專利名稱：治療帕金森氏病和腦多巴胺能神經(jīng)元的其它病癥的方法
治療帕金森氏病和腦多巴胺能神經(jīng)元的其它病癥的方法發(fā)明背景發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及通過將治療用神經(jīng)生長因子施用到哺乳動物腦中來治療神經(jīng)變性疾病諸如帕金森氏病的方法。
背景技術(shù)：
帕金森氏病是常見的神經(jīng)變性病癥，臨床特征為運(yùn)動過慢、僵硬、震顫和步態(tài)異常，而病理特征為黑質(zhì)致密部(黑質(zhì))多巴胺神經(jīng)元的變性和投射到(projection to)紋狀體(包括殼核)。目前的療法為大部分患者，尤其是處于早期階段的患者提供令人滿意的疾病控制。然而，沒有治療保護(hù)免受這些神經(jīng)元的繼續(xù)變性，并且，隨著時間的推移，所有療法均失敗。 例如，慢性左旋多巴治療伴隨有運(yùn)動并發(fā)癥，不能潛在地控制失能特征諸如跌倒和癡呆，而且無法防止疾病發(fā)展。Olanow等，Neurology 72: suppl4: SI - S136 (2009)。因此，迫切需要提高臨床疾病控制和減緩發(fā)展的更有效的治療。神經(jīng)營養(yǎng)因子可能提高神經(jīng)元功能并保護(hù)免受神經(jīng)變性。膠質(zhì)細(xì)胞衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)在體外和帕金森氏病的動物模型中保護(hù)多巴胺神經(jīng)元。Lin等，Science260:1130-1132(1993)和 Gash 等，Nature 380:252255(1996)。神經(jīng)秩蛋白(Neurturin)(NRTN)是天然存在的GDNF的結(jié)構(gòu)和功能類似物(Kotzbauer等,Nature 384:467 -470 (1996)),其已被證明在年老的猴子中提高多巴胺能活性(Herzog等，Mov Disord22:1124 - 1132(2007))并在帕金森氏病的動物模型中保護(hù)多巴胺神經(jīng)元。Horger等，JNeurosci 18:4929 - 4937(1998) ;Gasmi 等，Neurobiol Dis 27:67 - 76(2007) ；Gasmi等，Mol Ther 15:62-68(2007);和 Kordower 等，Ann Neurol60:706715 (2006)。然而，神經(jīng)營養(yǎng)因子作為治療用于神經(jīng)變性疾病已經(jīng)被證明極其困難，大部分是由于妨礙將足夠和持續(xù)水平的蛋白質(zhì)靶向遞送到變性的神經(jīng)元的障礙。隨后的開放性標(biāo)記試驗的結(jié)果顯示將GDNF連續(xù)輸注到患有晚期帕金森氏病的患者的殼核中的益處。Gill等，NatMed 9:589 - 595 (2003)和 Slevin 等，JNeurosurg 102:216222(2005)。然而，這些結(jié)果并未在雙盲研究中得到證實，(Nutt等，Neurology60:69-73 (2003)和Lang等，AnnNeurol 59:459 - 466 (2006))，可能是由于營養(yǎng)因子沒有充分分布在目標(biāo)區(qū)域中。Kordower等,Ann Neurol46:419 - 424(1999)和 Salvatore 等,Exp Neurol 202:497 - 505 (2006)。然而,蛋白質(zhì)輸注(protein infusion),尤其是基因遞送,具有在一個外科手術(shù)中提供治療用蛋白質(zhì)擴(kuò)散分布和持久表達(dá)的潛力。腺相關(guān)2型(AAV2)-神經(jīng)秩蛋白是已經(jīng)遺傳改造成表達(dá)和分泌神經(jīng)秩蛋白人基因的載體。Gasmi等，Mol Ther 15:62 - 68(2007)。AAV2載體并不誘發(fā)炎性反應(yīng)，已被安全地用于臨床試驗，并且提供持久的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。Bankiewicz等，Mol Ther 14:564 - 570 (2006) 在患有晚期帕金森氏病的患者中雙側(cè)趨實體殼核內(nèi)注射(bilateral stereotactic intraputaminal injection)AAV2-神經(jīng)秩蛋白的開放性標(biāo)記、12個月I期試驗顯示，治療是安全的、耐受性良好，并且伴隨運(yùn)動功能的益處。MarksJr 等,Lancet Neuro17:400 - 408 (2008)。然而，在2期試驗中治療的療效并沒有充分實現(xiàn)療法的希望，因為就所有主要目標(biāo)而言，沒有以統(tǒng)計學(xué)上顯著的程度超過安慰劑反應(yīng)。因此，仍然迫切需要針對帕金森氏病的臨床上有效的基因療法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供臨床有用的系統(tǒng)和方案，將神經(jīng)生長因子遞送到哺乳動物腦中。本發(fā)明尤其用于治療靈長類動物的神經(jīng)變性狀況，在所述靈長類動物中，根據(jù)本發(fā)明遞送的神經(jīng)生長因子刺激神經(jīng)元生長和神經(jīng)功能恢復(fù)。在一個方面中，本發(fā)明包括將治療用神經(jīng)生長因子遞送到人對象腦中的目標(biāo)缺陷型、患病或受損的多巴胺能神經(jīng)元諸如在帕金森氏病中損傷的那些中的方法。該方法包括直接將神經(jīng)生長因子、編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體遞送或者將含有這種表達(dá)載體的供體細(xì)胞移植到黑質(zhì)中，優(yōu)選還到紋狀體中，以改善響應(yīng)神經(jīng)生長因子的缺陷、疾病或損傷。在 一個實施方式中，紋狀體遞送是向殼核的至少一個區(qū)域中。在各種實施方式中，遞送到紋狀體的編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體的總單位劑量大于遞送到黑質(zhì)中的編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體的單位劑量。例如，遞送到殼核的單位劑量可以高達(dá)遞送到黑質(zhì)的單位劑量的3、4、5、6、7、8或9倍。在一些實施方式中，疾病通過刺激多巴胺能神經(jīng)元的修復(fù)或活性而得以改善。在相關(guān)實施方式中，疾病通過恢復(fù)帕金森氏病伴隨的運(yùn)動功能缺陷而得以改善。在一些實施方式中，神經(jīng)生長因子是⑶NF家族分子；例如，⑶NF、神經(jīng)秩蛋白、persephin 或 artemin。在進(jìn)一步的實施方式中，用于將神經(jīng)生長因子遞送到細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的重組表達(dá)載體是AAV載體。
附圖
簡介圖I提供AAV2-神經(jīng)秩蛋白重組表達(dá)載體的圖示。在載體基因組中，AAV2ITR在NTN表達(dá)盒的側(cè)翼，所述NTN表達(dá)盒由CAG啟動子、前原神經(jīng)生長因子-NTN雜交cDNA(pre-pro-NGF-NTN hybrid cDNA)和人生長激素基因多腺苷酸化信號組成。顯示了源自NGF前域的規(guī)范RXXR序列的位置和切割位點。發(fā)明詳述一般說明盡管本文使用了特定術(shù)語，但它們僅在一般性和描述性的意義上被使用，而不是為了限制的目的。除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語具有與當(dāng)前描述的主題所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。為了本說明書和所述權(quán)利要求書的目的，除非另有說明，所有表示量、大小、尺寸、比例、形狀、配方、參數(shù)、百分比、參數(shù)、數(shù)量、特性的數(shù)字和本說明書和權(quán)利要求書中使用的其它數(shù)值均將理解為在所有情況下均被術(shù)語“約”修飾，即使術(shù)語“約”可能沒有與值、量或范圍明確出現(xiàn)。因此，除非有相反說明，以下說明書和所附權(quán)利要求書中闡述的數(shù)字參數(shù)不是并且不需要是精確的，但是，基于本公開主題請求獲得的期望性能，可以根據(jù)需要是近似的和/或更大或更小的，反映公差、換算因子、四舍五入、測量誤差等以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。