用于植入的中腦多巴胺(da)神經(jīng)元的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及多能或多潛能干細(xì)胞的譜系特異性分化，上述多能或多潛能干細(xì)胞可以包括，但不限于，除了非胚胎人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞(hiPSC)以外還有的人胚胎干細(xì)胞(hESC)、成體干細(xì)胞、來自患有疾病的患者的干細(xì)胞或者任何能夠進(jìn)行譜系特異性分化的其它干細(xì)胞。具體描述了以下方法：引導(dǎo)hESC和/或hiPSC譜系特異性分化成底板中腦祖細(xì)胞，然后使用新的培養(yǎng)條件進(jìn)一步分化成大量的中腦結(jié)局FOXA2+LMX1A+TH+多巴胺(DA)神經(jīng)元。使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的中腦結(jié)局FOXA2+LMX1A+TH+多巴胺(DA)神經(jīng)元進(jìn)一步預(yù)期用于多種用途，其包括，但不限于，在體外藥物發(fā)現(xiàn)檢測(cè)中的用途、神經(jīng)學(xué)研究、以及作為患者多巴胺神經(jīng)元的疾病逆轉(zhuǎn)或損傷或缺乏的治療劑。而且，提供了從人多能干細(xì)胞分化中腦結(jié)局FOXA2+LMX1A+TH+多巴胺(DA)神經(jīng)元用于疾病建模特別是帕金森氏病的組合物和方法。此外，真正的DA神經(jīng)元富含標(biāo)記物，例如CD142和A9型神經(jīng)元細(xì)胞。
【專利說明】用于植入的中腦多己胺（DA)神經(jīng)元
[0001] 政府許巧權(quán)利
[0002] 本發(fā)明部分地在來自美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所OJnitedStates化tionalInstitute ofHealth,NIH)和國(guó)立神經(jīng)病學(xué)和中風(fēng)研究所（^tionalInstituteofNeurological disordersandStroke,NIND巧的NIH/NINDS資助金NS052671 和NIH/NINDS資助金 P50NS047085政府資助下作出。因此，美國(guó)政府對(duì)于本發(fā)明具有某些權(quán)利。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及多能或多潛能干細(xì)胞的譜系特異 性分化，上述多能或多潛能干細(xì)胞可W包括，但不限于，除了非胚胎人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 化iPSC)W外還有的人胚胎干細(xì)胞化ESC)、成體干細(xì)胞、來自患有疾病的患者的干細(xì)胞 或者任何能夠進(jìn)行譜系特異性分化的其它干細(xì)胞。具體描述了W下方法：引導(dǎo)hESC和/ 或hiPSC譜系特異性分化成底板中腦祖細(xì)胞，然后使用新的培養(yǎng)條件進(jìn)一步分化成大量 的中腦結(jié)局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神經(jīng)元。使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的中腦結(jié)局 FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神經(jīng)元進(jìn)一步預(yù)期用于多種用途，其包括，但不限于，在體外 藥物發(fā)現(xiàn)檢測(cè)中的用途、神經(jīng)學(xué)研究、W及作為患者多己胺神經(jīng)元的疾病逆轉(zhuǎn)或損傷或缺 乏的治療劑。而且，提供了從人多能干細(xì)胞分化中腦結(jié)局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神 經(jīng)元用于疾病建模特別是帕金森氏病的組合物和方法。此外，真正的DA神經(jīng)元富含標(biāo)記 物，例如CD142和A9型神經(jīng)元細(xì)胞。

【背景技術(shù)】
[0004] 保留分化成許多種特化細(xì)胞類型的能力的細(xì)胞群體可用于形成大量的譜系特異 性分化細(xì)胞群體。該些保留進(jìn)一步分化成特化細(xì)胞的能力的細(xì)胞群體含有多能細(xì)胞。多能 細(xì)胞可W來源自胚胎和/或非胚胎成體干細(xì)胞。
[0005] 該些譜系特異性分化的細(xì)胞群體預(yù)期應(yīng)用于具有導(dǎo)致特定細(xì)胞群體功能喪失的 疾病的患者的細(xì)胞置換療法中。除其直接治療價(jià)值W外，譜系特異性分化細(xì)胞還是許多種 用途的有價(jià)值的研究工具，其包括篩選檢測(cè)，W鑒定、確認(rèn)和測(cè)試功能特異性，或用于測(cè)試 治療分子的輸送，W治療細(xì)胞譜系特異性疾病。
[0006] 之前使用胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞作為神經(jīng)退行性疾病的治療劑和模型系統(tǒng)。有 關(guān)胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞定向分化的研究和技術(shù)發(fā)展已經(jīng)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CN巧疾病 領(lǐng)域中進(jìn)行，例如，用于亨廷頓氏舞蹈病、阿爾茨海默氏病、帕金森氏病和多發(fā)性硬化。但 是，該些研究的結(jié)果表明，該些細(xì)胞用于體內(nèi)使患者恢復(fù)神經(jīng)功能的能力幾乎沒有，而且常 常導(dǎo)致患者中不期望的腫瘤生長(zhǎng)。
[0007] 因此，對(duì)于獲得能夠既用于研究且用作治療導(dǎo)致具有特定功能的細(xì)胞喪失的疾病 的治療劑的細(xì)胞群體的組合物和方法存在有需求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明涉及干細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體地，涉及多能或多潛能干細(xì)胞的譜系特異 性分化，上述多能或多潛能干細(xì)胞可W包括，但不限于，除了非胚胎人誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 化iPSC)W外還有的人胚胎干細(xì)胞化ESC)、成體干細(xì)胞、來自患有疾病的患者的干細(xì)胞或 者任何能夠進(jìn)行譜系特異性分化的其它干細(xì)胞。
[0009] 具體描述了W下方法：引導(dǎo)hESC和/或hiPSC譜系特異性分化成底板中腦祖細(xì) 胞，然后使用新的培養(yǎng)條件進(jìn)一步分化成中腦結(jié)局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神經(jīng)元的 大群體。使用本發(fā)明的方法產(chǎn)生的中腦結(jié)局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神經(jīng)元進(jìn)一步 預(yù)期用于多種用途，其包括，但不限于，在體外藥物發(fā)現(xiàn)檢測(cè)中的用途、神經(jīng)學(xué)研究、W及作 為患者多己胺神經(jīng)元的疾病逆轉(zhuǎn)或損傷或缺乏的治療劑。而且，提供了從人多能干細(xì)胞分 化中腦結(jié)局FOXA化LMX1A+?+多己胺（DA)神經(jīng)元用于疾病建模特別是帕金森氏病的組合 物和方法。此外，真正的DA神經(jīng)元富含標(biāo)記物，例如CD142和A9型神經(jīng)元細(xì)胞。
