊或更多的扇形體，把每塊放在一塊新鮮的90mm加富的NGM培養(yǎng)板(雙倍胰蛋白脂)上。按照轉基因選擇方案，使培養(yǎng)板保留在15-20℃。(C)篩選程序此程序根據(jù)用于轉基因線蟲篩選的實際系統(tǒng)可能有改變。在使用ro1-6(Mello.c.c等(1991)EMBO.J.10:3959-3970)和/或pha-1(Granato.M.等(1994)核酸研究，22:1762-1763)的情況下6-7天(15℃)之后，在F1代中尋找ro1-6線蟲。將ro1線蟲置于單獨的培養(yǎng)板上，隨后測定其穩(wěn)定的轉化作用。穩(wěn)定的轉基因系按照非孟德爾比率產生ro1-6子代。將其余的F1代轉變至25℃，再過3-4天之后測定pha-1挽救。通過F2幼蟲在培養(yǎng)板上的表現(xiàn)可指示挽救基因(Rescue)。3-4天之后再次檢查培養(yǎng)板。如果發(fā)現(xiàn)存活的線蟲，根據(jù)死亡卵和存在線蟲的非孟德爾分離作用，對此F2或F3的10-20條線蟲單獨測定其穩(wěn)定的轉化作用。應該注意的是，pha-1偶爾可通過獲得自發(fā)的次級位點抑制因子而回復(Schnabel,H.等(1991)，遺傳學，129:69-77)。因此，對于pha-1株應該定期地通過將一些線蟲轉變至25℃來檢查其完整性，在此溫度下pha-1只產生死亡的卵?？稍跓晒怙@微鏡下通過觀察來自轉基因兩性體的胚，直接檢查是否存在ceh-13GFP報導構建物。為了測定母體效應胚胎致死基因sud-1非條件性等位基因t1237的挽救作用，使此轉基因系列雜交進入sud-1遺傳背景(vab-9sud-1(t1237)/mncl,lon-2)，并篩選此純合Vab兩性體(vab-9sud-1)子代的生存能力。(D)制備金微粒用于投射轟擊其流程是基于Takench等(1992)，植物分子生物學，18:835-839中的方法，將5mg金粉(Au，粉末，球形，1.5-3μm；Aldrich)置于1.5ml的Eppendorf試管中，先用500μl蒸餾水洗此微粒，攪拌后應顯示為均勻的懸液。讓金微粒沉淀，小心地棄除水層。加入少量蒸餾水和每種質粒DNA20μg。用水調整體積至180μl，并加入20μl3M乙酸鈉溶液。攪拌，用2.5倍體積乙醇沉淀DNA。在-20℃放置30分鐘。在此期間攪拌幾次。借助于重力使金微粒沉淀并吸出上清液。不需離心。再將此微粒懸浮于200μl冰冷的無水乙醇中。攪拌，現(xiàn)在可將微粒貯存于-20℃。為用于轉化作用，在Swinny-濾器支架(微孔)的濾紙中裝入20μl(每次射擊大約2-6μgDNA)用于轟擊的這種懸液。立即安裝并射擊。制備金微粒的另一種方法如下將20ng質粒DNA加到10mg金粉(Au，粉末，球形，φ1.5-3μm,Aldrich)中。加蒸餾水至總體積200μl，然后加入20μl3M乙酸鈉和550μl乙醇，置于-20℃至少3小時，同時每30分鐘劇烈攪拌一次以便沉淀DNA。3小時之后讓金微粒沉淀，吸出上清液，將此金微粒再溶于200μl冰冷的乙醇中。每次實驗用20μl這種溶液。(E)制備玻璃微粒用于投射轟擊作為對金微粒的另一種選擇，還可以用玻璃投射微粒實現(xiàn)轟擊轉化。制備方法如下將20μg質粒DNA加入10μl“玻璃乳”活化的玻璃懸液(Jetsorb)中，并加入300μl緩沖液A1(制備商提供的玻璃乳懸液)。在53℃使DNA與玻璃乳結合15分鐘，離心之后用300μl緩沖液A1洗沉淀。通過離心使形成的懸液再沉淀，然后用緩沖液A2(也是制造商提供的玻璃乳懸液)洗2次。洗過之后使沉淀干燥，并再懸浮于200μl乙醇中。