例如，當(dāng)指值時，術(shù)語“約”可意為包括指定量的以下變化在一些實施方式中，±100%;在一些實施方式中，±50%;在一些實施方式中，±20%;在一些實施方式中，±10%;在一些實施方式中，±5%;在一些實施方式中，±1%;在一些實施方式中，±0. 5% ;和在一些實施方式中，±0. 1%，因為這些變化適當(dāng)執(zhí)行公開的方法或應(yīng)用公開的組合物。此外，當(dāng)結(jié)合一個或多個數(shù)字或數(shù)字范圍使用時，術(shù)語“約”應(yīng)該理解為是指所有這些數(shù)字，包括范圍內(nèi)的所有數(shù)字，并且通過將界限延伸到所闡述數(shù)值之上和之下來修改該范圍。借助端點對數(shù)字范圍的敘述包括在該范圍包含的所有數(shù)字，例如全部整數(shù)，包括其分?jǐn)?shù)(例如，I到5的敘述包括1、2、3、4和5以及其分?jǐn)?shù)，例如I. 5,2. 25,3. 75,4. I等等)和該范圍內(nèi)的任何范圍。發(fā)明概述本發(fā)明是基于這樣的發(fā)現(xiàn)S卩，將神經(jīng)生長因子遞送至神經(jīng)元損害的大腦深處，諸 如帕金森氏病(人)大腦的黑質(zhì)中，可以使變性的神經(jīng)元增強(qiáng)。本發(fā)明提供有效的方法來克服迄今為止未被認(rèn)識的沿晚期帕金森氏病(人)黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元軸突運(yùn)輸?shù)娜毕?，其通過限制暴露于胞體的蛋白質(zhì)出乎意料地降低遞送的神經(jīng)生長因子的生物活性。這提供對目標(biāo)特異性組織的了解，以確保實現(xiàn)最大益處。更具體而言，在測試AAV2-神經(jīng)秩蛋白基因療法在患有晚期帕金森氏病的患者中的療效和安全性的2期臨床試驗過程中，兩個治療的患者死于不相關(guān)的事件，從而能夠以尸體解剖分析治療后腦組織。這兩個病例均接收了在背腹平面中以4mm間隔開的4次大丸劑殼核內(nèi)注射。在所有檢查的半球中均鑒定神經(jīng)秩蛋白-免疫標(biāo)記。利用兩種不同的方法獨立地進(jìn)行定量容積分析，每一種方法均顯示，殼核的平均覆蓋率大約15%，其中在半球之間存在一些差異。在神經(jīng)秩蛋白免疫標(biāo)記最密集的區(qū)域中，可以觀察到酪氨酸羥化酶(TH)-免疫反應(yīng)纖維的增加。然而，這些纖維常常完全包含在神經(jīng)秩蛋白信號范圍內(nèi)。與所有以動物進(jìn)行的現(xiàn)有研究形成對比，既沒有神經(jīng)秩蛋白從紋狀體逆向運(yùn)輸?shù)胶谫|(zhì)的明確證據(jù)，也沒有在黑質(zhì)中TH誘導(dǎo)的證據(jù)。這些數(shù)據(jù)要求本發(fā)明提供的帕金森氏病基因療法的不同方法。在描述本發(fā)明方法和方法學(xué)之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明并不限于描述的具體方法，因為這些方法可以變化。還應(yīng)該理解，本文使用的術(shù)語僅用于描述具體實施方式
的目的，而并不意圖是限制性的，因此本發(fā)明的范圍將僅在所附權(quán)利要求書中進(jìn)行限制。目標(biāo)組織。本發(fā)明鑒定和定義了利用神經(jīng)生長因子成功再生腦中神經(jīng)元，尤其是其在黑質(zhì)中的丟失與神經(jīng)變性狀況諸如帕金森氏病有關(guān)的神經(jīng)元的方法需要的參數(shù)。本發(fā)明定義的第一方法參數(shù)是選擇合適的目標(biāo)組織。選擇對神經(jīng)營養(yǎng)因子保持響應(yīng)的腦區(qū)域。在人類中，保持響應(yīng)神經(jīng)營養(yǎng)因子到成年期的CNS神經(jīng)元包括膽堿能基底前腦神經(jīng)元、黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元、紋狀體區(qū)域、殼核、內(nèi)嗅皮質(zhì)神經(jīng)元、丘腦神經(jīng)元、基因座控制區(qū)神經(jīng)元、脊感覺神經(jīng)元和脊運(yùn)動神經(jīng)元。黑質(zhì)神經(jīng)元功能的喪失原因與帕金森氏病發(fā)作有關(guān)。黑質(zhì)是相對小的深部腦結(jié)構(gòu)，位于大得多的紋狀體下面?？紤]到直接接近黑質(zhì)所涉及的手術(shù)風(fēng)險，已經(jīng)試圖經(jīng)由表達(dá)的神經(jīng)生長因子的運(yùn)輸從紋狀體遞送到黑質(zhì)。然而，在以上其它地方描述的2期研究中，將AAV-神經(jīng)秩蛋白構(gòu)建物遞送到紋狀體出乎意料地不能提供足夠的蛋白質(zhì)給黑質(zhì)，以在人中實現(xiàn)可與在帕金森氏病的非人靈長類動物模型中利用相同方法顯示的那些結(jié)果比較的治療結(jié)果。據(jù)信，在人帕金森病患中，黑質(zhì)紋狀體途徑可能比之前理解的更加變性。如在實施例中進(jìn)一步定義的，根據(jù)本發(fā)明的神經(jīng)生長因子的遞送靶向黑質(zhì)(還優(yōu)選紋狀體)。對于紋狀體遞送，可以靶向紋狀體的不同區(qū)域，包括例如殼核、蒼白球和尾狀核?？梢酝瑫r靶向腦的多個區(qū)域，諸如殼核和黑質(zhì)。另外，可以靶向特定區(qū)域的多個位置，例如均沿一個或兩個半球的殼核和/或黑質(zhì)的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個區(qū)域。在人患者中，在每個半球或每側(cè)對黑質(zhì)的一次或多次注射，而且優(yōu)選，在每個半球或每側(cè)對紋狀體的一次或多次注射，被認(rèn)為足以實現(xiàn)疾病的治療改善。遞送到紋狀體的表達(dá)載體的劑量也可以大于遞送到黑質(zhì)的表達(dá)載體的劑量。例如，在單個療程中，遞送到紋狀體的總劑量可以是遞送到黑質(zhì)的劑量的1、1.5、2、2.5、3、 3. 5、4、4· 5、5、5· 5、6、6· 5、7、7· 5、8、8. 5、9、9· 5或10倍。更優(yōu)選地，提供給紋狀體的總劑量為提供給黑質(zhì)的總劑量的5至10倍。如本公開內(nèi)容中所使用的，“單位劑量”一般指每毫升被制備用于本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)藥物組合物的神經(jīng)生長因子濃度。對于經(jīng)由病毒載體的遞送(體內(nèi)或先體外后體內(nèi)(exvivo))，神經(jīng)生長因子濃度由每毫升神經(jīng)營養(yǎng)組合物的病毒顆粒數(shù)定義。最佳地，對于利用病毒表達(dá)載體的神經(jīng)生長因子遞送，神經(jīng)生長因子的每個單位劑量將包括至少2. 5μ I的神經(jīng)營養(yǎng)組合物，根據(jù)臨床指示多達(dá)25、60、100、200、30(^1或更多，其中組合物包括藥學(xué)上可接受液體中的病毒表達(dá)載體并提供每毫升神經(jīng)營養(yǎng)組合物從IO6多達(dá)102°個表達(dá)病毒顆粒。對于神經(jīng)生長因子蛋白質(zhì)的遞送，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將能夠容易地沿著這些思路將劑量方案轉(zhuǎn)換成合適的單位劑量。按照本發(fā)明定義的方案，神經(jīng)生長因子的直接遞送可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉的手段來實現(xiàn)，包括通過手術(shù)切口的微注射(見，例如Capecchi, Cell, 22:479-488 (1980))、輸注、與目標(biāo)分子或共沉淀劑(例如，脂質(zhì)體、鈣)的化學(xué)絡(luò)合、電穿孑L (見，例如，Andreason 和 Evans, Biotechniques, 6:650-660 (1988))，以及，對于編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體組合物的遞送，目標(biāo)組織的微粒轟擊(Tang等，Nature, 356:152-154 (1992))。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，尤其為了用于基因治療中，本發(fā)明應(yīng)用的直接遞送方法消除了與基因治療有關(guān)的限制風(fēng)險因素；即，用攜帶編碼神經(jīng)生長因子的轉(zhuǎn)基因的載體轉(zhuǎn)染非目標(biāo)細(xì)胞的可能。