[0010] 一種試劑盒，其包括第一信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、第二信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和第H信號(hào)傳 導(dǎo)抑制劑，其中所述第一抑制劑能夠降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子目（TGF目VActivin-Nodal(活 化素-結(jié)節(jié)蛋白）信號(hào)傳導(dǎo)，所述第二抑制劑能夠降低SMAD(SmallMothersAgainst Decapentaplegic)信號(hào)傳導(dǎo)，并且所述第H抑制劑能夠降低用于活化wingless(Wnt)信號(hào) 傳導(dǎo)的糖原合成酶激酶3目佑SK3目）。在一實(shí)施方式中，所述第一抑制劑是LDN-193189。 在其他實(shí)施方式中，所述第一抑制劑選自LDN-193189、其衍生物及其混合物。在一實(shí)施方 式中，所述第二抑制劑是SB431542。在其他實(shí)施方式中，所述第二抑制劑選自SB431542、其 衍生物及其混合物。在一實(shí)施方式中，所述第H抑制劑是CHIR99021。在其他實(shí)施方式中， 所述第H抑制劑選自CHIR99021、其衍生物及其混合物。在一實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一 步包括音酒因子（Sonichedgehog,SHH)信號(hào)傳導(dǎo)的激活劑和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)S 受體家族信號(hào)傳導(dǎo)的激活劑。在一實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包括腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子伽NF)、抗壞血酸（AA)、膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、二下醜CAMP和目3型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng) 因子。在一實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包括選自抗酪氨酸輕化酶（TH)、抗叉頭框蛋白 A2(anti-forldieadboxproteinA2,F0XA2)和抗LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子Ia(LMXlA)的抗 體。在一實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包括選自干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞 和工程細(xì)胞的細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包括用于分化祖細(xì)胞和中腦結(jié)局 F0XA2/LMX1A+多己胺（DA)神經(jīng)元的說明書。在一實(shí)施方式中，所述試劑盒進(jìn)一步包括從患 有帕金森氏?。≒D)的患者獲取細(xì)胞的說明書。
[0011] 一種組合物，其包括與第一信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和第二信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑接觸的細(xì)胞 群體，其中大于40%的所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2(F0XA2)是陽性的，其中所述細(xì) 胞群體預(yù)先與第一信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、第H信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑和音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激 活劑接觸，其中所述第一抑制劑能夠降低轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子目（TGFe)Activin-Nodal信 號(hào)傳導(dǎo)，所述第二抑制劑能夠降低用于活化wingless(Wnt)信號(hào)傳導(dǎo)的糖原合成酶激 酶3目（GSK3目）信號(hào)傳導(dǎo)，并且所述第H抑制劑能夠降低SMAD(SmallMothersAgainst Decapentaplegic)信號(hào)傳導(dǎo)。在一實(shí)施方式中，所述第一抑制劑是選自LDN-193189、其衍 生物及其混合物的小分子。在一實(shí)施方式中，所述第二抑制劑選自CHIR99021及其衍生物。 在一實(shí)施方式中，所述第H抑制劑選自SB431542、其衍生物及其混合物。在一實(shí)施方式中， 所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑選自音酒因子（SHH)C25II和平滑（SMO)受體小分子 激動(dòng)劑，其中所述激動(dòng)劑是purmo巧hamine。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體進(jìn)一步預(yù)先 與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF8)接觸。在一實(shí)施方式中，包括所述細(xì)胞群體的所述大多數(shù) 細(xì)胞是叉頭框蛋白A2 (F0XA2)+LIM+同源盒轉(zhuǎn)錄因子1+，a(LMXlA)，+NG肥+和DDC+底板中 腦祖細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體選自曬齒類動(dòng)物細(xì)胞、靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞和人細(xì) 胞。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞源自帕金森氏?。≒D)患者細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，所述細(xì) 胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2(F0XA2)是至少50%陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體對(duì) 于叉頭框蛋白A2是至少60%陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2 是至少70%陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2是至少80%陽性 的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2是至少90%陽性的。在一實(shí)施方式 中，所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2是至少95%至多100%陽性的。
[0012] 一種組合物，其包括體外細(xì)胞群體，其中包括所述細(xì)胞群體的大多數(shù)細(xì)胞是酪氨 酸輕化酶（TH) +叉頭框蛋白A2(F0XA。+LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1+，a(LMXlA) +底板中腦多己胺 (DA)神經(jīng)元。在一實(shí)施方式中，所述大于40%的所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元是酪氨酸 輕化酶陽性的Cffl+)。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體是至少50%酪氨酸輕化酶陽性的。在 一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體是至少60 %酪氨酸輕化酶陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞 群體是至少70 %酪氨酸輕化酶陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體是至少80 %酪氨酸 輕化酶陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體是至少90%酪氨酸輕化酶陽性的。在一實(shí) 施方式中，所述細(xì)胞群體是至少95%至多100%酪氨酸輕化酶陽性的。在一些實(shí)施方式中， 所述細(xì)胞群體包括大多數(shù)中腦結(jié)局F0XA2/LMX1A+多己胺（DA)神經(jīng)元。在一實(shí)施方式中， 所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元對(duì)于選自W下的標(biāo)記物是陽性的；核受體NURRl(NR4A2)、 神經(jīng)元特異性III類目-微管蛋白（Tujl)、TTF3、配對(duì)樣同源域3 (P]；TX3)、achaete-s州te 復(fù)合物（AS化)、早期B細(xì)胞因子UEBF-1)、早期B細(xì)胞因子3 (邸F-3)和轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白 (TTR)D在一實(shí)施方式中，所述中腦結(jié)局F0XA2/LMX1A+多己胺（DA)神經(jīng)元群體對(duì)于選自 DA、3, 4-二輕基-苯己酸值OPAC)和高香草酸化VA)的分子是陽性的。在一實(shí)施方式中，所 述標(biāo)記物選自蛋白質(zhì)和核酸。在一些實(shí)施方式中，所述中腦結(jié)局F0XA2/LMX1A+多己胺（DA) 神經(jīng)元群體能夠在選自帕金森?。≒D)患者的患者中體內(nèi)植入。在一實(shí)施方式中，所述中腦 結(jié)局F0XA2/LMX1A+多己胺（DA)神經(jīng)元能夠體內(nèi)植入，并提供多己胺（DA)神經(jīng)元功能。
