專(zhuān)利名稱(chēng)：利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的方法及其專(zhuān)用表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域中蛋白拯救的方法，特別是涉及一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的方法及其專(zhuān)用表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
秀麗線蟲(chóng)作為第一個(gè)完成全基因組序列測(cè)定的多細(xì)胞真核模式生物，因其細(xì)胞數(shù)量明確、遺傳背景清楚、基因組小及易于操作等優(yōu)點(diǎn)已廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和分子生物學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域(Greer et al. Members of the H3K4trimethylation complex regulate lifespan in a germline-dependent manner in C. elegans. Nature. 2010 Jul 15,466(7304) :383_7)。基于秀麗線蟲(chóng)平臺(tái)規(guī)?；Y選其體內(nèi)功能性蛋白的作用已成為目前研究的熱點(diǎn)。傳統(tǒng)基因水平上的顯微注射和RNA干涉雖能到達(dá)研究秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白的作用，但由于其存在操作繁瑣、成本高、周期長(zhǎng)及破壞性大等缺點(diǎn)，更甚至于會(huì)出現(xiàn)功能蛋白不表達(dá)的現(xiàn)象，使秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)重要功能蛋白的研究及相應(yīng)表型的篩選受到了極大限制(Rieckher et al. Transgenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol.2009,561 21~39 ；Shyu et al. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 2008,3(4) :588_96.)。自然條件下秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白不表達(dá)主要是由于其體內(nèi)基因突變和/或基因缺失導(dǎo)致的，基于這類(lèi)基因異常的秀麗線蟲(chóng)的研究結(jié)果不可靠，而基于蛋白水平針對(duì)秀麗線蟲(chóng)本身的修復(fù)研究尚未展開(kāi)。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明人在長(zhǎng)期從事秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白的原核表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)直接喂飼體外高效表達(dá)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白的大腸桿菌不僅可以實(shí)現(xiàn)其突變株系表型的回復(fù)， 而且可改變其因基因突變導(dǎo)致的蛋白功能缺失，進(jìn)而達(dá)到蛋白拯救(protein rescue)的目的。本發(fā)明的目的是提供一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的專(zhuān)用表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的專(zhuān)用表達(dá)載體，是含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的原核表達(dá)載體。所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽可為T(mén)AT、Antp, VP22、Poly(Arg)和/或Poly (Lys)等，優(yōu)選為 TAT。用于構(gòu)建所述原核表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種外源基因的原核表達(dá)載體， 如 pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 等，優(yōu)選為 pET28。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的方法。本發(fā)明所提供的利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的方法，是將秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)表型明顯的功能蛋白的編碼基因插入權(quán)利要求1或2或3所述專(zhuān)用表達(dá)載體中，將得到的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)并誘導(dǎo)表達(dá)，將得到的重組大腸桿菌喂飼功能蛋白缺失秀麗線蟲(chóng)或野生型株系秀麗線蟲(chóng)而實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救?？砂? 