在本發(fā)明中，遞送是直接的，并且遞送部位被選擇，以便分泌的神經(jīng)生長因子的擴(kuò)散發(fā)生在腦的受控和預(yù)定區(qū)域，最優(yōu)化與目標(biāo)神經(jīng)元的接觸，同時最小化與非目標(biāo)細(xì)胞的接觸。此外，在靈長類動物和人中，已經(jīng)證明具有可操作的編碼神經(jīng)生長因子的轉(zhuǎn)基因的病毒載體在遞送到腦若干年后表達(dá)人神經(jīng)生長因子。因此，本發(fā)明在腦中提供長期可用的神經(jīng)生長因子來源。用于實施本發(fā)明的材料在本發(fā)明方法中有用的材料包括體內(nèi)相容的重組表達(dá)載體、包裝細(xì)胞系、輔助細(xì)胞細(xì)胞系、體內(nèi)合成的基因治療載體、可調(diào)控的基因表達(dá)系統(tǒng)、封裝材料、藥學(xué)上可接受的載體和編碼感興趣的神經(jīng)系統(tǒng)生長因子的多核苷酸。神經(jīng)牛長閔子已知的神經(jīng)系統(tǒng)生長因子包括神經(jīng)生長因子(NGF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)生長因子-3 (NT-3)、神經(jīng)生長因子-4/5 (NT-4/5)、神經(jīng)生長因子_6 (NT-6)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、膠質(zhì)細(xì)胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)和⑶NF分子家族(⑶NF的天然存在的類似物、神經(jīng)秩蛋白以及persephin和artemin)的其它成員、成纖維細(xì)胞生長因子家族(FGF 1-15)、白血病抑制因子(LIF)、胰島素樣生長因子家族的某些成員(例如，IGF-1)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(BMP)、抑免蛋白、生長因子的轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)家族、神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白、表皮生長因子(EGF)、血小板衍生生長因子(TOGF)和其它。生長因子可以被純化、合成或重組產(chǎn)生。“神經(jīng)生長因子”意為任意來源的生長因子，其基本上與本文所提及的神經(jīng)生長因子同源，并且與本文所提及的神經(jīng)生長因子在生物學(xué)上等同。這些基本上同源的生長因子對于任何組織或物種可以是天然的，并且，類似地，生物學(xué)活性可以在任意一些生物學(xué)分析系統(tǒng)中被表征。例如，“神經(jīng)生長因子”也可以包 括雜交或修飾形式的分子，包括融合蛋白和片段以及其中某些氨基酸已經(jīng)缺失或置換的雜交或修飾形式和諸如其中一個或多個氨基酸已經(jīng)變成修飾的氨基酸或稀有氨基酸的修飾及諸如糖基化的修飾，只要雜交或修飾形式保持對象神經(jīng)生長因子的生物學(xué)活性。保持生物學(xué)活性意指實現(xiàn)神經(jīng)元修復(fù)或提高活性，盡管不一定以與分離和純化形式的神經(jīng)生長因子或者已經(jīng)被重組產(chǎn)生的神經(jīng)生長因子相同的效價水平。在本文中提及神經(jīng)生長因子的前原(pre-pro)序列意欲被解釋為包括前原生長因子，其包含前或前導(dǎo)或信號序列區(qū)域、原序列區(qū)域和成熟蛋白質(zhì)。前和/或原區(qū)域的核苷酸序列也可以用于構(gòu)建具有其它生長因子或蛋白質(zhì)的編碼序列的嵌合基因，并且，類似地，嵌合基因可以由與來自其它生長因子或蛋白質(zhì)的基因的編碼前和/或原區(qū)域的序列結(jié)合的、對象神經(jīng)生長因子的編碼序列構(gòu)建(Booth等，Gene 146:303-8(1994) ；Ibanez, Gene146:303-8(1994);Storici 等,FEBS Letters 337:303-7(1994) ；Sha 等,J Cell Biol114:827-839(1991)，其通過引用被并入)。這些嵌合蛋白質(zhì)可以表現(xiàn)活性蛋白質(zhì)種類的改變的生產(chǎn)量或表達(dá)。用于本發(fā)明的具體示例性神經(jīng)生長因包括⑶NF家族的⑶NF、神經(jīng)秩蛋白(NRTN)、persephin和artemin(例如,用于治療帕金森氏病)。這些神經(jīng)生長因子的編碼序列對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是悉知的，或者可容易地被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定，而不需要在此復(fù)述。對于GDNF家族，例如，可以參考以下核苷酸序列WWW. ncbi. nlm. nih. gov/gene/2668 (基因 ID 2668,人 GDNF)、WWW. ncbi. nlm. nih. gov/gene/4902 (基因 ID 4902,人神經(jīng)秩蛋白一也參見美國專利號 6，090，778)、www. ncbi. nlm. nih. gov/gene/5623 (基因 ID 5623 ;人 persephin)和 www. ncbi.nlm. nih. gov/gene/9048 (基因 ID 9048 ;人 artemin)以及其它來源。對于⑶NF家族，例如，可以參考以下多肽序列www. ncbi. nlm. nih. gov/protein/CAG46721. I (登錄號 CAG46721 ;人 GDNF)；
www. ncbi. nlm. nih. gov/protein / EAW69140. I (登錄號 EAW69140 ;人神經(jīng)秩蛋白一也參見美國專利號6，090，778)；www. ncbi. nlm. nih. gov/protein / AAC39640. I (登錄號 AAC39640 ;人persephin)、www. ncbi. nlm. nih. gov/protein / AAD13109. I (登錄號 AAD13109. I ;人artemin)、以及其它來源。根據(jù)本發(fā)明，人神經(jīng)生長因子優(yōu)選用于人疾病的治療，這是由于與同種異型生長因子相比它們相對低的免疫原性。然而，已知其它神經(jīng)生長因子通過本文所述種類的充分檢驗，也可適合用于本發(fā)明。重鉬表汰載體 將基因體內(nèi)轉(zhuǎn)移到目標(biāo)細(xì)胞中的策略包括以下基本步驟⑴選擇其表達(dá)與CNS疾病或機(jī)能障礙相關(guān)的合適轉(zhuǎn)基因(一個或多個)；(2)選擇并開發(fā)合適且有效的載體，用于基因轉(zhuǎn)移；(3)證明目標(biāo)細(xì)胞的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)基因表達(dá)穩(wěn)定且有效地發(fā)生；(4)證明體內(nèi)基因治療程序不引起嚴(yán)重的有害作用；和(5)證明在宿主動物中期望的表型效應(yīng)。盡管可以使用其它載體，但用于本發(fā)明方法的優(yōu)選載體是病毒和非病毒載體，諸如DNA載體(例如，腺相關(guān)病毒(AAV)和腺病毒，尤其是前者)。選擇的載體應(yīng)該滿足以下標(biāo)準(zhǔn)1)載體必須能夠感染目標(biāo)細(xì)胞，因而必須選擇具有合適宿主范圍的病毒載體；2)轉(zhuǎn)移的基因應(yīng)該能夠在細(xì)胞中持久保留并長期表達(dá)(而不引起細(xì)胞死亡)，以在細(xì)胞中維持穩(wěn)定和表達(dá)；和3)載體對目標(biāo)細(xì)胞的損害應(yīng)該非常小，如果存在的話。因為成年哺乳動物腦細(xì)胞是不分裂的，所以選擇的重組表達(dá)載體必須能夠轉(zhuǎn)染并在不分裂細(xì)胞中表達(dá)。已知具有這種能力的載體包括DNA病毒，諸如腺病毒、腺相關(guān)病毒(AAV)，以及某些RNA病毒，諸如基于HIV的慢病毒、貓免疫缺陷病毒(FIV)和馬免疫缺陷病毒(EIV)。具有這種能力的其它載體包括單純皰疹病毒(HSV)。構(gòu)建重組表達(dá)用于本發(fā)明的神經(jīng)系統(tǒng)生長因子的載體可以利用不需要對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員詳細(xì)說明的常規(guī)技術(shù)來完成。構(gòu)建在本發(fā)明中有用的AAV載體的具體方案在實施例中說明。AAV2血清型的使用被例示；然而，也可以使用其它已知AAV血清型。