按照上述用于金微粒的投射轟擊程序將20μl等分量懸液用于每次轉化實驗。來自其它制造商的另一些活化的玻璃懸液也可以用于此程序。雖然已知活化的玻璃懸液可結合DNA，甚至可能比金微粒更好，但是用玻璃微粒的轟擊轉化實驗并沒有提高培養(yǎng)轉化效果。盡管可能使較多的DNA結合于這種微珠，但是玻璃比金具有較低的密度，這可能使穿透線蟲的效率較低。盡管如此，用玻璃微粒有可能以用金微粒大致相同的效果轉化秀麗新桿線蟲，這表明導入DNA的量和微粒的密度都不是重要的因素。結果下面概括了若干應用金微粒，按照上述方案進行的獨立的轟擊轉化實驗結果。在每種情況下都給出了待測DNA和標記DNA的性質。對于每種待測DNA/標記的組合，按照上面(B)部分給定的方法實施了若干不同的轟擊程序。然后給轉化子評分，評價其對ro1-6表型的表達和對pha-1條件性致死突變的挽救。一般來說，通過對在大培養(yǎng)板上，每次射擊((B)部分的步驟4)產生的滾動線蟲計數(shù)來計數(shù)F1，應用ro1-6選擇平均每次射擊獲得了二個轉化子。當應用微投射方案時，在下一個世代過程中這些轉化子只有10％是穩(wěn)定的(6次射擊中一個品系)。這些品系還常常表達二個其它的共轉化質粒(與ceh-13的GFP-報告構建物(Wittmann.C等(1997)發(fā)育，124:P4193-4200)或包含sud-1基因的質粒結合的pha-1)，見概括在表10A中的結果。通過使培養(yǎng)板改變至對F2世代中的挽救作用非允許的溫度，應用pha-1選擇系統(tǒng)，每二次射擊獲得了大約一個穩(wěn)定的品系。因此，對于選擇轉化的線蟲，pha-1選擇系統(tǒng)比ro1-6系統(tǒng)效率高3倍。pha-1轉基因線蟲還共表達了第二標記，但是，與在第一世代之后對穩(wěn)定滾動線蟲所選擇的，來自相同射擊的線蟲中相比較，共轉化作用以稍微較低的頻率(70％)發(fā)生(表10B)?？赡苁谴斯厕D化作用起初決定了DNA的臨界量，以致使不同的DNA被可靠地共連接形成連環(huán)序列(Mello.C.C.等(1991).EMBOJ.10:P3959-3970)。通過以較低靈敏度的ro1-6表型進行選擇，可能正好遺漏低于某一閾值的線蟲，而因此選擇具有較高共連接機會的線蟲。表11顯示出對一系列射擊的詳細分析結果。觀察到轉化作用的某種群集過程。在F2選擇時，14塊具有pha-1轉化品系的培養(yǎng)板中，在F1選擇時9塊攜帶有Ro1線蟲。并且，在Ro1選擇(F1)中發(fā)現(xiàn)的對二種標記穩(wěn)定的品系已聚集成簇。在F2選擇中，這些培養(yǎng)板經(jīng)常攜帶了另一些雙重轉化的品系。但是，這可能是由于在F1選擇中未能發(fā)現(xiàn)所有的滾動線蟲。還不清楚在F2選擇中隱藏了多少獨立的事件。在此給出的實施例中，對于所有的射擊都采用了120mm的有效距離和8-10巴的壓力。觀察到壓力(6-10巴)和距離的改變對轉化效率僅有非常小的影響。射擊之后在顯微鏡下觀察培養(yǎng)板時，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)板中心許多線蟲被殺死，此區(qū)域周圍的線蟲含有金微粒(圖1)，而更遠區(qū)域中的線蟲不含有金微粒。因此似乎速度梯度非常陡峭，并且在此所采用的實施例條件下，存在一個狹窄的轉化區(qū)，取決于壓力和距離，此區(qū)域可能位于線蟲沉淀內的不同位置。一個重要的因素是將線蟲置于一層薄的并相當干燥的菌苔中，否則線蟲會被吹掉。