家蠶微孢子蟲Met-AP2基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術領域。更具體地，涉及家蠶微孢子蟲Met_AP2基因及其應用。
【背景技術】
[0002]家蠶微孢子蟲病的病原家蠶微孢子蟲是一類細胞內(nèi)專性寄生的真核生物，之前一直屬于原蟲，近些年被劃分到真菌類。因其具有垂直傳播的特點使之成為了家蠶病原微生物中最受人關注的一種，也是家蠶病原微生物中唯一法定檢疫的疫病。從19世紀發(fā)現(xiàn)到現(xiàn)在，家蠶微孢子蟲病對各國的養(yǎng)蠶業(yè)造成了巨大的損失。除此之外，其他不同的微孢子蟲也可侵害其它昆蟲如蜜蜂、蝗蟲，水產(chǎn)如魚，哺乳動物如兔、狗，甚至也可以感染到人類，造成人角膜炎、腦炎、腸炎等疾病。不論是在哪種微孢子蟲病的治療上都未取得很好的結(jié)果，而準確檢測指示微孢子蟲是治療的前提。
[0003]最初人們判別微孢子蟲主要根據(jù)微粒子病的發(fā)病特點進行肉眼觀察。顯微鏡發(fā)明以后，人們根據(jù)微孢子蟲的形態(tài)和大小進行顯微鏡鏡檢，一定程度上提高了檢測的靈敏度和效率，并因此遏制了法國等歐洲蠶桑生產(chǎn)國流行的家蠶微粒子病。但是顯微鏡鏡檢有明顯的缺點，如對操作人員的技術及經(jīng)驗要求較高，而且微孢子蟲個體及其微小，常用的顯微鏡鏡檢檢測方法特異性和靈敏度較低，難以區(qū)分微孢子蟲類似物。
[0004]隨著PCR技術的普及，人們開始使用PCR方法來檢測微孢子蟲并且達到了較高的靈敏度?！胺肿隅姟笔欠肿铀椒治錾锵到y(tǒng)進化中的有效手段，SSU rRNA (16S rDNA)是微生物進化研究中常用的“分子鐘”(Pei A Y, et al.，2010)。家蠶微粒子病PCR檢測技術研究中所設計的引物針對的靶基因多數(shù)也是SSU rRNA，針對其他微孢子蟲基因設計的引物較少或靈敏度較差，因而很少被報道。Baker et al (1995)和Terry et al (1999)根據(jù)相近種屬微孢子蟲SSU rRNA高度保守區(qū)設計的PCR引物Vlf/530r，可鑒別多種種屬的微孢子蟲的DNA模板擴增約450bp的特異目的條帶，但是經(jīng)常出現(xiàn)假陽性等問題。
[0005]微孢子蟲寄主域廣泛，不僅可侵害各種昆蟲，也可侵染水產(chǎn)生物、陸生的哺乳動物。微孢子蟲感染人后，造成人角膜炎、腦炎、腸炎以及腹瀉等疾病。而同一種物種也可能會被不同種屬微孢子蟲同時感染。因此，在實際工作中，尤其是檢驗檢疫工作，對于樣品中存在多種微孢子蟲病原的同時檢測是很重要的，且不能出現(xiàn)漏檢的情況，因此尋求一種既能夠通用的檢測多種微孢子蟲，又具有很好的檢測靈敏性的引物組，在微孢子蟲及微孢子蟲病的實際檢測應用中具有廣泛的應用價值和意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有昆蟲微孢子蟲通用檢測技術的缺陷和不足，提供一種家蠶微孢子蟲Met_AP2基因及其在微孢子蟲檢測方面的應用。
[0007]本發(fā)明另一目的是提供一組微孢子蟲通用檢測引物及其應用。
[0008]本發(fā)明上述目的通過以下技術方案實現(xiàn): 本發(fā)明獲得了家蠶微孢子蟲Met-AP2基因，其DNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。所述家蠶微孢子蟲Met_AP2基因編碼的具有生物活性的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009]本發(fā)明還提供了所述家蠶微孢子蟲Met_AP2基因在微孢子蟲檢測方面的應用。在獲得家蠶微孢子蟲Met-AP2基因的基礎上，以Met-AP2基因為靶基因設計引物進行PCR擴增，根據(jù)擴增DNA片段的結(jié)果判定樣品中是否含有微孢子蟲。