括以下具體步驟1)篩選秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)表型明顯的功能蛋白并克隆其編碼基因；2)將功能蛋白編碼基因插入上述專(zhuān)用表達(dá)載體中，得到含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽編碼區(qū)和功能蛋白編碼基因相融合的原核表達(dá)載體；3)將步驟2)構(gòu)建的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)；4)原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)；5)將表達(dá)功能蛋白的重組大腸桿菌喂飼功能蛋白缺失的秀麗線蟲(chóng)；6)秀麗線蟲(chóng)表型篩選和功能蛋白調(diào)控因子表達(dá)水平檢測(cè)。在上述利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的方法中，所述步驟3)中大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌可為BL21、DH5 α、HBlOl、JM109、0Ρ50或耐輻射奇球菌等。上述重組表達(dá)載體和重組菌均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。所述步驟4)中可采用化學(xué)試劑誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)， 其中，化學(xué)試劑誘導(dǎo)表達(dá)條件可為采用500mL搖瓶發(fā)酵(150mL/瓶)；誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(終濃度ImM)；誘導(dǎo)表達(dá)的OD6tltl = 0. 6-1. 0 ；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間6_8小時(shí)。所述步驟4)中還可采用溫度誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其中，溫度誘導(dǎo)表達(dá)條件可為采用500mL搖瓶30°C發(fā)酵(150mL/瓶)；誘導(dǎo)表達(dá)的0D_ = 0. 4-0. 6 ；誘導(dǎo)表達(dá)溫度42°C -44°C ；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間6_8小時(shí)。此外，所述步驟4)中的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)可采用SDS-PAGE和/或免疫印跡法。所述步驟5)中喂飼秀麗線蟲(chóng)的大腸桿菌是步驟4)中鑒定表達(dá)功能蛋白的菌株且預(yù)先涂布到NGM平皿或LB平皿中。所述步驟6)中秀麗線蟲(chóng)表型篩選是指篩選出具有功能蛋白表型的秀麗線蟲(chóng)，具體包括形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞水平變化等，如是否出現(xiàn)體型變小或肥胖、是否出現(xiàn)空泡現(xiàn)象、 是否出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)行為失調(diào)等；功能蛋白調(diào)控因子包括蛋白質(zhì)，DNA和RNA等，其表達(dá)水平篩選可以為免疫印跡、凝膠遷移實(shí)驗(yàn)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。本發(fā)明結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域家族的研究，以及利用秀麗線蟲(chóng)的主要食物來(lái)源大腸桿菌為中介，提供了一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的方法及其專(zhuān)用表達(dá)載體。本發(fā)明所述蛋白拯救(protein rescue)是指通過(guò)給特定功能蛋白編碼基因突變的秀麗線蟲(chóng)株系喂飼能夠表達(dá)該功能蛋白的微生物如大腸桿菌，從而糾正秀麗線蟲(chóng)株系中該功能蛋白缺失表型的技術(shù)。本發(fā)明不僅能夠克服常規(guī)基于模式生物秀麗線蟲(chóng)研究功能蛋白方法的缺陷，而且可以通過(guò)微生物如大腸桿菌直接轉(zhuǎn)導(dǎo)體外高效表達(dá)的功能蛋白，避免了功能性基因不表達(dá)的現(xiàn)象，進(jìn)而節(jié)約了特異功能蛋白篩查及大規(guī)模研究的成本等。同時(shí)，迄今為止未見(jiàn)利用蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用并依賴(lài)大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的研究報(bào)道。本發(fā)明提供的利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)從蛋白質(zhì)角度拯救秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白的方法，具有十分廣泛的應(yīng)用前景，不僅可用于秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白的拯救研究和應(yīng)用，而且還可用于其他物質(zhì)例如果蠅、斑馬魚(yú)、小鼠、大鼠等動(dòng)物體內(nèi)功能蛋白的拯救研究，因此有望成為重組蛋白類(lèi)藥物篩選的重要技術(shù)手段， 同時(shí)也將有可能成為蛋白質(zhì)功能研究的重要技術(shù)之一。本發(fā)明利用秀麗線蟲(chóng)平臺(tái)及原核表達(dá)體系首次提出了蛋白拯救的作用，為基于蛋白功能的研究及載體篩選提供重要的技術(shù)平臺(tái)，具有重要的原創(chuàng)性和新穎性。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1 原核表達(dá)載體pET28b-Tat_EGFP和pET28b_EGFP的構(gòu)建示意圖。