關于每次射擊線蟲的用量，只要足夠量的線蟲用于覆蓋投射區(qū)，但不要太多的線蟲，因為對于Ro1選擇難以處理太多的F1線蟲，或者對于pha-1選擇還要處理更大量的F2線蟲。即使在對方案未作任何修改的重復實驗中，也就是說，使用相同量的DNA，轟擊槍作相同的設置，以及對線蟲給予相同的培養(yǎng)條件，也觀察到轉化操作的效率會發(fā)生改變。嚴密的觀察顯示，在轟擊之后線蟲仍然在培養(yǎng)板中央的轟擊實驗，比線蟲被吹離培養(yǎng)板中央的實驗產生了較高的轉化效率。并且，被轟擊槍高壓力吹開的線蟲經(jīng)受不住這種轟擊過程。通過使用非常干的瓊脂板，含有高濃度瓊脂的瓊脂板，以及尚未接種大腸桿菌的瓊脂板，可以提高轟擊轉化操作的可再現(xiàn)性，和較小程度地改善其效率。而且，使線蟲固定化在瓊脂板上也可導致提高轟擊轉化的效率和可再現(xiàn)性?？傊炎C明，通過投射轟擊可以轉化秀麗新桿線蟲。目前此方法具有與微注射技術大致相同的效率，但是，微注射技術更多地依賴于實驗操作人員的訓練和技術，以及更加昂貴的設備。對于微注射法，使線蟲脫水有助于降低線蟲內部的壓力，因此了避免針頭穿入時發(fā)生脹裂，不同于微注射法，用脫水的線蟲不能實現(xiàn)轟擊轉化作用。射擊實驗1秀麗新桿線蟲株pha-1(e2123)標記-DNA1．以pRF4(ro1-6)選擇；單獨的F1在15℃2．以pBX(pha-1)選擇；F2/F3在一起，在25℃待測DNA加入的核酸狀態(tài)結束表1射擊實驗1的結果射擊實驗4秀麗新桿線蟲株pha-1(e2123)標記DNA1．以pRF4(rol-6)選擇；單獨的F1在15℃2．以pBX(pha-1)選擇；F2/F3在一起，在25℃待測DNApHl-FM6．9(sud-1)在與vab-9sud-1雜交之后加入的核酸狀態(tài)結束表2-射擊實驗4的結果射擊實驗6秀麗新桿線蟲株pha-1(e2123)標記DNA1．以pRF4(rol-6)選擇；單獨的F1在15℃2．以pBx(pha-1)選擇；F2/F3在一起，在25℃待測DNApH1-FM6.9(sud-1)與vab-9sud-1雜交之后加入的核酸狀態(tài)結束表3-射擊實驗6的結果射擊實驗7秀麗新桿線蟲株pha-1(e2123)標記DNA1．以pRF4(ro1-6)選擇；單獨的F1在15℃2．以pBx(pha-1)選擇；F2/F3在一起，在25℃待測DNApH1-FM6.9(sud-1)與vab-9sud-1雜交之后加入的核酸狀態(tài)結束表4-射擊實驗7的結果射擊實驗8秀麗新桿線蟲株pha-1(e2123)標記DNA1．以pRF4(ro1-6)選擇；單獨的F1在15℃2．以pBx(pha-1)選擇；F2/F3在一起，在25℃待測DNA:pH1-FM6-9(sud-1)與vab-9sud-1雜交之后加入的核酸狀態(tài)結束表5-射擊實驗8的結果射擊實驗9秀麗新桿線蟲株pha-1(e2123)標記DNA1．以pRF4(ro1-6)選擇；單獨的F1在15℃2．以pBx(pha-1)選擇；25℃F2/F3在一起待測DNApFM(ceh-13∷1acz)在F2/F3中的熒光加入的核酸狀態(tài)結束表6-射擊實驗9的結果射擊實驗10秀麗新桿線蟲株pha-1(e2123)標記DNA1．以pRF4(ro1-6)選擇；單獨的F1在15℃2．以pBX(pha-1)選擇；25℃F2/F3在一起待測DNA:pFM(ceh-13∷1acz)在F2/F3中的熒光加入的核酸t(yī)NRA狀態(tài)結束表7-射擊實驗10的結果射擊實驗11秀麗新桿線蟲株pha-1(e2123)標記DNA1．以pRF4(ro1-6)選擇；單獨的F1在15℃2．