[0010]另外，本發(fā)明還提供了一組微孢子蟲通用檢測引物，包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.5 所示。
[0011]上述引物是以Met_AP2基因為靶基因設計，經(jīng)過大量的實驗和研究獲得的，該引物既能夠通用的檢測多種微孢子蟲，又具有很好的檢測靈敏性，在微孢子蟲的實際檢測應用中具有廣泛的應用價值和意義。所述引物尤其適用于同時檢測多種桑園及野外常見的昆蟲微孢子蟲，如家蠶微孢子蟲、桑螟微孢子蟲、桑尺蠖微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、小菜蛾微孢子蟲、菜粉蝶微孢子蟲或柞蠶微孢子蟲等。
[0012]本發(fā)明還提供了一種微孢子蟲通用檢測試劑盒，包括上游引物MC-F和下游引物MC-R，上游引物MC-F的核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示，下游引物MC-R的核苷酸序列如SEQ ID N0.5 所示。
[0013]所述試劑盒的使用方法如下:
以樣品DNA或cDNA為模板，利用引物MC-R和MC-F進行PCR反應，反應結(jié)束后凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，根據(jù)擴增產(chǎn)物判定結(jié)果，當瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)特異性地1077bp的DNA片段產(chǎn)物，即該樣品感染了微孢子蟲。
[0014]所述PCR反應體系(總體積20 μ L):
2 X Taq Master Mix (反應緩沖液)10 μ L
10 μ M上游引物0.5 yL
10 μ M下游引物0.5 yL
模板 DNAI μ L ；
ddH20補至 20 μ L0
[0015]其中，2XTaq Master Mix (反應緩沖液)的組分為Taq DNA聚合酶，160 mMTris-HCl, 40 mM(NH4)2SO4, 3.0 mM MgCl2,400 μ M dNTP。
[0016]PCR 反應程序為:94°C 5 min ；94°C 30 s，53°C 45 s，72°C 90 s，32 個循環(huán)；72°C10 min。
[0017]本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明公開了家蠶微孢子蟲Met_AP2基因及其在微孢子蟲檢測方面的應用，大量實驗結(jié)果顯示，根據(jù)該基因設計合適的引物，既能夠通用的檢測多種微孢子蟲，又具有很好的檢測靈敏性，是一個微孢子蟲通用檢測的良好靶點，對于其他昆蟲來源的微粒子病病原檢測有現(xiàn)實意義。
[0018]本發(fā)明還提供了一組微孢子蟲通用檢測引物，是根據(jù)家蠶微孢子蟲Met_AP2基因序列設計的引物，該引物用于多種微孢子蟲病的PCR檢測，具有很好的通用性和靈敏性，能夠通用的檢測多種微孢子蟲，尤其是對多種桑園主要微孢子蟲，如家蠶微孢子蟲、桑螟微孢子蟲、桑尺蠖微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、小菜蛾微孢子蟲、菜粉蝶微孢子蟲或柞蠶微孢子蟲等，在微孢子蟲的實際檢測應用中具有廣泛的應用價值和意義。