圖 2 =SDS-PAGE 和 Western blot 檢測(cè) Tat-EGFP 和 EGFP 蛋白的表達(dá)。圖3 熒光顯微鏡觀察表達(dá)EGFP的菌體細(xì)胞的熒光信號(hào)。圖4 熒光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP蛋白熒光信號(hào)在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)分布變化。圖 5 原核表達(dá)載體 pET28-Tat-S0D-l，2，3，4，5 和 pET28_S0D_l，2，3，4，5 構(gòu)建的菌液PCR鑒定結(jié)果。圖 6 :SDS-PAGE 檢測(cè) Tat-SOD-l，2，3，4，5 和 S0D-1，2，3，4，5 蛋白的表達(dá)變化。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的專(zhuān)用表達(dá)載體的構(gòu)建可采用任何已知的方法構(gòu)建利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的專(zhuān)用表達(dá)載體，該專(zhuān)用表達(dá)載體是含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的原核表達(dá)載體，所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽為T(mén)AT、Antp、VP22、Poly(Arg)和/或Poly(Lys)等，用于構(gòu)建所述原核表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種外源基因的原核表達(dá)載體，如PET28、 pBV220、pET30、pCRT7/CT-T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 等。本實(shí)施例以 pET28b 為出發(fā)載體構(gòu)建含有TAT的重組表達(dá)載體為例，介紹了一種構(gòu)建秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的專(zhuān)用表達(dá)載體的方法，含有其它蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的重組表達(dá)載體也可參照此方法構(gòu)建，具體構(gòu)建方法為首先通過(guò)化學(xué)合成的方法合成含有酶切位點(diǎn)為NcoI (上游)和NdeI (下游)的雙鏈TAT肽段(GenBank :ADK70247. 1)的核心編碼序列片段，然后采用限制性?xún)?nèi)切酶NcoI和 NdeI雙酶切該TAT核心片段和空載體pET28b (美國(guó)Novagen公司)，分別回收目的片段后， 經(jīng)T4DNA連接酶連接經(jīng)酶切的TAT DNA片段和空載體片段，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)中，篩選重組子，按照常規(guī)方法提取重組子的質(zhì)粒DNA并進(jìn)行NcoI 和NdeI雙酶切鑒定，最后送英駿公司直接測(cè)序，確證含有TAT核心片段的原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，將該重組載體命名為pET28b-TAT。實(shí)施例2、利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)綠色熒光蛋白在野生型株系秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)
1)原核表達(dá)載體pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)
首先以質(zhì)粒pEGFP-Nl (購(gòu)自Clontech公司)為模板并利用引物對(duì)(斜體部分分別為 BamHI 和 XhoI 酶切位點(diǎn)):pU_5，-CGC GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAG-3‘(序列表中序列 1) ；pD_5，-CCG CTCGAG CTTGTACAGCTCGTCCAT-3‘(序列表中序列 2)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增獲得增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP，GenBank號(hào)ADQ73885. l)cDNA編碼序列(717bp)，然后采用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI/XhoI雙酶切目的基因EGFP和質(zhì)粒載體pET28b和pET28b_TAT ；酶切產(chǎn)物回收后采用T4DNA連接酶于16°C連接過(guò)夜；次日，將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3) 并采用限制性?xún)?nèi)切酶酶切和直接測(cè)序鑒定。酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果表明獲得了攜帶有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽TAT核心肽段的綠色熒光蛋白的原核表達(dá)載體pET28b-TAT-EGFP和僅攜帶有綠色熒光蛋白的原核表達(dá)載體pET28b-EGFP，構(gòu)建方法示意圖如圖1所示。2)隨后，將轉(zhuǎn)化有質(zhì)粒載體pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP的宿主菌 BL2KDE3)涂布到含有卡那霉素(終濃度100yg/ml)的LB固體培養(yǎng)基，37°C恒溫箱孵育 10-12小時(shí)待長(zhǎng)出克隆。