[0013] 在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種組合物，其包括與LDN-193189和CHIR99021 接觸的細(xì)胞群體，其中大于40%的所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2(F0XA2)是陽性的， 并且其中所述細(xì)胞群體預(yù)先與LDN-193189、SB431542、音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑 和CHIR99021接觸。在一實(shí)施方式中，所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑選自音酒因子 (SHH)C25II和purmo巧hamine。在一實(shí)施方式中，所述大于10%的所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭 框蛋白A2(F0XA2)和LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1，a(LMXlA)是雙陽性的。在一實(shí)施方式中，所 述大多數(shù)的所述細(xì)胞群體是底板中腦祖細(xì)胞群體。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體預(yù)先與 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8(FGF8)接觸。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體選自曬齒類動(dòng)物細(xì)胞、 靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞和人細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，所述人細(xì)胞是來自具有帕金森氏?。≒D)神經(jīng) 系統(tǒng)癥狀的患者的細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體源自誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞（iPSC)。 在一實(shí)施方式中，大于10 %的所述細(xì)胞群體選自對(duì)于叉頭框蛋白A2 (F0XA2)/LIM同源盒轉(zhuǎn) 錄因子1，a(LMXlA)是雙陽性的，W及對(duì)于叉頭框蛋白A2(F0XA2)/cxrthodenticle同源盒 2(0TX2)是雙陽性的。
[0014] 在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化成底板中腦祖細(xì)胞群體的方 法，其包括，a)提供；i)細(xì)胞群體，其中所述細(xì)胞群體選自非胚胎干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘 導(dǎo)的非胚胎多能細(xì)胞和工程多能細(xì)胞；和ii)第一信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、第二信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、 音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑和第H信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，其中所述第一抑制劑能夠降低轉(zhuǎn) 化生長(zhǎng)因子目（TGF目VActivin-Nodal信號(hào)傳導(dǎo)，所述第二抑制劑能夠降低SMAD(Small MothersAgainstDecapentaplegic)信號(hào)傳導(dǎo)，并且所述第H抑制劑能夠降低用于活化 Wingless(Wnt)信號(hào)傳導(dǎo)的糖原合成酶激酶3目（GSK3目）信號(hào)傳導(dǎo)；b)使所述細(xì)胞群體與 所述第一抑制劑和所述第二抑制劑接觸，C)在使所述細(xì)胞群體與所述第一抑制劑和所述第 二抑制劑接觸之后，在使底板中腦祖細(xì)胞群體分化的條件下，進(jìn)一步使所述細(xì)胞與所述音 酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑接觸；和d)在使所述細(xì)胞群體與所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳 導(dǎo)激活劑接觸之后，進(jìn)一步使所述細(xì)胞與所述第H抑制劑接觸，W使所述細(xì)胞群體分化成 底板中腦祖細(xì)胞群體。在一實(shí)施方式中，與所述第一抑制劑和所述第二抑制劑的所述接觸 在能夠產(chǎn)生分化的底板中腦祖細(xì)胞群體的條件下進(jìn)行。在一實(shí)施方式中，與所述第一抑制 劑和所述第二抑制劑的所述接觸在將細(xì)胞體外鋪布的1小時(shí)內(nèi)發(fā)生。在一實(shí)施方式中，與 所述第一抑制劑和所述第二抑制劑的所述接觸在將細(xì)胞體外鋪布的48小時(shí)內(nèi)發(fā)生。在一 實(shí)施方式中，與所述第一抑制劑和所述第二抑制劑的所述接觸在將細(xì)胞體外鋪布的62小 時(shí)內(nèi)發(fā)生。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞與所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑的所述接觸 在能夠產(chǎn)生分化的底板中腦祖細(xì)胞群體的條件下進(jìn)行。在一實(shí)施方式中，在使所述細(xì)胞群 體與所述第一抑制劑和所述第二抑制劑接觸之后，所述細(xì)胞與所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳 導(dǎo)激活劑的所述接觸為至少24小時(shí)且至多36小時(shí)。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞與所述音 酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑的所述接觸為至多144小時(shí)。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞與 所述第H抑制劑的所述接觸在能夠產(chǎn)生分化的底板中腦祖細(xì)胞群體的條件下進(jìn)行。在一實(shí) 施方式中，在使所述細(xì)胞群體與所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑接觸之后，所述細(xì)胞 與所述第H抑制劑的所述接觸為至少24小時(shí)，至多36小時(shí)。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞與 所述第H抑制劑的所述接觸為至多192小時(shí)。在一實(shí)施方式中，在使所述細(xì)胞與所述第一 抑制劑和所述第二抑制劑接觸之后至少第11天，所述細(xì)胞群體分化成所述底板中腦祖細(xì) 胞。在一實(shí)施方式中，所述第一抑制劑是SB431542。在一實(shí)施方式中，所述第二抑制劑是 LDN-193189。在一實(shí)施方式中，所述第H抑制劑是CHIR99021。在一實(shí)施方式中，所述音酒 因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑選自音酒因子（SHH)C25II和purmo巧hamine。