關(guān)于載體構(gòu)建的一般技術(shù)的進(jìn)一步評述，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以希望參考Maniatis等,Molecular Cloning:ALaboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (NY1982)。也已經(jīng)描述了一些病毒和非病毒啟動子的啟動子和增強(qiáng)子區(qū)域(例如，對于非病毒啟動子，Schmidt 等，Nature 314:285 (1985) ;Rossi 和 de Crombrugghe, Proc. Natl. Acad.Sci. USA 84:5590-5594(1987))。維持和提高轉(zhuǎn)基因在休眠細(xì)胞中表達(dá)的方法包括使用啟動子，包括膠原蛋白 I 型(I 和 2) (Prockop 和 Kivirikko, N. Eng. J. Med. 311:376 (1984)；Smith 和 Niles, Biochem. 19:1820(1980) ；de Wet 等，J. Biol. Chem.，258:14385 (1983))、SV40、雞β -肌動蛋白和LTR啟動子。利用細(xì)胞因子調(diào)節(jié)啟動子活性，也可以提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)，用于長期穩(wěn)定的表達(dá)。例如，轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、白細(xì)胞介素(IL)-l、和干擾素(INF)下調(diào)由各種啟動子諸如LTR驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。腫瘤壞死因子(TNF)和TGFl上調(diào)由啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因表達(dá)，并且可用于控制由啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)基因表達(dá)?？梢宰C明有用的其它細(xì)胞因子包括堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)。具有膠原蛋白增強(qiáng)子序列(Coll(E))的膠原蛋白啟動子通過進(jìn)一步抑制對載體的任何免疫應(yīng)答一可能在治療的腦中產(chǎn)生，雖然其免疫保護(hù)狀態(tài)一也可用于提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)。此外，抗炎劑，包括類固醇，例如地塞米松，可在載體組合物遞送后立即施用給治療的宿主，并且，優(yōu)選持續(xù)到任何細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎性反應(yīng)減退。免疫抑制劑諸如環(huán)孢菌素也可以被施用，以減少干擾素的產(chǎn)生，這下調(diào)LTR啟動子和Coll(E)啟動子-增強(qiáng)子并降低轉(zhuǎn)基因表達(dá)。含有人神經(jīng)秩蛋白cDNA序列的AAV2病毒載體的構(gòu)建描述在圖I中和Gasmi等，Mol Ther 15:62-68(2007)中，其公開內(nèi)容通過該引用被并入本文。前原形式的神經(jīng)秩蛋白被切割，形成成熟蛋白質(zhì)和含有前原區(qū)域的人前原形式。為了增強(qiáng)成熟神經(jīng)秩蛋白分 子的分泌，除了前原神經(jīng)秩蛋白以外，還可以使用信號肽序列，如在美國專利號6，090，778中所描述的；例如，獲自NGF的信號肽序列(Gasmi，等，ibid.)。供體細(xì)朐雖然本公開內(nèi)容關(guān)注優(yōu)選的體內(nèi)遞送方法，但本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員將認(rèn)識到，宿主細(xì)胞諸如成纖維細(xì)胞和干細(xì)胞(包括但不限于胚胎干細(xì)胞和成體誘導(dǎo)的多能干細(xì)胞或全能干細(xì)胞)也可用于先體外后體內(nèi)將編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體遞送到腦。含有編碼神經(jīng)生長因子轉(zhuǎn)基因的表達(dá)載體的供體細(xì)胞的制備詳細(xì)地描述在共同轉(zhuǎn)讓的美國專利號5，650，148中，其內(nèi)容被并入本文。制備通過導(dǎo)入含有編碼神經(jīng)生長因子蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因(一個或多個)的載體修飾供體細(xì)胞來完成，這些細(xì)胞進(jìn)而被移植到目標(biāo)組織上。供體細(xì)胞的制備對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員是已知的。簡而言之，將基因體外轉(zhuǎn)移到供體細(xì)胞中的策略包括以下基本步驟(I)選擇其表達(dá)與CNS疾病或機(jī)能障礙相關(guān)的合適轉(zhuǎn)基因(一個或多個)；(2)選擇并開發(fā)合適且有效的載體，用于基因轉(zhuǎn)移；(3)制備供體細(xì)胞(例如，從初級培養(yǎng)物或從確立的細(xì)胞系)；(4)證明表達(dá)新功能的供體植入的細(xì)胞能存活并可以穩(wěn)定、有效地表達(dá)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物；(5)證明移植沒有引起嚴(yán)重的有害作用；和(6)證明在宿主動物中期望的表型效應(yīng)。藥學(xué)制劑在本發(fā)明中優(yōu)選使用編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體的直接體內(nèi)遞送。為此，可將編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體放入藥學(xué)可接受的懸浮液、溶液或乳液中。類似的運(yùn)載體可用于遞送神經(jīng)生長因子蛋白質(zhì)。更具體而言，藥學(xué)可接受的運(yùn)載體可以包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳液。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油諸如橄欖油和可注射有機(jī)酯諸如油酸乙酯。水性運(yùn)載體包括水、醇/水溶液、乳液或懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外運(yùn)載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏油或固定油。靜脈內(nèi)運(yùn)載體包括液體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如基于林格氏葡萄糖的那些)等等。本發(fā)明的藥物組合物可通過本領(lǐng)域中已知的任何合適的路徑進(jìn)行施用，包括例如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、經(jīng)皮、鞘內(nèi)或腦內(nèi)。施用可以是快速的，如通過注射，或經(jīng)歷一段時間，如通過緩慢輸注或施用緩釋制劑。為了治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的組織，施用可以是通過注射或輸注到腦脊液(CSF)中。當(dāng)意圖將神經(jīng)生長因子施用給中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的細(xì)胞時，施用可以與一種或多種能夠促進(jìn)分子滲透跨過血腦屏障的劑一起。運(yùn)載體也可以含有其它藥學(xué)上可接受的賦形劑，用于改變或維持制劑的pH、摩爾滲透壓濃度、粘性、透明度、顏色、無菌性、穩(wěn)定性、溶解速率或氣味。類似地，運(yùn)載體還可含有其它藥學(xué)上可接受的賦形劑，用于改變或維持跨過血腦屏障的釋放或吸收或滲透。這些賦形劑是這樣的物質(zhì)，其通常和習(xí)慣被用于配制以單位劑型或多劑量形式腸胃外施用或者通過連續(xù)或定期輸注直接輸注到腦脊液的劑型。也可以存在防腐劑和其它添加劑，如例如抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑和惰性氣體等等。