次日，挑取陽(yáng)性克隆接種到5ml含有卡那霉素(終濃度100 μ g/ml) 的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌過(guò)夜使菌體完全復(fù)蘇；然后按照1 100的比例將菌液接種到150ml新配置的含有卡那霉素(終濃度100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、 220rpm搖菌約4_5小時(shí)，待0D_為0. 6-1. 0時(shí)加入誘導(dǎo)劑異丙基-β -D-硫代半乳糖苷 (Isopropyl β -D-l-Thiogalactopyranoside, IPTG)，終濃度 ImM)，迅速置于 30°C、220rpm 搖床誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)，并于第2小時(shí)，第4小時(shí)和第6小時(shí)收集菌體細(xì)胞，部分菌體細(xì)胞待熒光顯微鏡觀察，其余菌體細(xì)胞超聲破碎后直接制備上清蛋白樣品待SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)。SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)方法為A、將上述超聲破碎后直接制備的上清蛋白樣品采用15% SDS-PAGE分離，然后采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色并脫色，最后采用凝膠成像儀采集圖像；B、隨后，將上述制備的上清蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離后按照說(shuō)明書(shū)所述方法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉30分鐘；其次采用EGFP(TBST 1 3000 稀釋)和GAPDH(TBST 1 500稀釋)單克隆抗體室溫共孵育1. 5小時(shí)，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；然后采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗(TBST 1 5000 稀釋)室溫孵育30分鐘，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；最后采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯影并掃描，以pET28b和pET28b-TAT為空載體對(duì)照。結(jié)果如圖2所示(圖中箭頭所示分別為內(nèi)標(biāo)蛋白GAPDH，TAT-EGFP和EGFP蛋白條帶所在位置)，表明通過(guò)體外誘導(dǎo)表達(dá)及SDS-PAGE和免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白的高效可溶性表達(dá)。3)誘導(dǎo)表達(dá)菌體熒光顯微鏡觀察將上述誘導(dǎo)表達(dá)的菌體細(xì)胞采用10 μ 1接種環(huán)均勻地涂布到干凈的載玻片上，待其自然風(fēng)干后采用熒光顯微鏡觀察菌體細(xì)胞熒光信號(hào)，分別采集誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間點(diǎn)菌體細(xì)胞的熒光圖像及微分干涉圖像，最后通過(guò)圖像合并技術(shù)觀察TAT-EGFP和EGFP在大腸桿菌細(xì)胞中的表達(dá)情況，以pET28b和pET28b-TAT為空載體對(duì)照。誘導(dǎo)表達(dá)菌體熒光顯微鏡觀察結(jié)果如圖3所示(熒光顯微鏡觀察不同誘導(dǎo)時(shí)間菌體細(xì)胞熒光信號(hào)圖中表示針對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)不同時(shí)間的菌體細(xì)胞進(jìn)行熒光信號(hào)的檢測(cè)0h(A)、2h(B)、4h(C)、6h(D))，隨著誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的增加，菌體細(xì)胞中表達(dá)的綠色熒光蛋白在增加。4)野生型株系秀麗線蟲(chóng)的喂飼及熒光顯微鏡觀察將誘導(dǎo)表達(dá)TAT-EGFP和EGFP融合蛋白的大腸桿菌BL21 (DE3)菌體細(xì)胞涂布到LB平皿中，待其室溫稍干后置于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)待大量克隆長(zhǎng)出，挑取野生型株系秀麗線蟲(chóng)20只于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)并采用熒光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP熒光信號(hào)在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)分布，并于喂飼第48小時(shí)采集熒光圖像和微分干涉圖像，最后通過(guò)圖像合并技術(shù)觀察TAT-EGFP和EGFP融合蛋白在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)的分布情況，以pET28b和 pET28b-TAT為空載體對(duì)照。