在一實(shí)施方式 中，所述方法進(jìn)一步提供成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子8 (FGF8)，并在能夠產(chǎn)生分化的底板中腦祖細(xì) 胞群體的條件下使細(xì)胞群體與所述FGW接觸。在一實(shí)施方式中，在使所述細(xì)胞群體與所述 第一抑制劑和所述第二抑制劑接觸之后，所述細(xì)胞與所述FGW的所述接觸為至少24小時(shí)， 至多36小時(shí)。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞與所述FGF8的所述接觸為至多144小時(shí)。在一 實(shí)施方式中，所述底板中腦祖細(xì)胞群體包括大于40 %的叉頭框蛋白A2 (F0XA2) +細(xì)胞。在一 實(shí)施方式中，所述底板中腦祖細(xì)胞群體包括大于40%的叉頭框蛋白A2 (F0XA2)+LIM同源盒 轉(zhuǎn)錄因子1，a(LMXlA)+細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括步驟e)使所述底板 中腦祖細(xì)胞群體與神經(jīng)元成熟培養(yǎng)基接觸，所述培養(yǎng)基包括N2培養(yǎng)基、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因 子炬DNF)、抗壞血酸（AA)、膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、二了醜cAMP(dbcAMP)和目3型 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，用于使底板中腦祖細(xì)胞分化成底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元。在一實(shí)施方式 中，所述方法進(jìn)一步包括步驟e)使所述底板中腦祖細(xì)胞群體與具有B27補(bǔ)充物的神經(jīng)元成 熟培養(yǎng)基接觸，用于使底板中腦祖細(xì)胞分化成底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元。在一實(shí)施方式 中，使與具有B27補(bǔ)充物的神經(jīng)基礎(chǔ)（neurobasal)培養(yǎng)基接觸的所述細(xì)胞與腦源性神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng)因子伽NF)、抗壞血酸（AA)、膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、二了醜cAMP(dbcAMP)和目3 型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子接觸，用于使底板中腦祖細(xì)胞分化成底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元。在一實(shí) 施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元為叉頭框蛋白A2(F0XA2)+LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子 1，a(LMXlA)+、核受體相關(guān)1蛋白（NURRl)+W及酪氨酸輕化酶（TH)+。在一實(shí)施方式中，大 于40%的所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元為酪氨酸輕化酶（TH)+。在一實(shí)施方式中，在使 所述細(xì)胞群體與所述第一抑制劑和所述第二抑制劑接觸之后至少第25天，分化出所述底 板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元群體。在一實(shí)施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元對(duì)于 鑒定一種分子的標(biāo)記物是陽性的。在一實(shí)施方式中，所述標(biāo)記物選自酪氨酸輕化酶（TH)、 叉頭框蛋白42(。0《42)^加同源盒轉(zhuǎn)錄因子1、多己胺、3,4-二輕基-苯己酸值0口4〇和高 香草酸（HVA)，a，核受體NURRl(NR4A2)、神經(jīng)元特異性III類目-微管蛋白（Tujl)、TTF3、 配對(duì)樣同源域3 (PITX3)、achaete-scute復(fù)合物（ASCL)、早期B細(xì)胞因子1巧BF-1)、早期B 細(xì)胞因子3巧BF-3)、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR)、突觸蛋白、多己胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT)和G蛋白偶 聯(lián)的內(nèi)向整流鐘通道化ir3.2/GI服2)。在一實(shí)施方式中，所述分子選自蛋白質(zhì)和核酸。在 一實(shí)施方式中，所述分子使用選自抗體、PCR引物、核酸序列的標(biāo)記物和酶檢測(cè)來鑒定。在 一實(shí)施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元能夠體內(nèi)植入到具有帕金森氏?。≒D)的 患者中，用于提供多己胺（DA)神經(jīng)元功能。在一實(shí)施方式中，所述方法進(jìn)一步包括，提供對(duì) 產(chǎn)生多己胺的神經(jīng)元有需求的患者，其中所述患者表現(xiàn)出至少一種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，W及將 底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元移植到所述患者中用于提供多己胺（DA)神經(jīng)元功能的步驟。 在一實(shí)施方式中，所述神經(jīng)系統(tǒng)癥狀選自震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩（活動(dòng)極為緩慢）、屈曲位、姿勢(shì)不 穩(wěn)和僵直。在一實(shí)施方式中，所述患者表現(xiàn)出至少一種所述神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的減少。在一實(shí) 施方式中，所述細(xì)胞選自曬齒類動(dòng)物細(xì)胞、靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞和人細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，所 述人細(xì)胞是來自具有帕金森氏?。≒D)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者的細(xì)胞。
[0015] 在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于治療性處理的體內(nèi)植入方法，其包括，a) 提供；i)底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元群體，其中大于40%的所述群體表達(dá)酪氨酸輕化 酶（TH);和ii)受試者，其中所述受試者表現(xiàn)出至少一種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；和b)在允許體 內(nèi)植入的條件下將所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元移植到所述受試者中，用于提供多己 胺（DA)神經(jīng)元功能。在一實(shí)施方式中，所述神經(jīng)系統(tǒng)癥狀選自震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩（活動(dòng)極為 緩慢）、屈曲位、姿勢(shì)不穩(wěn)和僵直。在一實(shí)施方式中，所述受試者表現(xiàn)出至少一種所述神經(jīng) 系統(tǒng)癥狀的減少。在一實(shí)施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元群體源自根據(jù)本發(fā) 明的方法處理的底板中腦祖細(xì)胞群體。