此外，神經(jīng)生長因子轉(zhuǎn)基因組合物可以利用本領(lǐng)域中悉知的手段凍干，用于隨后的重構(gòu)和根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用。根據(jù)劑量配方的藥代動力學(xué)參數(shù)和采用的施用途徑，可以重復(fù)施用劑量。根據(jù)患者的大概體重或體表面積或者待被占用的身體空間體積，計算特定的劑量。也將根據(jù)選擇的具體施用途徑來計算劑量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員按照常規(guī)來進(jìn)一步精確確定治療用合適劑量所必需的計算。根據(jù)本文在目標(biāo)細(xì)胞的分析制備中所公開的活性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行這些計算而不用進(jìn)行過多的實驗。結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)劑量-響應(yīng)研究確定準(zhǔn)確的劑量。應(yīng)該 理解，從業(yè)者將根據(jù)相關(guān)情況，包括待治療的狀況(一個或多個)、待施用的組合物的選擇、個體患者的年齡、體重和響應(yīng)、患者癥狀的嚴(yán)重性和選擇的施用途徑，確定實際施用的組合物的量。膠體分散體系也可用于靶向基因遞送。膠體分散體系包括高分子復(fù)合物、納米膠囊、微球體、珠和脂類基體系，包括水包油乳劑、微團(tuán)、混合微團(tuán)和脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是人造膜性泡囊，其用作體外和體內(nèi)的遞送運(yùn)載體。已經(jīng)顯示，大單層泡囊(LUV)，大小范圍為O. 2-4. O μ m，可包封相當(dāng)百分比的含有大的高分子的水性緩沖液。RNA、DNA和完整的病毒體可被包封在水性內(nèi)部中，并以生物學(xué)活性形式遞送到細(xì)胞(Fraley,等，Trends Biochem.Sci. ,6:77, 1981)。為使脂質(zhì)體成為有效的基因轉(zhuǎn)移運(yùn)載體，應(yīng)該呈現(xiàn)以下特性(I)高效包封編碼反義多核苷酸的基因而不損害其生物學(xué)活性；(2)與非目標(biāo)細(xì)胞相比，優(yōu)先并充分結(jié)合目標(biāo)細(xì)胞；(3)將泡囊的水性內(nèi)容物高效遞送到目標(biāo)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)；和(4)精確、有效地表達(dá)遺傳信息(Mannino,等,Biotechniques, 6:682，1988)。脂質(zhì)體的組成通常是磷脂特別是高相變溫度磷脂通常與類固醇尤其是膽留醇的組合。也可以使用其它磷脂或其它脂類。脂質(zhì)體的物理特性取決于pH、離子強(qiáng)度和二價陽離子的存在。在脂質(zhì)體生產(chǎn)中有用的脂類的實例包括磷脂?；衔?，諸如磷脂酰甘油、磷脂酰膽堿、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷酯。特別有用的是二?；字８视?，其中脂類部分含有14-18個碳原子，尤其是16-18個碳原子，并且是飽和的。示例性磷脂包括卵磷脂酰膽堿、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酰膽堿。基于解剖學(xué)和力學(xué)因素，可以對脂質(zhì)體的靶向分類。解剖學(xué)分類是基于選擇性的水平，例如，器官特異性、細(xì)胞特異性和細(xì)胞器特異性。可以基于其是被動的還是主動的來區(qū)分力學(xué)靶向。被動靶向利用脂質(zhì)體的自然趨向分布到含有竇狀隙毛細(xì)管的器官中的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(RES)的細(xì)胞。另一方面，主動靶向涉及通過將脂質(zhì)體連接到特定的配體諸如單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白質(zhì)，或者通過改變脂質(zhì)體的組成或大小來改造脂質(zhì)體，以實現(xiàn)對除天然存在的定位位點之外的器官和細(xì)胞類型的靶向。
目標(biāo)基因遞送系統(tǒng)的表面可以以各種方式進(jìn)行修飾。在脂質(zhì)體靶向遞送系統(tǒng)的情況下，脂類基團(tuán)可以并入到脂質(zhì)體的脂雙層中，以便維持靶向配體與脂質(zhì)體雙層穩(wěn)定結(jié)合。各種連接基團(tuán)可用于連接脂類鏈與靶向配體。動物模型和臨床評價在非人靈長類動物對象中，老化的過程刺激經(jīng)歷老化的人腦中的神經(jīng)學(xué)變化。以高度完整性模擬帕金森氏病的非年老動物模型是I-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)處理的猴子(見,例如,Kordower 等,Exp. Neurology, 160:1-16(1999))。這種處理導(dǎo)致黑質(zhì)中的巴胺能神經(jīng)元廣泛變性，同時伴隨行為改變和運(yùn)動缺陷(實施例2)。證明本發(fā)明方法在年老的非人靈長類動物以及MPTP處理的動物中的用途和療效的數(shù)據(jù)之前已經(jīng)被展示。此外，如在實施例中所論述的，證明本發(fā)明方法在人中的用途的數(shù)據(jù)也被展示。治療的臨床評價和監(jiān)測可以利用上述體內(nèi)成像技術(shù)以及通過對處理組織的活組織檢查和組織學(xué)分析來進(jìn)行。在后者方面中，就例如TH免疫反應(yīng)性而言，可以在組織樣品中對神經(jīng)元數(shù)目定量。 疾病癥狀改善的臨床評價和監(jiān)測可以在治療后各個時間點進(jìn)行評定和觀察。在各個實施方式中，在治療后30天、60天、90天、180天、12個月、18個月、24個月、48個月、72個月和更長之后可觀察到改善?？梢杂肬RPDRS評價處于實際關(guān)閉狀態(tài)(practically-defined off state)(在最后服用抗帕金森藥物后約12h)和處于最佳開啟狀態(tài)(best on state)(對早晨服用抗帕金森藥物的最佳響應(yīng))的患者。Fahn等，Recent DevelopmentsinParkinson' sdisease, Macmillan Healthcare Information, Florham Park, NJ2:153 - 163 (1987)。也可以在 12個月后的每次回訪時在實際關(guān)閉狀態(tài)中進(jìn)行UPDRS的運(yùn)動評分(subscale)(第3部分)?？梢远ㄆ谶M(jìn)行運(yùn)動狀態(tài)、計時運(yùn)動測試、運(yùn)動障礙分級和臨床總體印象評價的家庭日記評價(Homediary assessment),例如在基線時、6個月時和在其后的每次回訪時。可以用帕金森氏病調(diào)查表(PDQ)-39 (Jenkinson 等，Age Ageing 26:353 - 357(1997))和簡表(SF) -36 (Ware等，Med Care 30:473 - 483(1992))定期評價生活質(zhì)量；例如，在基線時及其隨后。本發(fā)明已經(jīng)被充分描述，下面闡述說明其實施的實施例。然而，這些實施例不應(yīng)該被認(rèn)為限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。實施例IAAV2-神經(jīng)秩蛋白基因療法(AAV-神經(jīng)秩蛋白)的牛物活件帕金森氏病(人)和非人靈長類動物腦的差異12個中度晚期帕金森氏病患者的I期試驗沒有鑒定出安全問題，同時表明運(yùn)動功能的若干測量上的可能改進(jìn)。Marks等，Lancet Neurol7:400 - 408 (2008)。如在上面別處所述，隨后58個對象的雙盲控制2期試驗進(jìn)一步支持AAV-神經(jīng)秩蛋白的安全性，但與初級終點(在12月時UPDRS-運(yùn)動“關(guān)閉”)上的假手術(shù)相比，不能辨別任何益處。然而，若干次級終點表明適度的臨床益處，而沒有測量結(jié)果支持假對照。而且，對來自在15到18個月時保持盲處理的患者(n=30)的所有數(shù)據(jù)進(jìn)行的方案規(guī)定的分析(protocol-prescribedanalysis)表明，用AAV-神經(jīng)秩蛋白(AAV2-NTRN)在初級和次級終點上的顯著益處，沒有測量結(jié)果支持假的。