熒光顯微鏡觀察TAT-EGFP和EGFP蛋白熒光信號(hào)在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)分布變化如圖4所示(圖中箭頭所示為T(mén)AT-EGFP和EGFP融合蛋白在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)的分布位置)，通過(guò)直接喂飼秀麗線蟲(chóng)表達(dá)靶蛋白的大腸桿菌細(xì)胞48小時(shí)后，TAT-EGFP熒光信號(hào)明顯分布于秀麗線蟲(chóng)腸壁細(xì)胞，而EGFP熒光信號(hào)則分布在秀麗線蟲(chóng)腸腔，空載體對(duì)照組未見(jiàn)任何熒光信號(hào)，說(shuō)明TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽能夠高效介導(dǎo)外源蛋白在秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)。同時(shí)，通過(guò)比較空載體對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組秀麗線蟲(chóng)微分干涉圖像未見(jiàn)其出現(xiàn)明顯的細(xì)胞形態(tài)變化，由此說(shuō)明TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽具有相對(duì)安全的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，能夠介導(dǎo)外源蛋白跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入秀麗線蟲(chóng)腸壁細(xì)胞，為后續(xù)基于秀麗線蟲(chóng)平臺(tái)及原核表達(dá)體系研究秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白的拯救提供了技術(shù)支持。實(shí)施例3、利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)突變株系秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)相關(guān)功能蛋白 S0D-1，2，3，4，5 的拯救1.方法1)原核表達(dá)載體pET28-Tat-S0D-l，2，3，4，5 和 pET28-S0D_l，2，3,4,5 的構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá)參照實(shí)施例2的載體構(gòu)建方法構(gòu)建分別攜帶秀麗線蟲(chóng)S0D-1，2，3,4, 5不同長(zhǎng)度的 cDNA編碼序列及Tat轉(zhuǎn)導(dǎo)肽序列的原核表達(dá)載體，以不含轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的原核表達(dá)載體為對(duì)照。 首先針對(duì)野生型株系秀麗線蟲(chóng)提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄，然后以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板并結(jié)合以下引物對(duì)(斜體部分分別為酶切位點(diǎn))pU_BamHI-S0D-1 :5，-CGC GGATCCG ATGTTTATGAATCTTCTCACTCAGGT-3，(序列表中序列3)pD_XhoI-S0D-1 :5，-CCG CTCGAG CTGGGGAGCAGCGAGAG-3‘(序列表中序列 4)pU_EcoRI-S0D-2 :5，-CCG GMTTCG ATGCTTCAAAACACCGTTCGCTG-3‘(序列表中序列5)pD_XhoI-S0D"2 5'-CCG CTCGAG TTGCTGTGCCTTTGCAAAACGC-3，(序列表中序列 6)pU_EcoRI-S0D-3 :5，-CCG GMTTCG ATGCTGCAATCTACTGCTCGCAC-3‘(序列表中序列7)pD_XhoI-S0D-3 :5，-CCG CTCGAG TTGTCGAGCATTGGCAAATCTCT-3‘(序列表中序列 8)pU_BamH I-S0D-4 :5，-CGC GGATCCG ATGAAAACTCGTGTTGTTTTAATTCTGGC-3‘(序列表中序列9) pD_XhoI-S0D-4 :5，-CCG CTCGAG GACGGTACCGATAGTTCCACATG-3‘(序列表中序列 10)pU_BamHI-S0D-5 :5，-CGC GGATCCG' ATGGATATTCTCTCTGATATTGCCAATGC-3‘(序列表中序列11)pD_XhoI-S0D-5 :5，-CCG CTCGAG TGCAGGAGCGGCAAGAGCAATG-3‘(序列表中序列12)隨 后進(jìn)行PCR擴(kuò)增以獲得S0D-1,2,3,4,5不同長(zhǎng)度的cDNA編碼序列，然后將目的基因和載體酶切后構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28-Tat-S0D-l，2，3，4，5和pET28-S0D_l，2，3,4, 5，最后將上述載體酶切及直接測(cè)序確證。菌液PCR鑒定結(jié)果如圖5所示，進(jìn)一步測(cè)序分析表明成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體 pET28-Tat-S0D-l，2，3，4，5 和 pET28_S0D_l，2，3，4，5。隨后，將上述構(gòu)建正確的原核表達(dá)載體pET28-Tat-S0D_l，2，3,4, 5和 pET28-S0D-l，2，3，4，5轉(zhuǎn)化入宿主菌BL21(DE3)并涂布到含有卡那霉素(終濃度IOOyg/ ml)的LB固體培養(yǎng)基，37°C恒溫箱孵育10-12小時(shí)待長(zhǎng)出克隆。次日，挑取陽(yáng)性克隆接種到 5ml含有卡那霉素(終濃度100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌過(guò)夜使菌體完全復(fù)蘇；然后按照1 100的比例將菌液接種到150ml新配置的含有卡那霉素(終濃度 100 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C、220rpm搖菌約4-5小時(shí)，待OD6tltl為0. 