在一實(shí)施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng) 元群體源自根據(jù)進(jìn)一步包括使底板中腦祖細(xì)胞群體與神經(jīng)元成熟培養(yǎng)基接觸的步驟的方 法處理的底板中腦祖細(xì)胞群體，所述培養(yǎng)基包括N2培養(yǎng)基、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子任DNF)、 抗壞血酸（AA)、膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、二下醜CAMP和目3型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，用于 使底板中腦祖細(xì)胞分化成底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元。在一實(shí)施方式中，所述底板中腦 祖細(xì)胞群體源自根據(jù)本發(fā)明的方法處理的細(xì)胞群體。在一實(shí)施方式中，所述底板中腦祖細(xì) 胞群體源自根據(jù)誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化成底板中腦祖細(xì)胞群體的方法處理的細(xì)胞群體，所述 方法包括；提供；i)細(xì)胞群體，其中所述細(xì)胞群體選自非胚胎干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)的 非胚胎多能細(xì)胞和工程多能細(xì)胞；和ii)第一信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、第二信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、音 酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑和第H信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，其中所述第一抑制劑能夠降低轉(zhuǎn) 化生長(zhǎng)因子目（TGF目）/Activin-Nodal信號(hào)傳導(dǎo)，所述第二抑制劑能夠降低SMAD(Small MothersAgainstDecapentaplegic)信號(hào)傳導(dǎo)，并且所述第H抑制劑能夠降低用于活化 Wingless(Wnt)信號(hào)傳導(dǎo)的糖原合成酶激酶3目（GSK3目）信號(hào)傳導(dǎo)；b)使所述細(xì)胞群體與 所述第一抑制劑和所述第二抑制劑接觸，C)在使所述細(xì)胞群體與所述第一抑制劑和所述第 二抑制劑接觸之后，在使底板中腦祖細(xì)胞群體分化的條件下，進(jìn)一步使所述細(xì)胞與所述音 酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑接觸；和d)在使所述細(xì)胞群體與所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳 導(dǎo)激活劑接觸之后，進(jìn)一步使所述細(xì)胞與所述第H抑制劑接觸，W使所述細(xì)胞群體分化成 底板中腦祖細(xì)胞群體。在一實(shí)施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元群體源自選自動(dòng) 物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物和人的細(xì)胞群體。在一實(shí)施方式中，所述人細(xì)胞是來自具有帕金森氏?。≒D) 癥狀的患者的細(xì)胞。
[0016] 在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種組合物，其包括與LDN-193189和CHIR99021接 觸的細(xì)胞群體，其中大于40%的所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2(F0XA2)是陽性的，并 且其中所述細(xì)胞群體預(yù)先與LDN-193189、SB431542、音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑和 CHIR99021接觸，其中所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑選自音酒因子（SHH)C25II和 purmo巧hamine。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2(F0XA2)是至少50% 陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2是至少60%陽性的。在一實(shí) 施方式中，所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2是至少70%陽性的。在一實(shí)施方式中，所述 細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2是至少80%陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體對(duì)于叉 頭框蛋白A2是至少90%陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2是 至少95%至多100%陽性的。在一實(shí)施方式中，大于10%的所述細(xì)胞群體選自對(duì)于叉頭 框蛋白A2(F0XA2)/LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1，a(LMXlA)是雙陽性的，W及對(duì)于叉頭框蛋白 A2(F0XA2)/odhodenticle同源盒2(0TX2)是雙陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體是 至少 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、至少95%至多100%陽性的。在一實(shí) 施方式中，至少20%的所述細(xì)胞群體對(duì)于選自伽口'1+、〔0142、0〔5]?1、〔063和〔099的標(biāo)記 物是陽性的。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體是至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、 90%、至少95%至多100%陽性的。在一些實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體是至少50%、60%、 70%、80%、90%、至少95%至多100%陽性的。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞群體選自曬齒類 動(dòng)物細(xì)胞、靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞、人細(xì)胞和來自具有帕金森氏?。≒D)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者的人 細(xì)胞。
[0017] 在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化成底板中腦祖細(xì)胞群體的方 法，其包括，a)提供：i)細(xì)胞群體，其中所述細(xì)胞群體選自非胚胎干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo) 的非胚胎多能細(xì)胞和工程多能細(xì)胞；和ii)第一信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、第二信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、音 酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑和第H信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，其中所述第一抑制劑是SB431542， 所述第二抑制劑是LDN-193189,所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑選自音酒因子（SHH) C25II和purmo巧hamine，并且所述第H抑制劑是CHIR99021 ;b)使所述細(xì)胞群體與所述第 一抑制劑和所述第二抑制劑接觸，其中與所述第一抑制劑和所述第二抑制劑的所述接觸在 能夠產(chǎn)生分化的底板中腦祖細(xì)胞群體的條件下進(jìn)行，使得與所述第一抑制劑和所述第二抑 制劑的所述接觸在將細(xì)胞體外鋪布的48小時(shí)內(nèi)發(fā)生，C)在使所述細(xì)胞群體與所述第一抑 制劑和所述第二抑制劑接觸之后，在使底板中腦祖細(xì)胞群體分化的條件下，進(jìn)一步使所述 細(xì)胞與所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑接觸；和d)在使所述細(xì)胞群體與所述音酒因子 (SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑接觸之后，進(jìn)一步使所述細(xì)胞與所述第H抑制劑接觸，W使所述細(xì)胞 群體分化成底板中腦祖細(xì)胞群體。