在2期試驗中兩個帕金森氏病患者死于非AAV2-NRTN相關(guān)事件，并且通過組織學(xué)方法檢查他們的腦。將AAV2-NRTN遞送到這些患者殼核的效果、比較NRTN在殼核和黑質(zhì)中的表達(dá)和黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元中的TH-誘導(dǎo)與遵循相同處理的年輕的、年老的和帕金森猴子的那些，在下面詳細(xì)說明。載體設(shè)計和構(gòu)建利用AAV-神經(jīng)秩蛋白，其是被遺傳改造成僅表達(dá)人NRTN的AAV2載體。Gasmi等，Mol Ther 15:62 - 68(2007)。帕金森尸體解剖病例之前滿足入圍標(biāo)準(zhǔn)并簽署IRB認(rèn)可的知情同意書的患者接受AAV-神經(jīng)秩蛋白(5. 4X IO11Vg),其通過每個半球4個單獨的針道和每個道兩個忙庫(deposit)進(jìn)行分布。一個對象(#1802)是59歲的男性，在10. 2年之前已被確診，并 在AAV-神經(jīng)秩蛋白治療后第90天死于肺栓塞。第二個對象(#1904)是73歲的男性，已經(jīng)在9. 5年前被確診，在AAV-神經(jīng)秩蛋白后第47天遭受致命的心肌梗塞。對象#1904的基線UPDRS運(yùn)動關(guān)閉/開啟分?jǐn)?shù)為34/21和自報告日記關(guān)閉時間(off time)為I. 33hr/天。對象#1802的基線UPDRS運(yùn)動關(guān)閉/開啟分?jǐn)?shù)為51/34和自報告日記關(guān)閉時間為4. 7hr/天。分別在6和13個小時的死后間隔時間后用改進(jìn)的Zamboni溶液固定腦，并以40 μ m進(jìn)行切片。從第二個對象中僅可用一個半球。針對NRTN和酪氨酸羥化酶(TH)對腦染色，利用非帕金森氏病年老的人作為陽性對照。兩個腦均顯示帕金森氏病的典型病理學(xué)特征，同時黑質(zhì)中細(xì)胞顯著損失，這與多個α -突觸核蛋白-染色的路易體有關(guān)。非人靈長類動物病例基于相對的紋狀體體積，在施用給帕金森氏病患者的范圍內(nèi)，施用殼核內(nèi)劑量的AAV2-NRTN給10只恒河猴(Macaca mulatta)，除了有意接受實質(zhì)上較低劑量(人劑量的 4%，按紋狀體體積計)的兩只年輕猴子并且它們的腦僅在28天后被評價以夕卜。所有居住條件(housing)和試驗均是IACUC認(rèn)可的。Kordower等,Ann Neurol60:706 - 715(2006) ;Herzog 等，Mov Disord22:1124 - 1132(2007) ;Herzog 等，Mol Ther16:1737 - 1744(2008)；和 Herzog 等，Neurosurgery 64:602 - 612(2009) 在 AAV-神經(jīng)秩蛋白施用之后，將猴子麻醉，用O. 9%鹽水經(jīng)心灌注，接下來是改進(jìn)的Zamboni固定，并將腦進(jìn)行切片。這些猴子中的一些是之前的出版物的部分，雖然本文呈現(xiàn)的具體數(shù)據(jù)未被之前公布。Kordower 等，Ann Neurol 60:706 - 715 (2006) ；Herzog 等，MovDisord22:1124 - 1132(2007) ;Herzog 等，Mol Ther 16:1737 - 1744(2008) 以紋狀體內(nèi)總體積25 μ L的兩個貯庫對兩只年輕的猴子Γ5歲大)施用每個半球O. 5X IO11Vg的AAV-神經(jīng)秩蛋白，I個月后將其無痛處死，并且另外的年輕猴子接受每個半球I. O X IO11Vg的AAV-神經(jīng)秩蛋白，在3個月后將其無痛處死。經(jīng)由分布在紋狀體內(nèi)的5個貯庫(每個30 μ L)對三只年老的猴子(22 - 25歲大)單側(cè)施用3X IO1Vg的AAV-神經(jīng)秩蛋白，在8個月后將其無痛處死。五只猴子(年齡范圍6_ 10歲)接受單側(cè)、頸動脈內(nèi)輸注導(dǎo)致運(yùn)動機(jī)能障礙的MPTP。然后，4天后，經(jīng)由分布在紋狀體內(nèi)的5個貯庫(每個15 μ L)以及單次10 μ L注射到黑質(zhì)(O. 2 X IO1Vg劑量)中對它們施用I. 5 X IO1Vg的AAV-神經(jīng)秩蛋白，并在10. 5個月后將它們無痛處死。神經(jīng)秩蛋白和酪氨酸羥化酶的免疫組織化學(xué)分析
免疫過氧化物酶標(biāo)記被用于顯現(xiàn)人和非人靈長類動物紋狀體和黑質(zhì)中的NRTN和TH,如在Kordower等，Ann Neurol. , 60:706-715(2006)中所描述的。立體學(xué)取樣方法，結(jié)合計算機(jī)輔助成像軟件，并且Cavalieri方法被用于對靈長類動物紋狀體中NRTN表達(dá)的體積定量。對于人病例，兩種不同的方法被獨立地用于計算殼核中NRTN表達(dá)的體積。一種方法基于對每個殼核中6到11個切片的立體學(xué)取樣應(yīng)用定容分析。第二種方法對發(fā)現(xiàn)包含殼核的所有切片取樣(每個病例19 - 29個切片)。然后，基于整體目標(biāo)的體積，利用來自內(nèi)部(in-house)人和靈長類動物組織學(xué)切片和MRI掃描的值以及公布的值，計算在每個目標(biāo)結(jié)構(gòu)中表達(dá)的NRTN的百分比，以提供對 1200mm3/半球的非人靈長類動物尾狀/殼核和lOOOmm3/半球的人殼核的評估。結(jié)果NRTN 表達(dá)對于這兩個帕金森氏病病例，在死于不相關(guān)的原因之后，于AAV2-NRTN處理后7 周或3+個月的三個可得的半球中定量神經(jīng)秩蛋白表達(dá)。在所有半球中均看到NRTN-免疫反應(yīng)性，其限于目標(biāo)殼核中。兩個獨立的盲分析保守地估計NRTN蛋白質(zhì)按體積計覆蓋整體殼核的 15%。AAV-神經(jīng)秩蛋白應(yīng)用的劑量給藥范例意圖盡可能廣泛地將AAV2-NRTN分布在殼核中，同時限制擴(kuò)散到周圍部位，以降低可能的副作用。Kordower等，Ann Neurol46:419 - 424 (1999) ;Nutt 等，Neurology 60:69 - 73 (2003);和 Eriksdotter 等，DementGeriatr Cogn Disord 9:246 - 257(1998)。在三個研究的半球的每一個中，在所有分析的殼核切片的93%、58%和80%中看到了可檢測的NRTN蛋白質(zhì)。與殼核(S卩，多巴胺黑質(zhì)神經(jīng)元的末梢區(qū)域)中強(qiáng)的NRTN表達(dá)形成對比，在黑質(zhì)(即，這些相同神經(jīng)元的神經(jīng)元胞體)中見到非常少的NRTN染色一盡管看得出，使多巴胺能的黑色素-陽性神經(jīng)元得以存活。兩只年輕的猴子被施用特別低劑量的AAV-神經(jīng)秩蛋白(小于人帕金森氏病劑量的4%，按每一目標(biāo)結(jié)構(gòu)的相對體積計)，并在I月后就將其無痛處死，以提供對具有低NRTN表達(dá)水平的AAV-神經(jīng)秩蛋白的早發(fā)型生物活性的保守估計。在這兩只猴子中紋狀體NRTN表達(dá)的體積估計為僅5. 6%和I. 8%。盡管這種低水平的紋狀體NRTN表達(dá)，并且與帕金森氏病(人)形成對比，但是NRTN逆向標(biāo)記在黑質(zhì)核周體中容易看到，并且順向輸送的NRTN+纖維在整個蒼白球和黑質(zhì)網(wǎng)狀部中被看到。對于這三只在8個月前施用AAV2-NRTN的年老的猴子，估計NRTN覆蓋按體積計整個紋狀體的4、19和25% (平均16%)。盡管紋狀體NRTN覆蓋率的變化，但始終在黑質(zhì)中觀察到NRTN，這與帕金森氏病(人)組織不同。對于5只MPTP處理的猴子(在MPTP處理后施用AAV2-NRTN 4天，10個月后無痛處死)，按體積計整個殼核的平均 13%針對NRTN被染色(分別為8%、8%、13%、15%和23%)。類似于其它靈長類動物研究，分別在黑質(zhì)致密部和網(wǎng)狀部中觀察到逆向和順向運(yùn)輸?shù)腘RTN的大量證據(jù)。酪氨酸羥化酶免疫組織化學(xué)對人帕金森氏病尸體解剖組織的檢查僅發(fā)現(xiàn)在AAV-神經(jīng)秩蛋白之后TH誘導(dǎo)的不足的證據(jù)。在目標(biāo)紋狀體中觀察到TH誘導(dǎo)的最明確的證據(jù)，其完全在NRTN染色的一些最密集部位的邊界內(nèi)。該信號——僅反映稀少的TH-陽性纖維一平均在50%的NRTN-陽性殼核部位(即，分別為0%、62%和80%)被觀察到。