以pBX(pha-1)選擇；25℃F2/F3在一起待測DNA:pFM(ceh-13∷1acz)在F2/F3中的熒光加入的核酸狀態(tài)中斷表8-射擊實驗11的結果射擊實驗12秀麗新桿線蟲株pha-1(e2123)標記DNA1．以pRF4(ro1-6)選擇；單獨的F1在15℃2．以pBX(pha-1)選擇；25℃F2/F3在一起待測DNA:pFM(ceh-13∷1acz)在F2/F3中的熒光加入的核酸狀態(tài)中斷表9-射擊實驗12的結果表格注釋對相同的次級培養(yǎng)板1-4進行了第1次選擇(Ro1-6)和第2次選擇(pha-1)，但是，二個選擇程序是彼此無關的。沒有評價或實施的選擇途徑射擊No.2在4塊次級培養(yǎng)板中的1塊上，鑒定出2個F1線蟲為表型ro1-6，并被分離出；它們不產生Ro1-6后代(F2-F4)；暫時轉化作用射擊No.3在4塊次級培養(yǎng)板中的2塊上，鑒定出3個和2個F1線蟲為表型Ro1-6，并被分離出；在實驗3/2中它們產生了Ro1-6后代，但在實驗3/4中不產生Ro1-6后代(F2-F4)；穩(wěn)定的和暫時的轉化射擊No.6在4塊次級培養(yǎng)板中的1塊上，鑒定出2個F1線蟲為表型Ro1-6，并被分離出，它們不產生Ro1-6后代(F2-F4)，但呈現(xiàn)出pha-1的表型挽救作用；對于Ro1-6暫時轉化，但對于pha-1穩(wěn)定轉化射擊No.5在4塊次級培養(yǎng)板中的1塊上，在選擇條件(=25℃)下，在F2和F3線蟲中觀察到pha-1的表型挽救作用；幾代之后是穩(wěn)定的；穩(wěn)定的轉化作用射擊No.8在4塊次級培養(yǎng)板中的2塊上，鑒定出4個和3個F1線蟲為表型Ro1-6，并被分離出；在實驗8/2中它們不產生Ro1-6后代，但在實驗8/3中它們產生了Ro1-6后代(F2-F4)；而且，對于pha-1也實現(xiàn)了共轉化作用；穩(wěn)定的和暫時的轉化作用。在4塊次級培養(yǎng)板中的2塊上，在選擇條件(=25℃)下，在F2和F3線蟲中觀察到pha-1的表型挽救作用；在一次射擊中(8/3)，對于Ro1-6的穩(wěn)定共轉化作用是明顯的；對于pha-1和Ro1-6的穩(wěn)定共轉化作用在實驗8/2中，暫時轉化的Ro1-6后代與對pha-1的共轉化作用有關；在實驗8/3中，對于二種選擇途徑都可證明對Ro1-6的穩(wěn)定轉化作用。射擊No.3關于對特定待測DNA種類的共轉化作用，進一步研究了穩(wěn)定轉化的品系；在ceh-13∷gfp(pFM)中是通過外表熒光，在sud-1(pH1-FM6.9)是通過與vab-9sud-1(t-1237)雜交；在每次實驗中通過外表熒光測定出5個Ro1-6陽性線蟲(pFM)，但在sud-1(pH1-FM6.9)中是通過與vab-9sud-1(t-1237)雜交；在這方面，每次實驗測定出5個Ro1-6陽性動物；對待測DNA陽性表10表10顯示通過微粒轟擊使秀麗新桿線蟲轉化的實驗結果。在全部實驗中使用了Pha-1(e2123)兩性體。(A)以質粒pRF4(ro1-6)和pBX(pha-1)轉化了線蟲。此外，以第三種DNA測定了對它的共表達作用。如通過熒光顯微鏡所顯示的，在轉基因胚胎中，ceh-13∷GFP構建物已被適當?shù)乇磉_(見Wittman等，如上面所述)。在如通過雜交試驗揭示，在轉基因中，通過共轉化的質粒pH1-FM6.9(上面所述的)，還補充了sud-1(t1237)的母體效應突變作用。目前大約有半數(shù)的射擊不顯示出任何轉化體?？赡苁怯捎趩为氜D化的兩性體，轉化作用被聚集(表Y)。