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞與所述音酒因子（SHH)信號(hào) 傳導(dǎo)激活劑的接觸在能夠產(chǎn)生分化的底板中腦祖細(xì)胞群體的條件下進(jìn)行，使得在使所述細(xì) 胞群體與所述第一抑制劑和所述第二抑制劑接觸之后，所述細(xì)胞與所述音酒因子（SHH)信 號(hào)傳導(dǎo)激活劑的所述接觸為至少24小時(shí)且至多36小時(shí)。在一實(shí)施方式中，所述細(xì)胞與所述 第H抑制劑的接觸在能夠產(chǎn)生分化的底板中腦祖細(xì)胞群體的條件下進(jìn)行，使得在使所述細(xì) 胞群體與所述音酒因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑接觸之后，所述細(xì)胞與所述第H抑制劑的接 觸為至少24小時(shí)且至多36小時(shí)。在一實(shí)施方式中，底板中腦祖細(xì)胞群體包括大于40%的叉 頭框蛋白A2(FOXA2)+LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1+，a(LMXlA) +細(xì)胞。在一實(shí)施方式中，該方法進(jìn) 一步包括步驟e)使所述底板中腦祖細(xì)胞群體與神經(jīng)元成熟培養(yǎng)基接觸，所述培養(yǎng)基包括 N2培養(yǎng)基、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子炬DNF)、抗壞血酸（AA)、膠質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、二 了醜cAMP和目3型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，用于使底板中腦祖細(xì)胞分化成底板中腦多己胺（DA)神 經(jīng)元。在一實(shí)施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元對(duì)于選自叉頭框蛋白A2(FOXA2)/ LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1a(LMXlA) /酪氨酸輕化酶（TH);叉頭框蛋白A2/LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子 1a/酪氨酸輕化酶/CD142 ;叉頭框蛋白A2/LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1a/酪氨酸輕化酶/核 受體相關(guān)1蛋白（NURRl);叉頭框蛋白A2/LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子Ia/酪氨酸輕化酶/CD142/ 核受體相關(guān)1蛋白和酪氨酸輕化酶/a-突觸核蛋白的標(biāo)記物組是陽性的。在一實(shí)施方式 中，所述方法進(jìn)一步包括步驟f)將用于CD142表達(dá)的所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元分 選成對(duì)于CD142至少80%陽性的細(xì)胞群體。在一實(shí)施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神 經(jīng)元對(duì)于鑒定一種分子的標(biāo)記物是陽性的，所述標(biāo)記物選自；酪氨酸輕化酶（TH)、叉頭框 蛋白42(。0《42)^加同源盒轉(zhuǎn)錄因子1、多己胺、3,4-二輕基-苯己酸值0口4〇和高香草酸 (HVA)，a，核受體NURRl(NR4A2)、神經(jīng)元特異性III類目-微管蛋白（Tujl)、TTF3、配對(duì)樣 同源域3 (PITX3)、achaete-scute復(fù)合物（ASCL)、早期B細(xì)胞因子1巧8。-1)、早期B細(xì)胞因 子3巧BF-3)、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白（TTR)、突觸蛋白、多己胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT)和G蛋白偶聯(lián)的內(nèi) 向整流鐘通道化ir3. 2/GI服2)、CD142、DCSM1、CD63和CD99。在一實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一 步包括，提供對(duì)產(chǎn)生多己胺的神經(jīng)元有需求的患者，W及在e)之后的步驟，通過移植用于 提供多己胺（DA)神經(jīng)元功能的所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元治療所述患者。在一實(shí)施 方式中，所述患者包括至少一種選自震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩（活動(dòng)極為緩慢）、屈曲位、姿勢(shì)不穩(wěn)和 僵直的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。在一實(shí)施方式中，觀察到所述患者具有至少一種選自震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩 (活動(dòng)極為緩慢）、屈曲位、姿勢(shì)不穩(wěn)和僵直的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。在一實(shí)施方式中，所述患者表 現(xiàn)出至少一種所述神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的減少。
[0018] 在一實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種用于治療性處理的體內(nèi)植入方法，其包括，a) 提供；i)底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元群體，其中大于40%的所述群體表達(dá)酪氨酸輕化酶 (TH);和1〇受試者，其中所述受試者表現(xiàn)出至少一種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)癥 狀選自震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩（活動(dòng)極為緩慢）、屈曲位、姿勢(shì)不穩(wěn)和僵直；和b)在允許體內(nèi)植入 的條件下將所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元移植到所述受試者中，用于提供多己胺（DA) 神經(jīng)元功能。在一實(shí)施方式中，所述受試者表現(xiàn)出至少一種所述神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的減少。在一 實(shí)施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元群體源自進(jìn)一步包括W下步驟的細(xì)胞群體： 將用于CD142表達(dá)的所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元分選成對(duì)于CD142為至少80%陽性 的細(xì)胞群體。在一實(shí)施方式中，所述底板中腦多己胺值A(chǔ))神經(jīng)元群體源自在W下步驟之后 的底板中腦祖細(xì)胞群體；將用于CD142表達(dá)的所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元分選成對(duì)于 CD142為至少80%陽性的細(xì)胞群體。在一實(shí)施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元群 體源自選自動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、人和具有帕金森氏病（PD)癥狀的患者的細(xì)胞群體。在一實(shí) 施方式中，所述底板中腦多己胺（DA)神經(jīng)元群體源自分離自動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、人和具有 帕金森氏?。≒D)癥狀的患者的細(xì)胞群體。