帕金森氏病(人)腦的黑質(zhì)中沒有發(fā)現(xiàn)TH誘導(dǎo)的證據(jù)，盡管存在許多含黑色素的、TH+多巴胺能神經(jīng)元。與帕金森氏病病例中稀少的TH誘導(dǎo)信號形成對比，在猴子中AAV2-NRTN處理后的TH誘導(dǎo)始終在黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元中被觀察到，其一般是強(qiáng)有力的，并通常反映在紋狀體和黑質(zhì)中NRTN表達(dá)的程度和強(qiáng)度。與帕金森氏病病例相比，這甚至在劑量給藥后28天也是明顯的，并且劑量實質(zhì)上越低，NRTN表達(dá)越少。最后，進(jìn)一步與帕金森氏病(人)腦中的TH應(yīng)答形成對比，猴子紋狀體中TH誘導(dǎo)的面積始終超過鄰近切片中NRTN染色的面積。通過以上數(shù)據(jù)，顯示了基因療法可以在神經(jīng)變性患者腦深部產(chǎn)生潛在有效的治療用蛋白質(zhì)的靶向表達(dá)。將AAV2-NRTN (AAV-神經(jīng)秩蛋白)施用到帕金森氏病(人)腦中的殼核導(dǎo)致NRTN在目標(biāo)殼核中的明確表達(dá)，保守估計覆蓋按體積計結(jié)構(gòu)的 15%。雖然不知道在帕金森氏病患者中對于臨床益處需要多大覆蓋率，但該量明顯在若干非人靈長類動物模 型中提供生物學(xué)益處的范圍內(nèi)，并且積累的動物和人的安全性數(shù)據(jù)現(xiàn)在提供進(jìn)一步可靠地擴(kuò)展該覆蓋率的正當(dāng)理由。Kordower 等，Ann Neurol 60:706 - 715 (2006) ;Herzog 等，MovDisord 22:1124 - 1132(2007) ;Herzog 等，Mol Ther 16:1737 - 1744 (2008);和 Herzog等，Neurosurgery 64:602 - 612 (2009) 然而，與所有現(xiàn)有動物研究形成對比，在帕金森氏病(人)殼核中的NRTN表達(dá)并不導(dǎo)致黑質(zhì)中神經(jīng)元胞體的標(biāo)記，盡管殼核覆蓋率多得足以在年輕的、年老的和MPTP-帕金森病猴子中產(chǎn)生這種應(yīng)答。該區(qū)別表明，晚期帕金森氏病(人)與用于帕金森氏病轉(zhuǎn)換研究的典型動物模型中黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元狀況和功能的深層次差異。如在以下實施例中闡明的，本發(fā)明已經(jīng)考慮到該差異。同樣感興趣的是適度的AAV2-NRTN介導(dǎo)的TH誘導(dǎo)，在AAV2-NRTN施用和隨后的NRTN表達(dá)后可見于殼核中(TH是用于多巴胺合成的主要酶和用于變性多巴胺神經(jīng)元功能增強(qiáng)的代用品)。在非人靈長類動物中響應(yīng)AAV-NRTN的強(qiáng)的TH信號與帕金森氏病(人)中有限的信號在許多重要方面形成鮮明對比，包括= (I)TH信號強(qiáng)度遠(yuǎn)小于帕金森氏病(人)中的TH信號強(qiáng)度，(2)它以較低的頻率和可靠性發(fā)生，和(3)它發(fā)生在殼核的小得多的部分中，完全在NRTN表達(dá)的區(qū)域中?；谠谧冃院谫|(zhì)紋狀體神經(jīng)元中用神經(jīng)營養(yǎng)因子(主要為⑶NF)進(jìn)行的相當(dāng)?shù)膭游镅芯浚Ｒ?guī)的常識認(rèn)為靶向這些神經(jīng)元的末梢區(qū)域(即，紋狀體)必需且足以得到最佳神經(jīng)營養(yǎng)益處，而IE向黑質(zhì)則不必或者甚至起相反作用。Kirik等，NatNeurosci7:105-110(2004) ；Bjorklund 等,NeurobiolDis 4:186 - 200(1997)；和 Kirik 等,JNeurosci 20:4686 - 4700(2000)。這種觀點進(jìn)一步得到以神經(jīng)營養(yǎng)因子進(jìn)行的生殖研究的支持，該研究顯示它們最常通過被神經(jīng)元末梢吸收并逆向運(yùn)輸?shù)剿鼈兊陌w以引起營養(yǎng)作用而起作用。Mufson 等，Prog Neurobiol 57:451 - 484(1999)和 Lindsay 等，TrendsNeurosci 17:182-190(1994)。事實上，將⑶NF或NRTN遞送到紋狀體的末梢區(qū)域一貫被證明足以通過逆向運(yùn)輸提高⑶NF和NRTN在軸突末梢以及黑質(zhì)胞體中的水平。Salvatore等，Exp Neurol 202:495-505(2006) ;Ai 等，J Comp Neurol 461:250 - 261(2003) ；Su等，Human Gene Ther 20:1627-1640(2009);和 Tomac 等，Nature 373:335339(1995)。然而，黑質(zhì)中極小量的NRTN-陽性核周體揭示了這并沒有以類似的方式發(fā)生在晚期帕金森氏病(人)中的本文數(shù)據(jù)，盡管殼核中明顯的NRTN和黑質(zhì)中足夠的多巴胺神經(jīng)元。殼核遞送后在人黑質(zhì)中類似的弱NRTN信號的證據(jù)，確保更大的神經(jīng)營養(yǎng)暴露于黑質(zhì)中的變性核周體的策略提供更快速和強(qiáng)有力的神經(jīng)營養(yǎng)應(yīng)答，從而提供更有意義的臨床益處。顯示除紋狀體外將GDNF注射到黑質(zhì)中沒有益處并且可能是有害的相反數(shù)據(jù)應(yīng)該謹(jǐn)慎解釋。Kirik等，J Neurosci 20:4686 - 4700 (2000) 這些數(shù)據(jù)僅顯示，當(dāng)足夠的黑質(zhì)⑶NF由于紋狀體⑶NF的逆向運(yùn)輸而存在時，對黑質(zhì)的額外靶向是不必要的。然而，當(dāng)在晚期帕金森氏病人中黑質(zhì)紋狀體途徑的變性阻止NRTN從紋狀體逆向運(yùn)輸?shù)胶谫|(zhì)時，對黑質(zhì)的靶向是不必要的結(jié)論依據(jù)無效。實施例II對晚期帕金森氐病(人)的殼核內(nèi)AAV2-Neurtin(AAV_神經(jīng)秩蛋白)的多中心、隨機(jī)、雙盲、假手術(shù)對照的研究AAV2載體被遺傳改造成僅表達(dá)人神經(jīng)秩蛋白(NRTN)，如在實施例I和Gasmi 等，Mol Ther 15:62 - 68(2007)中所論述的。它提供神經(jīng)秩蛋白(NRTN)向腦細(xì)胞的靶向和持續(xù)遞送。為了利用AAV2-NRTN進(jìn)行多中心、雙盲、假手術(shù)對照的試驗，患者通過中心的、計算機(jī)產(chǎn)生的隨機(jī)編碼被隨機(jī)分配(2:1)，以接受雙側(cè)注射到殼核的AAV2-神經(jīng)秩蛋白(5. 4X IO11載體基因組)或假手術(shù)。除了神經(jīng)外科小組之外，所有患者和研究人員均對處理分配不知情。在實際上關(guān)閉狀態(tài)中統(tǒng)一的帕金森氏病分級的運(yùn)動子項評分的初級終點從基線變?yōu)?2個月。在基線后具有至少一項評價的所有隨機(jī)分配的患者均包含在初級分析中。在2006年12月和2008年11月之間，來自美國9個地點的58名患者參與了試驗。與對照個體相比，用AAV2-神經(jīng)秩蛋白治療的患者的初級終點中沒有明顯差異(差異-O. 31 [SE 2. 63]，95%CI-5. 58 至 4. 97 ；p=0. 91)。因此，當(dāng)在 12 月時利用 UPDRS 運(yùn)動評分進(jìn)行功能評價時，殼核內(nèi)AAV2-神經(jīng)秩蛋白并不優(yōu)于假手術(shù)。實施例III遞送AAV-神經(jīng)秩蛋白到黑質(zhì)和殼核自2010年10月開始的晚期帕金森氏病2b期多中心、假手術(shù)、雙盲對照的試驗中，利用AAV2-神經(jīng)秩蛋白。晚期患者可預(yù)期比處于疾病早期的患者具有更大的黑質(zhì)紋狀體運(yùn)輸途徑的變性，其中本發(fā)明因此預(yù)期容易顯示療效。到該申請時為止，52個對象中大約20%已經(jīng)進(jìn)行了 CERE-120施用或假手術(shù)，其中許多其它對象登記并等待手術(shù)。該方案根據(jù)下面列出的參數(shù)應(yīng)用本發(fā)明。利用神經(jīng)成像進(jìn)行趨實體手術(shù)，以設(shè)計注射軌跡。用深度異丙酚鎮(zhèn)靜使患者麻醉。對于分配到積極治療的患者，以AAV2作為載體將編碼神經(jīng)秩蛋白的DNA遞送到殼核進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移程序。雙側(cè)施用5. 4X IO11載體基因組的總腦劑量的AAV2-神經(jīng)秩蛋白。