6-1. 0時(shí)加入誘導(dǎo)劑異丙基 _ β -D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β -D-l-Thiogalactopyranoside, IPTG)， 終濃度ImM)，迅速置于30°C、220rpm搖床誘導(dǎo)表達(dá)6小時(shí)，并于第2小時(shí)，第4小時(shí)和第6小時(shí)收集菌體細(xì)胞并超聲破碎后直接制備總蛋白，上清蛋白和沉淀蛋白樣品待SDS-PAGE和 Western blot檢測(cè)。SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)方法為A、將上述超聲破碎后直接制備的蛋白樣品采用15% SDS-PAGE分離，然后采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色并脫色，最后采用凝膠成像儀采集圖像；B、將上述制備的上清蛋白樣品經(jīng)15% SDS-PAGE分離后按照說(shuō)明書(shū)所述方法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉30分鐘；其次采用6XHis(TBST 1 3000 稀釋)單克隆抗體室溫共孵育1.5小時(shí)，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；然后采用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 二抗(TBST 1 5000稀釋)室溫孵育30分鐘，TBST室溫洗膜三次(10分鐘/次)；最后采用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒顯影并掃描，以pET28b和 pET28b-TAT為空載體對(duì)照。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，顯示體外高效可溶性表達(dá)制備 7 Tat-SOD-I, 2, 3,4, 5 ^P S0D-1，2，3，4，5 蛋白，特別是 Tat-SOD-l，2，3，4，5。2) S0D-1，2，3，4，5突變株系秀麗線蟲(chóng)的喂飼及成蟲(chóng)率統(tǒng)計(jì)分析將誘導(dǎo)表達(dá)TAT-S0D-1，2，3，4，5和S0D-1，2，3，4，5融合蛋白的大腸桿菌 BL21 (DE3)菌體細(xì)胞涂布到LB或NGM平皿中，待其室溫稍干后置于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72小時(shí)待大量克隆長(zhǎng)出，挑取S0D-1，2，3,4,5基因突變株系秀麗線蟲(chóng)(分別為不表達(dá)功能蛋白S0D-1、S0D-2、S0D-3、SOD-4、S0D-5的秀麗線蟲(chóng))20只于20°C生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)48小時(shí)。然后將秀麗線蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至含有不同濃度(0. 1-0. 5mM)百草枯的NGM培養(yǎng)基上喂養(yǎng)以觀察成蟲(chóng)率及表型變化，如秀麗線蟲(chóng)發(fā)育、體長(zhǎng)及抗百草枯毒性等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，喂飼秀麗線蟲(chóng)體外高效表達(dá)表達(dá)TAT-S0D-1，2，3，4，5的菌體對(duì)0. 1-0. 3mM的百草枯所導(dǎo)致的秀麗線蟲(chóng)損傷具有明顯的抵抗作用，其成蟲(chóng)率比蛋白拯救干預(yù)之前恢復(fù)正常，而喂飼秀麗線蟲(chóng)體外高效表達(dá)表達(dá)S0D-1，2，3，4，5(不含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽TAT)的菌體對(duì)0. 1-0. 5mM的百草枯具有相對(duì)較弱的抵抗作用，同時(shí)對(duì)照組(喂飼含有空載體pET28b的BL21(DE3)大腸桿菌組)未見(jiàn)明顯的抗百草枯損傷作用，從而說(shuō)明實(shí)現(xiàn)了 S0D-1，2，3，4，5基因突變株系秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白的拯救，同時(shí)說(shuō)明利用含有轉(zhuǎn)導(dǎo)肽TAT的表達(dá)體系能夠更好地發(fā)揮蛋白拯救技術(shù)的作用。
權(quán)利要求
1.一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的專(zhuān)用表達(dá)載體， 是含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的原核表達(dá)載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專(zhuān)用表達(dá)載體，其特征在于所述蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽為T(mén)AT、Antp, VP22、Poly (Arg)和 / 或 Poly (Lys)，優(yōu)選為 TAT。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的專(zhuān)用表達(dá)載體，其特征在于用于構(gòu)建所述原核表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種外源基因的原核表達(dá)載體，如PET28、pBV220、pET30、pCRT7/ CT-TOPO, pETlOl/D-TOPO 或 pQE30，優(yōu)選為 pET28。