[001引 定父
[0020] 如本文所用，術(shù)語"疾病建模"是指使用實(shí)驗(yàn)有機(jī)體或體外細(xì)胞培養(yǎng)物來模擬由于 疾病的原因在人體中觀察到的特定病征或癥狀的過程。在一實(shí)施方式中，可W將源自具有 導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如帕金森氏?。≒D)的基因突變的動(dòng)物模型的多能干細(xì)胞培養(yǎng)并分化 成神經(jīng)細(xì)胞，用于鑒定與PD有關(guān)的神經(jīng)元的新的特征。在一實(shí)施方式中，可W將源自具有 導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)疾病例如帕金森氏?。≒D)的基因突變的人的人多能干細(xì)胞培養(yǎng)并分化成攜 帶有在人類觀察到的類似缺陷的神經(jīng)細(xì)胞。
[0021] 如本文所用，術(shù)語"帕金森病（parkinsonism)"是指一組均與基底神經(jīng)節(jié)（其 是大腦中控制運(yùn)動(dòng)的部分）中多己胺不足有關(guān)的疾病。癥狀包括震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩（活動(dòng) 極為緩慢）、屈曲位、姿勢(shì)不穩(wěn)和僵直。帕金森病的診斷要求存在有該些癥狀中的至少兩 種，其中之一必須為震顫或運(yùn)動(dòng)徐緩。帕金森病最常見的形式是特發(fā)性或典型帕金森氏病 (PD),但是對(duì)顯著少數(shù)的診斷來說，大約為總數(shù)的15%，可W存在有帕金森氏疊加綜合癥 (Parkinson's plus syn化omes，PP巧之一。該些綜合癥也稱作非典型帕金森病，其包括皮 質(zhì)基底核退化癥（corticobasal degeneration)、路易體癡呆癥（Lewy body dementia)、多 系統(tǒng)萎縮癥（multiple systematro地y)和進(jìn)行性核上性麻瘍。通常，帕金森氏病牽涉到主 要在稱作黑質(zhì)（substantia nigra)的大腦區(qū)域中在腦中的重要神經(jīng)細(xì)胞的功能障礙和死 亡。許多該些重要神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生多己胺，當(dāng)該些神經(jīng)元相繼死亡時(shí)，腦中由分化產(chǎn)生的多己 胺的量下降，使人不能正常控制運(yùn)動(dòng)。腸也具有在帕金森氏病患者中退化的多己胺細(xì)胞，該 可W是作為疾病一部分的胃腸道癥狀中的重要致病因素。個(gè)體經(jīng)歷的癥狀群因人而異。帕 金森氏病的主要運(yùn)動(dòng)病征包括W下：手、臂、腿、下頒和面部的震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩或運(yùn)動(dòng)緩慢、 肢體和軀干的僵直或僵硬W及姿勢(shì)不穩(wěn)或者平衡和協(xié)調(diào)受損。
[0022] 如本文所用，術(shù)語"受試者"是指要成為特定治療包括任何類型對(duì)照的受者的哺乳 動(dòng)物（人和動(dòng)物（即非人的動(dòng)物））。通常，術(shù)語"受試者"和"患者"在本文中指代人受試 者時(shí)可互換使用。
[0023] 如本文所用，術(shù)語"非人動(dòng)物"是指所有非人的動(dòng)物，其包括，但不限于，脊椎動(dòng)物， 例如曬齒類動(dòng)物、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、牛、反白動(dòng)物、兔類動(dòng)物、豬、山羊、馬、犬、貓、鳥類 等。
[0024] 如本文所用，術(shù)語"多己胺"是指由傳遞信息至含有控制運(yùn)動(dòng)和協(xié)調(diào)的神經(jīng)元的大 腦部分的多己胺神經(jīng)元所制造的化合物。
[002引如本文所用，術(shù)語"LSB"是指兩種化合物L(fēng)DN-193189和雄431542的組合，其能 夠降低或阻斷由細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子目（TGF目VActivin-Nodal信號(hào)傳導(dǎo)和SMAD(Small MothersAgainstDecapentaplegic)信號(hào)傳導(dǎo)組成的信號(hào)傳導(dǎo)。
[0026] 如本文所用，術(shù)語"SB431542"是指能夠降低或阻斷轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子目（TGFP)/ Activin-Nodal信號(hào)傳導(dǎo)的分子，其編號(hào)為CAS301836-41-9,分子式為C22H18N4O3,名稱為 4- [4- (1，3-苯并二氧戊環(huán)-5-基）-5- (2-化巧基）-IH-咪哇-2-基]-苯醜胺，例如，參見 W下結(jié)構(gòu)式：
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種組合物，其包括與LDN-193189和CHIR99021接觸的細(xì)胞群體，其中大于40% 的所述細(xì)胞群體對(duì)于叉頭框蛋白A2(FOXA2)是陽性的，并且其中所述細(xì)胞群體預(yù)先與 LDN-193189、SB431542、音猬因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑和CHIR99021接觸，其中所述音猬 因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑選自音猬因子（SHH)C25II和purmorphamine。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中大于10%的所述細(xì)胞群體選自對(duì)于叉頭框 蛋白A2(F0XA2)/LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1，a(LMX1A)是雙陽性的，以及對(duì)于叉頭框蛋白 A2(F0XA2)/orthodenticle同源盒 2 (0TX2)是雙陽性的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中至少20%的所述細(xì)胞群體對(duì)于選自Nurrl+、 CD142、DCSM1、CD63和CD99的標(biāo)記物是陽性的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其中所述細(xì)胞群體選自嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞、靈長(zhǎng)類動(dòng) 物細(xì)胞、人細(xì)胞和來自具有帕金森氏?。≒D)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者的人細(xì)胞。
5. -種誘導(dǎo)細(xì)胞定向分化成底板中腦祖細(xì)胞群體的方法，包括， a) 提供： i) 細(xì)胞群體，其中所述細(xì)胞群體選自非胚胎干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞、誘導(dǎo)的非胚胎多能細(xì) 胞和工程多能細(xì)胞；和 ii) 第一信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、第二信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑、音猬因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑和第 三信號(hào)傳導(dǎo)抑制劑，其中所述第一抑制劑是SB431542,所述第二抑制劑是LDN-193189,所 述音猬因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑選自音猬因子（SHH)C25II和purmorphamine，并且所述 第三抑制劑是CHIR99021 ; b) 使所述細(xì)胞群體與所述第一抑制劑和所述第二抑制劑接觸，其中與所述第一抑制劑 和所述第二抑制劑的所述接觸在能夠產(chǎn)生所述分化的底板中腦祖細(xì)胞群體的條件下進(jìn)行， 