在這些患者中，以每側(cè)兩個注射部位(通過鉆孔到達(dá))直接靶向黑質(zhì)，其中較高的劑量根據(jù)本發(fā)明遞送到殼核，以每側(cè)三個注射部位進(jìn)行殼核遞送。在I期安全性試驗中成功對6個患者劑量給藥后，開始進(jìn)行該2b期試驗，所述I期安全性試驗首次評價用AAV-神經(jīng)秩蛋白靶向黑質(zhì)以及與之前測試的相比遞送較大劑量的可行性和安全性。I期安全性數(shù)據(jù)庫通常反映每個患者從7個月到13個月范圍的隨訪周期，而且在6個劑量給藥的對象中的任意一個中均沒有顯示嚴(yán)重的不利事件(SAE)，不包括對體重的影響。按照計劃，所有患者均在手術(shù)48小時內(nèi)從醫(yī)院離開。與在I期試驗中觀察到的安全性一致，在進(jìn)行的2期試驗中沒有觀察到AAV-神經(jīng)秩蛋白相關(guān)的嚴(yán)重的不利事件。在基線和手術(shù)后第1、3、6、9和12個月評價患者，然后每3個月進(jìn)行一次評價，直到最后入圍的患者完成15個月的評價，如就人臨床方案而言在以上別處所概述的。預(yù)期早在治療后3個月可觀察到神經(jīng)變性缺陷的改善。在之前臨床試驗中進(jìn)行殼核治療的患者在12月后出現(xiàn)的益處表明，在一年的時間點后進(jìn)行追蹤也可以進(jìn)一步證明神經(jīng)秩蛋白信號在黑質(zhì)紋狀體和胞體中的擴(kuò)大；例如，在治療后18、24、48或72個月以及可能更晚。
盡管通過參考以上實施例已經(jīng)描述了本發(fā)明，但應(yīng)該理解，修改和變化包含在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明僅由所附權(quán)利要求進(jìn)行限定。
權(quán)利要求
1.將治療用神經(jīng)生長因子遞送到人對象腦中目標(biāo)缺陷型、患病或受損的多巴胺能神經(jīng)元的方法，所述方法包括直接將編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體遞送到黑質(zhì)中和紋狀體中，以改善響應(yīng)表達(dá)的神經(jīng)生長因子的缺陷、疾病或損傷。
2.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述直接遞送到紋狀體是到殼核的至少一個區(qū)域。
3.權(quán)利要求I所述的方法，其中遞送到所述紋狀體的編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體的總單位劑量大于遞送到所述黑質(zhì)中的編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體的單位劑量。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中遞送到所述殼核的單位劑量多達(dá)遞送到所述黑質(zhì)的單位劑量的10倍。
5.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述疾病通過刺激多巴胺能神經(jīng)元修復(fù)或活性而被改盡口 ο
6.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述疾病通過恢復(fù)帕金森氏病伴隨的運(yùn)動功能缺陷而被改善。
7.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述神經(jīng)生長因子來自GDNF家族，其選自以下分子GDNF、神經(jīng)秩蛋白、pers印hin和artemin。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述神經(jīng)生長因子是神經(jīng)秩蛋白。
9.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述表達(dá)載體是腺相關(guān)病毒載體。
10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述AAV載體是AAV血清型2型載體。
11.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述遞送用泵進(jìn)行。
12.權(quán)利要求I所述的方法，其中向所述黑質(zhì)的逆向運(yùn)輸在所述對象中被削弱。
13.權(quán)利要求4所述的方法，其中遞送到所述殼核的單位劑量是遞送到所述黑質(zhì)的單位劑量的4倍。
14.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述對象患有晚期帕金森氏病。
15.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述對象患有早期帕金森氏病。
16.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述改善在治療后I個月或之后可觀察到。
17.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述改善在治療后12個月或之后可觀察到。
18.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述改善在治療后18個月或之后可觀察到。
19.權(quán)利要求6所述的方法，其中所述改善在治療后24到48個月或之后可觀察到。
20.權(quán)利要求I所述的方法，其中所述神經(jīng)生長因子在所述黑質(zhì)的胞體中表達(dá)。
21.權(quán)利要求I所述的方法，其中TH上調(diào)發(fā)生在所述紋狀體中。
22.權(quán)利要求I所述的方法，其中TH上調(diào)發(fā)生在所述黑質(zhì)中。
23.權(quán)利要求I所述的方法，其中在所述紋狀體中的遞送是到腦的每側(cè)的至少I個部位。
24.權(quán)利要求I所述的方法，其中遞送到所述黑質(zhì)是到腦的每側(cè)的至少I個部位。
25.將治療用神經(jīng)生長因子遞送到人對象腦中目標(biāo)缺陷型、患病或受損的多巴胺能神經(jīng)元的方法，所述方法包括直接將所述神經(jīng)生長因子遞送到黑質(zhì)中和紋狀體中，以改善響應(yīng)表達(dá)的神經(jīng)生長因子的缺陷、疾病或損傷。
26.將治療用神經(jīng)生長因子遞送到人對象腦中目標(biāo)缺陷型、患病或受損的多巴胺能神經(jīng)元的方法，所述方法包括直接將編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體遞送到黑質(zhì)中，以改善響應(yīng)表達(dá)的神經(jīng)生長因子的缺陷、疾病或損傷。
27.將治療用神經(jīng)生長因子遞送到人對象腦中目標(biāo)缺陷型、患病或受損的多巴胺能神經(jīng)元的方法，所述方法包括直接將所述神經(jīng)生長因子遞送到黑質(zhì)中，以改善響應(yīng)表達(dá)的神經(jīng)生長因子的缺陷、疾病或損傷。
28.將治療用神經(jīng)生長因子遞送到人對象腦中目標(biāo)缺陷型、患病或受損的多巴胺能神經(jīng)元的方法，所述方法包括直接將供體細(xì)胞中包含的神經(jīng)生長因子移植到黑質(zhì)中和紋狀體中，以改善響應(yīng)表達(dá)的神經(jīng)生長因子的缺陷、疾病或損傷。
29.將治療用神經(jīng)生長因子遞送到人對象腦中目標(biāo)缺陷型、患病或受損的多巴胺能神經(jīng)元的方法，所述方法包括直接將供體細(xì)胞中包含的神經(jīng)生長因子移植到黑質(zhì)中和紋狀體中，以改善響應(yīng)表達(dá)的神經(jīng)生長因子的缺陷、疾病或損傷。
全文摘要
用于治療哺乳動物腦中缺陷型、患病和受損的神經(jīng)元的特定臨床方案，其對于神經(jīng)變性狀況諸如帕金森氏病的治療特別有用。該方案通過直接將一定濃度的神經(jīng)生長因子經(jīng)由蛋白質(zhì)的遞送、可操作地編碼神經(jīng)生長因子的表達(dá)載體遞送或?qū)⒑羞@種表達(dá)載體的供體細(xì)胞移植到黑質(zhì)中，優(yōu)選達(dá)紋狀體中來實施。該方法刺激目標(biāo)神經(jīng)元的生長和被治療的神經(jīng)變性疾病伴隨的功能缺陷的恢復(fù)。
文檔編號A61P25/28GK102821781SQ201180017401
公開日2012年12月12日 申請日期2011年4月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者R·T·巴爾圖斯, J·斯費爾特 申請人:賽拉基因公司