4.一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的方法，是將秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)表型明顯的功能蛋白的編碼基因插入權(quán)利要求1或2或3所述專(zhuān)用表達(dá)載體中， 將得到的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)并誘導(dǎo)表達(dá)，將得到的重組大腸桿菌喂飼功能蛋白缺失秀麗線蟲(chóng)或野生型株系秀麗線蟲(chóng)而實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于具體包括以下步驟1)篩選秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)表型明顯的功能蛋白并克隆其編碼基因；2)將功能蛋白編碼基因插入上述專(zhuān)用表達(dá)載體中，得到含有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽編碼區(qū)和功能蛋白編碼基因相融合的原核表達(dá)載體；3)將步驟2)構(gòu)建的原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)；4)原核表達(dá)載體的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白表達(dá)水平檢測(cè)；5)將表達(dá)功能蛋白的重組大腸桿菌喂飼功能蛋白缺失秀麗線蟲(chóng)或野生型株系秀麗線蟲(chóng)；6)秀麗線蟲(chóng)表型篩選和功能蛋白調(diào)控因子表達(dá)水平檢測(cè)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟3)中大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)的宿主菌為BL21、DH5a、HBlOl、JM109、0P50或耐輻射奇球菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于所述步驟4)中采用化學(xué)試劑誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其中，化學(xué)試劑誘導(dǎo)表達(dá)條件為誘導(dǎo)劑IPTG誘導(dǎo)表達(dá)(終濃度ImM)；誘導(dǎo)表達(dá)的OD6tltl = 0. 6-1. O ；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間6_8小時(shí)；或所述步驟4)中采用溫度誘導(dǎo)外源基因在大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)，其中，溫度誘導(dǎo)表達(dá)條件可為誘導(dǎo)表達(dá)的0D_ = 0. 4-0. 6 ；誘導(dǎo)表達(dá)溫度42°C -44°C ；誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間 6-8小時(shí)。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6或7所述的方法，其特征在于所述步驟4)中的蛋白表達(dá)水平檢測(cè)可采用SDS-PAGE和/或免疫印跡法。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8任一所述的方法，其特征在于所述步驟5)中喂飼秀麗線蟲(chóng)的大腸桿菌是步驟4)中鑒定表達(dá)功能蛋白的菌株且預(yù)先涂布到LB或NGM平皿中。
10.根據(jù)權(quán)利要求5至9任一所述的方法，其特征在于所述步驟6)中秀麗線蟲(chóng)表型篩選包括形態(tài)結(jié)構(gòu)變化和細(xì)胞水平變化，如是否出現(xiàn)體型變小或肥胖、是否出現(xiàn)空泡現(xiàn)象等； 功能蛋白調(diào)控因子包括蛋白質(zhì)，DNA和RNA等，其表達(dá)水平篩選可以為免疫印跡，凝膠遷移實(shí)驗(yàn)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)等。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)功能蛋白拯救的方法及其專(zhuān)用表達(dá)載體。該載體是含有一個(gè)或多個(gè)相同或不同蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)肽的原核表達(dá)載體。該方法包括將秀麗線蟲(chóng)體內(nèi)表型明顯的功能蛋白的編碼基因插入該專(zhuān)用表達(dá)載體中，再轉(zhuǎn)化入大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)并誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)功能蛋白的重組大腸桿菌喂飼功能蛋白缺失秀麗線蟲(chóng)或野生型株系秀麗線蟲(chóng)，通過(guò)秀麗線蟲(chóng)表型篩選和功能蛋白調(diào)控因子表達(dá)水平檢測(cè)進(jìn)行蛋白拯救功能驗(yàn)證。本發(fā)明具有十分廣泛的應(yīng)用前景，有望成為重組蛋白類(lèi)藥物篩選的重要技術(shù)手段，同時(shí)也是進(jìn)行蛋白質(zhì)功能研究的重要技術(shù)之一。
文檔編號(hào)C12N15/70GK102352373SQ201110270229
公開(kāi)日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月13日
發(fā)明者葉巧, 吳永紅, 張成崗, 張曉 , 李偉光, 石錦平, 高艷 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射醫(yī)學(xué)研究所