(轉化體)指示所有Ro1線蟲的數(shù)目；(獨立的轉化體)指示來自被擊的初始培養(yǎng)板中不同切片的Ro1線蟲；以及獨立產生的這種線蟲。對于有關ro1-6選擇的更多數(shù)據(jù)也可參見(B)。(B)在此實驗系列中，也以pha-1系統(tǒng)在F2中選擇出轉化體。在大約半數(shù)射擊中分離出穩(wěn)定共轉化的品系。因為以rol-6觀察到聚集現(xiàn)象，所以尚不清楚是否這些品系代表單獨的事件。因此，為了確立等基因系，應將一些品系克隆出。表11<tablesid="table5"num="005"><table>射擊號rol-6選擇pha-1選擇12341234121R31RP454RPRpPRPR62R72R2RPRPR82RPPR9PR102R112R121RPR131R1R1412R15167RPPR171R10RFPRPRPR181R</table></tables>表11顯示系列#6射擊實驗的分析結果，如在此所顯示的，對所有的實驗進行了評價。為了如在實施例2C部分中所述選擇轉基因線蟲，將相應于一次射擊的線蟲分配到4塊培養(yǎng)板中。(R)為滾動的轉化體。(P)為pha-1轉化體。正常的字體表示rol標記的暫時表達．指示了在Rol選擇中發(fā)現(xiàn)的線蟲數(shù)目。為了試驗對Rol標記的穩(wěn)定表達，將來自一塊切片的線蟲在一起培養(yǎng)。然后以pha-1測定這些品系的共轉化作用。黑體字表示對這些標記的穩(wěn)定表達。實施例3-轟擊轉化的另一種方法按照實施例2的(A)部分制備線蟲用于轟擊轉化。將一滴高濃度的核酸溶液(1mg／ml或更多)置于線蟲墊層上并使其干燥。然后用微投射粒子轟擊此線蟲，此微投射粒子沒有按照實施例2(B)部分給出的方案用任何核酸包涂，并對轉化體進行選擇。權利要求1．一種將核酸導入線蟲的方法，該方法包括用許多微投射粒子轟擊此線蟲。2．根據(jù)權利要求1的方法，其中用所述核酸包涂了此微投射粒子。3．根據(jù)權利要求1的方法，其中在以許多微投射粒子轟擊之前，先用所述核酸包涂此線蟲。4．根據(jù)權利要求1-3中任何之一的方法，其中該線蟲攜帶有條件性致死突變基因，并且所述核酸包括含有此條件性致死突變基因野生型等價物的質粒。5．根據(jù)權利要求1-4中任何之一的方法，其中的核酸編碼一種顯性表型標記。6．根據(jù)權利要求5的方法，其中顯性表型標記是Ro1-6或自激性熒光蛋白。7．根據(jù)權利要求1-6中任何之一的方法，此方法進一步包括在用許多微投射粒子轟擊線蟲之前將此線蟲置于一薄層干菌苔上。8．根據(jù)權利要求1-6中任何之一的方法，此方法還進一步包括在用許多微投射粒子轟擊線蟲之前，將此線蟲置于干的聚合物培養(yǎng)板上。9．根據(jù)權利要求8的方法，其中的聚合物是瓊脂。10．根據(jù)前述權利要求中任何之一的方法，其中在用許多微投射粒子轟擊之前首先使線蟲固定化。11．根據(jù)前述權利要求中任何之一的方法，其中的微投射粒子是金微?；蚧罨牟Ａ⒘！?2．根據(jù)前述權利要求中任何之一的方法，其中的線蟲是秀麗新桿線蟲。13．一種線蟲，它包含按照權利要求1-12中任何之一的方法導入的核酸。全文摘要描述了一種將核酸導入線蟲的轟擊方法,此方法包括用許多微投射粒子轟擊此線蟲。并提供了按照本發(fā)明方法轉化的線蟲。文檔編號C12N15/89GK1302335SQ99806532公開日2001年7月4日申請日期1999年3月22日優(yōu)先權日1998年3月23日發(fā)明者拉爾夫·施納貝爾申請人:拉爾夫·施納貝爾