使得與所述第一抑制劑和所述第二抑制劑的所述接觸在將細(xì)胞體外鋪布的48小時(shí)內(nèi)發(fā) 生， c) 在使所述細(xì)胞群體與所述第一抑制劑和所述第二抑制劑接觸之后，在使底板中腦祖 細(xì)胞群體分化的條件下，進(jìn)一步使所述細(xì)胞與所述音猬因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑接觸； 和 d) 在使所述細(xì)胞群體與所述音猬因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑接觸之后，進(jìn)一步使所述 細(xì)胞與所述第三抑制劑接觸，以使所述細(xì)胞群體分化成底板中腦祖細(xì)胞群體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞與所述音猬因子（SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑 的所述接觸在能夠產(chǎn)生所述分化的底板中腦祖細(xì)胞群體的條件下進(jìn)行，使得在使所述細(xì)胞 群體與所述第一抑制劑和所述第二抑制劑接觸之后，所述細(xì)胞與所述音猬因子（SHH)信號(hào) 傳導(dǎo)激活劑的所述接觸為至少24小時(shí)且至多36小時(shí)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述細(xì)胞與所述第三抑制劑的所述接觸在能夠產(chǎn) 生所述分化的底板中腦祖細(xì)胞群體的條件下進(jìn)行，使得在使所述細(xì)胞群體與所述音猬因子 (SHH)信號(hào)傳導(dǎo)激活劑接觸之后，所述細(xì)胞與所述第三抑制劑的所述接觸為至少24小時(shí)且 至多36小時(shí)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述底板中腦祖細(xì)胞群體包括大于40%的叉頭框 蛋白A2(F0XA2)+UM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1，a(LMX1A)+細(xì)胞。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，還包括步驟e)使所述底板中腦祖細(xì)胞群體與神經(jīng)元成 熟培養(yǎng)基接觸，所述培養(yǎng)基包括N2培養(yǎng)基、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF)、抗壞血酸（AA)、膠 質(zhì)細(xì)胞系源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、二丁酰cAMP和0 3型轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子，用于使底板中腦祖細(xì)胞 分化成底板中腦多巴胺（DA)神經(jīng)元。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述底板中腦多巴胺（DA)神經(jīng)元對(duì)于選自叉頭 框蛋白A2(FOXA2)/LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1a(LMX1A)/酪氨酸羥化酶（TH);叉頭框蛋白A2/ LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1a/酪氨酸羥化酶/CD142 ;叉頭框蛋白A2/LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1a/ 酪氨酸羥化酶/核受體相關(guān)1蛋白（NURR1);叉頭框蛋白A2/LIM同源盒轉(zhuǎn)錄因子1a/酪 氨酸羥化酶/CD142/核受體相關(guān)1蛋白和酪氨酸羥化酶/a-突觸核蛋白的標(biāo)記物組是陽 性的。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，還包括步驟f)將所述底板中腦多巴胺（DA)神經(jīng)元對(duì) 于⑶142表達(dá)分選成對(duì)于⑶142至少80%陽性的細(xì)胞群體。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述底板中腦多巴胺（DA)神經(jīng)元對(duì)于鑒定一種 分子的標(biāo)記物是陽性的，所述標(biāo)記物選自：酪氨酸羥化酶（TH)、叉頭框蛋白A2(FOXA2)、LIM 同源盒轉(zhuǎn)錄因子1、多巴胺、3,4-二羥基-苯乙酸（00?4〇和高香草酸（爪^)，〇，核受體 NURR1 (NR4A2)、神經(jīng)元特異性III類0 -微管蛋白（Tujl)、TTF3、配對(duì)樣同源域3(PITX3)、 achaete-scute復(fù)合物（ASCL)、早期B細(xì)胞因子1 (EBF-1)、早期B細(xì)胞因子3(EBF_3)、轉(zhuǎn) 甲狀腺素蛋白（TTR)、突觸蛋白、多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（DAT)和G蛋白偶聯(lián)的內(nèi)向整流鉀通道 (Kir3. 2/GIRK2)、CD142、DCSM1、CD63 和CD99。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，還包括，提供對(duì)產(chǎn)生多巴胺的神經(jīng)元有需求的患者， 以及在e)之后的步驟，通過移植用于提供多巴胺（DA)神經(jīng)元功能的所述底板中腦多巴胺 (DA)神經(jīng)元來治療所述患者。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述患者包括至少一種選自震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩（活 動(dòng)極為緩慢）、屈曲位、姿勢(shì)不穩(wěn)和僵直的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法，其中所述患者表現(xiàn)出至少一種所述神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的 減少。
16. -種用于治療性處理的體內(nèi)植入方法，包括， a) 提供： i) 底板中腦多巴胺（DA)神經(jīng)元群體，其中大于40 %的所述群體表達(dá)酪氨酸羥化酶 (TH);和 ii) 受試者，其中所述受試者表現(xiàn)出至少一種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，其中所述神經(jīng)系統(tǒng)癥狀選 自震顫、運(yùn)動(dòng)徐緩（活動(dòng)極為緩慢）、屈曲位、姿勢(shì)不穩(wěn)和僵直；和 b) 在允許體內(nèi)植入的條件下將所述底板中腦多巴胺（DA)神經(jīng)元移植到所述受試者 中，用于提供多巴胺（DA)神經(jīng)元功能。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述受試者表現(xiàn)出至少一種所述神經(jīng)系統(tǒng)癥狀 的減少。
18. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述底板中腦多巴胺（DA)神經(jīng)元群體源自根據(jù) 權(quán)利要求11所述進(jìn)行處理的細(xì)胞群體。
19. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述底板中腦多巴胺（DA)神經(jīng)元群體源自底 板中腦祖細(xì)胞群體，所述底板中腦祖細(xì)胞群體源自根據(jù)權(quán)利要求9所述進(jìn)行處理的細(xì)胞群 體。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述底板中腦多巴胺（DA)神經(jīng)元群體源自選自 動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、人和具有帕金森氏?。≒D)癥狀的患者的細(xì)胞群體。
【文檔編號(hào)】C12N5/074GK104379731SQ201280066145
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2012年11月2日 優(yōu)先權(quán)日:2011年11月4日
【發(fā)明者】L·施圖德, J-W·沈, S·克里克斯 申請(qǐng)人:紀(jì)念斯隆-凱特琳癌癥中心