[0019]另外，本發(fā)明引物及相關試劑可組裝成試劑盒，使用方便，節(jié)省時間，當樣品被家蠶微孢子蟲、桑螟微孢子蟲、桑尺蠖微孢子蟲、斜紋夜蛾微孢子蟲、小菜蛾微孢子蟲、菜粉蝶微孢子蟲或柞蠶微孢子蟲等中的一種或幾種感染時，都能夠檢測出陽性結(jié)果，對樣品的篩選更加準確，不會出現(xiàn)漏檢。
【附圖說明】
[0020]圖1 為 2047-F/2047-R、MC-F/MC-R、M6-F/M6-R、M7-F/M7-R 四對引物的設計簡圖。
[0021]圖2為Met_AP2基因編碼蛋白的同源性比對結(jié)果。
[0022]圖3為引物MC-F/MC-R的特異性檢測結(jié)果，1.浙江小孢子微孢子蟲、2.玉米螟微孢子蟲、3.桑螟微孢子蟲、4.菜粉蝶微孢子蟲、5.小菜蛾微孢子蟲、6.斜紋夜蛾微孢子蟲、7.桑尺蠖微孢子蟲、8.柞蠶微孢子蟲、9.家蠶微孢子蟲、10.家蠶中腸、ll.ddH20、M.DL2000Maker。
[0023]圖4為引物2047-F/2047-R的特異性檢測結(jié)果，1.桑螟微孢子蟲、2.玉米螟微孢子蟲、3.桑尺蠖微孢子蟲、4.斜紋夜蛾微孢子蟲、5.小菜蛾微孢子蟲、6.菜粉蝶微孢子蟲、7.浙江小孢子微孢子蟲、8.山東大孢子微孢子蟲、9.昨蠶微孢子蟲、10.家蠶微孢子蟲、11.家蠶中腸、12.ddH20、M.DL1000 Maker。
[0024]圖5為引物M5-F/M5-R和M6-F/M6-R的特異性檢測結(jié)果，I?12為引物M5-F/M5-R的特異性檢測結(jié)果，13?24為引物M6-F/M6-R的特異性檢測結(jié)果；1/13.桑螟微孢子蟲、2/14.玉米螟微孢子蟲、3/15.桑尺蠖微孢子蟲、4/16.斜紋夜蛾微孢子蟲、5/17.小菜蛾微孢子蟲、6/18.菜粉蝶微孢子蟲、7/19.浙江小孢子微孢子蟲、8/20.山東大孢子微孢子蟲、9/21.柞蠶微孢子蟲、10/22.家蠶微孢子蟲、11/23.家蠶中腸、12/24.ddH20、M.DL1000Maker。
[0025]圖6為引物M7-F/M7-R的特異性檢測結(jié)果，1.桑螟微孢子蟲、2.玉米螟微孢子蟲、
3.桑尺蠖微孢子蟲、4.斜紋夜蛾微孢子蟲、5.小菜蛾微孢子蟲、6.菜粉蝶微孢子蟲、7.浙江小孢子微孢子蟲、8.山東大孢子微孢子蟲、9.昨蠶微孢子蟲、10.家蠶微孢子蟲、11.家蠶中腸、12.ddH20、M.DLlOOO Maker。
[0026]圖7為引物MC-F/MC-R對家蠶微孢子蟲的靈敏性檢測結(jié)果，I?8分別為1.85 X 11U.85 X 10'1.85X ΙΟ'Ι.85X 10_2、1.85Χ 10_3、1.85Χ 10_4、1.85Χ 10_5、1.85Χ 1(Γ6 μ g/mL 的家蠶微孢子蟲 DNA, M 為 DLlOOO Maker。
[0027]圖8為引物MC-F/MC-R對斜紋夜蛾微孢子蟲的靈敏性檢測結(jié)果，I?8分別為 1.21 X 11U.21Χ100、1.21 X 10'1.21 X 10'1.21 X 10'1.21 X 10'1.21X10'L 21 X I(Γ6 μ g/mL的斜紋夜蛾微孢子蟲DNA, M為DLlOOO Maker。
[0028]圖9為引物MC-F/MC-R對桑尺蠖微孢子蟲的靈敏性檢測結(jié)果，I?8分別為 1.64 X 11U.64 X 10。、1.64 X 10'1.64 X 10'1.64 X 10'1.64 X 10'1.64 X 10'
1.64X I(T6 μ g/mL 的